功能性核酸分子的构建方法和该方法中使用的核酸组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段，在细胞内使官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子。
【专利说明】功能性核酸分子的构建方法和该方法中使用的核酸组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及在细胞内构建功能性核酸分子的新方法以及该方法中使用的核酸组合物。
【背景技术】
[0002]人们所知道的是，在核酸分子中，存在着尽管不编码蛋白质，但是在各种生命现象中起着重要作用的物质。作为这种核酸分子，可以列举，例如功能性的非编码RNA分子(非专利文献I)、和引起RNA干扰作用的小分子RNA(非专利文献2)等。
[0003]例如，RNA干扰作用，作为在细胞内，特异性地抑制目的RNA的作用的重要技术(非专利文献3)，原先作为试剂，现在作为药物的应用(非专利文献4)也被积极地进行研究。
[0004]现有技术文献
[0005]非专利文献
[0006]非专利文献1:Ryan J Taft, Ken C Pang, Timothy R Mercer, Marcel Dingerl andJohn S Mattick, J Pathol., 2010, 220, 126-139.
[0007]非专利文献2:Fire A, XuS, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C ；Nature, 1998, 391, 80 6-11.
[0008]非专利文献3: Sayda M.Elbashir, Javier Martinez, AgnieszkaPatkan1wska, Winfried Lendeckel and Thomas Tuschl ；EMB0 J.2001, 20, 6877-6888.
[0009]非专利文献4:John C.Burnett, John J.Rossi and Katrin Tiemann ；B1technol.J.2011，6，1130-1146.
【发明内容】
[0010]发明要解决的问题
[0011]尽管引起RNA干扰作用的RNA是小分子，但为了最大限度诱导其效果，存在着使其细胞膜透过性进一步提高的需求，以及抑制由于活化免疫系统导致的毒性表达的进一步的需求。
[0012]然而，面对这样的需求，目前的现状只不过是，为了使RNA分子成为更小的分子，而努力引入发挥其功能所需要的最小限度的序列。
[0013]本发明正是鉴于上述问题而产生的，本发明的目的在于提供以容易进入细胞的形态将功能性核酸分子导入到细胞内，构建细胞内的功能性核酸分子的方法等。
[0014]用于解决问题的手段
[0015]为了解决上述问题，本发明提供一种由I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，该方法包括:在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的工序，和在上述细胞内使上述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
[0016]本发明还提供一种功能性核酸分子的构建用核酸组合物，该组合物是上述方法中使用的核酸组合物，其具有构成功能性核酸分子的上述核酸链，且该核酸链中的至少一条含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段。
[0017]发明的效果
[0018]功能性核酸分子，作为容易进入细胞的多个片段导入到细胞内，能够构建出在细胞内的功能性核酸分子。
【专利附图】
【附图说明】
[0019][图1]是表示本发明所涉及方法的一个实施方式的概要图。
[0020][图2]是表示实施例中使用的各种RNA的序列的图。
[0021][图3]是表示实施例中体外连结(ligat1n)结果的图。
[0022][图4]是表示实施例中荧光素酶基因表达结果的图。
[0023][图5]是表示实施例中荧光素酶基因表达结果的图。
[0024][图6]是表示实施例中免疫应答测定结果的图。
【具体实施方式】
[0025]〔1.功能性核酸分子的构建方法〕
[0026](构建方法的概要)
[0027]本发明所涉及的功能性核酸分子的构建方法是由I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，其包括以下的工序I)和2)。
[0028]I)在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的工序、
[0029]2)在上述细胞内使上述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
[0030]也就是说，本发明所涉及的功能性核酸分子的构建方法是I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，其包括以下的工序I)和2):
[0031]I)将上述核酸链中的至少I条制成在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段、并且将上述I条或2条核酸链(即，至少I条制成两个以上的片段)导入到细胞内的导入工序、
[0032]2)在上述细胞内使上述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
