用于诊断肺癌侵袭性和遗传不稳定性的标记的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于从患者的肺癌样本来诊断在所述患者中肺癌侵袭性的方法，包括：a)体外检测DNA复制应力标记的表达谱，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因；以及任选地RAD51；b)将所述表达谱与参考表达谱进行比较；以及d)从所述比较中诊断癌的侵袭性。还描述了专用微阵列和试剂盒，以及选择或调整合适治疗的方法。
【专利说明】用于诊断肺癌侵袭性和遗传不稳定性的标记
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肺癌管理领域，包括诊断所述癌的侵袭性和选择合适的治疗。本发明 基于以下发现：过表达的标记，包括⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因，以及任选地RAD51基 因，与肿瘤的侵袭性高度相关，因此与患者的生存高度相关。
【背景技术】
[0002] 癌症是多元的疾病，其中一组细胞显示出不受控的增长、侵入并摧毁相邻组织的 浸润，并且有时经由淋巴或血液转移或扩散至身体的其它部位。癌的这三种恶性性质将其 与不浸润或转移的良性肿瘤区分开来。
[0003] 肺癌-主要为非小细胞肺癌（NSCLC)-是全世界癌症死亡的首要原因，其导致每年 约100万人死亡。尤其是对于不吸烟的女性，它的发病率上升。虽然在预防、筛查、切除方 法和化学疗法方案上的进步，只有约15%的患者存活5年以上。
[0004] 对于患者，选择合适的治疗至关重要。有必要知道什么时候立刻使用剧烈的积极 治疗操作以防止侵袭性癌的扩散。相反地，当患者所携带的肿瘤没有必要的时候进行剧烈 的积极治疗，对于患者也是不利的。事实上，剧烈的积极治疗常常导致不利的毒性，可能严 重影响患者的生活质量。此外，这种剧烈的积极治疗通常非常昂贵，因此仅应在必须时才进 行。
[0005] 目前，对实体瘤的治疗选择基于肿瘤分期（staging)，其通常使用来自美国癌症联 合委员会（AJCC)的肿瘤/结节/转移（TNM)测试进行。TNM系统基于三种类别分配一个数 字。"T"表示肿瘤大小，"N"表示淋巴结参与的程度，以及"M"表示转移程度。癌症更宽 的分期通常被引作数字I、II、III、IV，其源自根据预后分组的--Μ值；更高的数字代表更多 进展的癌症和可能更坏的结果。
[0006] 在患者诊断患有实体癌的分期中，尽管此测试和分期系统提供了一些关于分期的 有价值信息，通常认为其不精确和不充分。特别是，其不能鉴定肿瘤进展的最早期。另外， --Μ测试不能给出肿瘤侵袭性的信息，因而其对预后的用处受到限制。根据临床医师和病理 学家，因此目前的临床分期"肿瘤结节转移"（TNM)系统对于预测患者的结局不充分。
[0007] 真正需要更好的癌症预后测试，其不仅仅改善患者的全面生存，还改善了他们的 生活质量，并且使真正能从积极的高花费化学疗法受益的患者坚持该化学疗法。特别是，需 要能够可靠地用于肺癌预后的新的强大预后标志物。
[0008] 在试图鉴定患者预后和对治疗反应的预测因子（predicator)中，许多描述在肺 癌中基因表达的研究已经完成或正在进行中。到目前为止，这些遗传测试为标准预测方法 添加了适度的预后信息。事实上，这些多基因标记大多获自数以千计基因的基于无偏倚微 阵列分析的筛选，因此大多数包括"终点"选择的细胞增殖相关基因，即在肿瘤发生的最后 阶段驱动细胞周期进展或肿瘤分化的基因。然而，后两者的这些特征已经通过标准的临床 病理标志物，如组织学分级、有丝分裂计数、Ki67指数等得以评估，所述临床病理标志物也 捕获增殖状态。
[0009] 由于常规的临床分期分类不足以预测患有肺癌患者的生存，需要额外的预后因素 以更好地预测其结局。本发明人已经表明，DNA复制应力（stress)标记是癌症生存的预测 因子。
【发明内容】
[0010] 本发明已经鉴定出DNA复制应力标记，并已经显示这种标记与肺癌中的不良预后 相关。更具体地，一组基因，其包括⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ，在肺癌中过表达，并且这种 过表达给出关于患者预后的信息。例如，在93类肺癌的大多数中发现这四个基因过表达。 不管进行何种生存期检查（总体生存、无复发生存、无疾病生存），这种过表达都与患者生 存相关。明显地，在这4个基因标记和患者生存之间的统计学相关不依赖于肿瘤分期和治 疗，当在这种标记包括RAD51时这种相关性甚至更好。
[0011] 因此，本发明提供用于诊断在患者中肺癌侵袭性的DNA复制应力基因标记，所述 标记包括⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因。有利地，所述标记进一步包括RAD51基因。在 优选的实施方案中，所述标记由⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因组成。在另一优选的实施 方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1、P0LQ和RAD51基因组成。
[0012] 在另一方面，本发明还涉及用于诊断患者中肺癌侵袭性的方法。根据本发明的方 法，DNA复制应力基因标记的基因升高的表达水平说明所述癌症的侵袭性。
[0013] 因此，本发明提供一种用于诊断患者中肺癌的侵袭性的方法，其包括以下步骤：
[0014] a)从所述患者的生物样本中检测DNA复制应力基因标记的表达谱,所述标记包括 CDC6、CLASPIN、PLK1 和 P0LQ 