[0033]上述的构建方法，将构成功能性核酸分子的核酸链的至少一部分制成多个片段，再导入到细胞中，构建出细胞内的功能性核酸分子。因此，功能性核酸分子向细胞内的吸收得以提高。而且，由于核酸链的至少一部分作为更小的片段来使用，因此能够抑制由于功能性核酸分子而引起的免疫毒性。
[0034](功能性核酸分子)
[0035]本发明中所谓功能性核酸分子，是指多个核酸以链状连结(即，寡或多核苷酸)、不编码蛋白质，且对发育分化等生命现象发挥指定功能的核酸分子。因此，在生命现象中不发挥特别功能，只与目标特异性杂交的引物和探针被排除在本发明的功能性核酸分子的范畴之外。
[0036]功能性核酸分子是DNA分子、RNA分子、或DNA-RNA杂交分子。功能性核酸分子可以由I条核酸链构成，也可以由2条核酸链构成。而且，功能性核酸分子的一部分可以含有非天然的核酸。而且，在本说明书中，用语“核酸链”，是指构成功能性核酸分子的状态下的全长核酸链，与相当于比该“核酸链”更短的链的用语“片段”(后述)相区别。
[0037]作为上述DNA分子,可以列举,例如DNA适体(aptamer) ；CpG motif ;DNAzyme等。而且，本说明书中，基础为DNA链，一部分导入了 RNA和/或非天然核酸等的也被分类为DNA分子。
[0038]作为上述RNA分子,可以列举,例如RNA适体(aptamer) ;shRNA、siRNA和microRNA等显不出RNA干扰作用的RNA分子(RNAi用核酸分子)；反义RNA分子；核酶RNA等。而且，本说明书中，基础为RNA链，一部分导入了 DNA和/或非天然核酸等的物质也被分类为RNA分子。
[0039]作为DNA-RNA杂交分子,可以列举,例如DNA-RNA杂交适体(hybrid aptamer)等。
[0040]功能性核酸分子优选:为发挥其功能而形成在上述核酸链内杂交、或在不同的核酸链间发生杂交而成的杂交区域。其理由也参见后述栏(核酸链片段的优选设计例)中的记载。
[0041]功能性核酸分子更优选:具有在核酸链内或在不同的核酸链间杂交而形成的杂交区域的RNAi用核酸分子，进一步优选由两条核酸链构成的RNAi用核酸分子。由两条核酸链构成的RNAi用核酸分子的核酸链长度(mer)为例如15~40mer,优选为15~35mer,更优选为20~35mer。
[0042](核酸链的片段)
[0043]构成功能性核酸分子的核酸链的所谓“片段”，相当于将上述“核酸链”分割成2个以上的核酸分子。而且，一旦以合适的顺序将来自于一条核酸链的所有“片段”连结，就构建出具有与该核酸链相同核酸序列的核酸分子。但是，用语“片段”并非是指一旦构建核酸链后就将其切断，生成该片段。
[0044]在通过结合片段而构建构成功能性核酸分子的核酸链时，使不同的片段之间的3’末端与5’末端相互结合。此时，将要使之相互结合的3’末端和5’末端的组合称之为“对应末端”。也就是说，所谓“对应末端”是按构成作为片段的设计基础的核酸链那样将片段排列时邻接的末端。
[0045]需要说明的是，来自于一条核酸链的“片段”的长度虽没有特别限制，但有时优选不同片段间的长度(mer)差异不要显著过大。按照这个观点，相对于来自一条核酸链的最长的“片段”，剩余的所有片段优选为〔25% X最长片段的长度(mer)〕以上的长度，更优选为〔30% X最长片段的长度(mer)〕以上的长度。
[0046]通过化学反应相互结合的官能团对(官能团的组合)被结合到上述“对应末端”中通过这些官能团之间相互反应而将片段之间结合，从而构成核酸链。
[0047]上述官能团对虽没有特别的限定，但优选，例如亲电子基团和亲核基团的组合。也就是说，使上述“对应末端”之一与亲电子基团结合，使亲核基团结合到另一个“对应末端”，不同的片段之间通过化学反应将会相互结合。而且，还可以使亲电子基团和亲核基团结合在3’末端和5’末端中的任何之一上。即，可以将亲电子基团结合在3’末端上，而将亲核基团结合在5’末端上，或者也可以将亲电子基团结合在5’末端上，而将亲核基团结合在3’末端上。
[0048]作为上述的亲电子基团，虽没有特别的限定，但可以列举碘乙酰基(参考文献:B1conjugate, Chem.2008, 19, 327)和漠乙酸基(参考文献:Nucleic AcidsRes.，22，5076)等卤代烷基；碘基(参考文献 tetrahedron Lett.，1995，38，55959)和溴基等卤素基；甲酰基等。在一个实施方式中，存在亲电子基团优选是碘乙酰基、溴乙酰基或碘基的情况。
[0049]作为上述的亲核基团，虽没有特别的限定，但可以列举硫代磷酸酯基；巯基；羟基；氣基；甲硫基等烷基硫基；甲氧基等烷氧基等。在一个实施方式中，存在未核基团优选为硫代磷酸酯基的情况。
[0050]此外，构成官能团对的上述亲电子基团和上述亲核基团的组合虽没有特别限定，但存在优选为卤代烷基或卤素基与硫代磷酸酯基的组合，或卤代烷基或卤素基与巯基的组合等情况。而且，在一个实施方式中，存在构成官能团对的上述亲电子基团和上述亲核基团的组合更优选为碘乙酰基、溴乙酰基、或碘基与硫代磷酸酯基的组合的情况。
[0051]以下显示了添加在对应末端上的上述亲电子基团与上述亲核基团的优选的组合中的一个例子和这些基团通过化学反应而相互连结的方式。而且，化学式中，糖仅示出了骨架部分，既可以是核糖也可以是脱氧核糖。此外，化学式中的B表示构成核酸的各种碱基。也就是说，在以下的例子中，虽然示出了功能性核酸分子为RNA分子的情况，但是即使是DNA分子也可以以同样方式构成。
[0052][化学式I]
[0053](A) 3 ’末端-硫代磷酸酯基+5 ’末端-碘乙酰基
[0054]
【权利要求】
1.由I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，其包括: 在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的导入工序，以及 在所述细胞内使所述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由I条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述功能性核酸分子具有在所述核酸链内杂交、或在不同的核酸链间杂交而形成的杂交区域， 所述片段被设计成所述片段之间的所述结合发生在所述杂交区域。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述功能性核酸分子由第一核酸链和第二核酸链这两条所述核酸链构成，而且具有在不同的核酸链间杂交而形成的所述杂交区域， 所述两条核酸链均作为在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个片段被导入到细胞内， 构成所述第一核酸链的片段之间的所述结合和构成所述第二核酸链的片段之间的所述结合发生在所述杂交区域的不同位置。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述功能性核酸分子由作为所述第一核酸链的第一 RNA链和作为所述第二核酸链的第二 RNA链构成， 所述第一 RNA链作为在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第一片段和第二片段被导入到细胞内， 所述第二 RNA链作为在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第三片段和第四片段被导入到细胞内， 所述第一片段或第二片段可与所述第三片段和第四片段这二者杂交，所述第三片段或第四片段可与所述第一片段和第二片段这二者杂交。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述功能性核酸分子在细胞内具有RNA干扰作用。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法，其中，所述通过化学反应将会相互结合的官能团对是亲电子基团和被保护基保护的亲核基团的组合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述亲核基团是硫代磷酸酯基。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述亲电子基团是碘乙酰基、溴乙酰基或碘基。
9.根据权利要求6~8中任一项所述的方法，其中，所述保护基通过所述细胞中的内源性物质或光照射而脱离。
10.根据权利要求6、8或9所述的方法，其中，当所述亲核基团为硫代磷酸酯基时，所述保护基为下述(a)~(k)中的任意一种，
在所述式中，R、R’和R”表示取代或非取代的烷基或芳基， R1和R2彼此独立地表示氢原子或碳数为I~4的烷基， η表示I~3的整数， 当η为2或3时，具有的η个R1任选彼此不同，具有的η个R2任选彼此不同， (a)、(b)、(e)、(g)、(h)、⑴、(j)、和(k)中的苯环上的多个氢原子彼此独立地任选被取代基取代。
11.功能性核酸分子构建用核酸组合物，其是权利要求1~10中任一项所述的方法中使用的核酸组合物，其具有构成功能性核酸分子的所述核酸链，该核酸链中的至少I条含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上的片段。
12.根据权利要求11所述的核酸组合物，其中，所述功能性核酸分子具有在所述核酸链内杂交、或在不同的核酸链间杂交而形成的杂交区域， 所述片段被设计成所述片段之间的所述结合发生在所述杂交区域。
13.根据权利要求12所述的核酸组合物，其具有构成所述功能性核酸分子且能够杂交的第一核酸链和第二核酸链这样的两条所述核酸链，其中， 所述两条核酸链均含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个片段， 所述片段被设计成构成所述第一核酸链的片段之间的所述结合和构成所述第二核酸链的片段之间的所述结合发生在所述杂交区域的不同位置。
14.根据权利要求13所述的核酸组合物，其具有构成所述功能性核酸分子的作为所述第一核酸链的第一 RNA链和作为所述第二核酸链的第二 RNA链，其中， 所述第一 RNA链含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第一片段和第二片段， 所述第二 RNA链含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第三片段和第四片段， 所述第一片段或第二片段可与所述第三片段和第四片段这二者杂交，所述第三片段或第四片段可与所述第一片段和第二片段这二者杂交。
【文档编号】C12N15/113GK104169422SQ201380012229
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年3月1日 优先权日:2012年3月2日
【发明者】阿部洋, 伊藤嘉浩, 丸山豪斗 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构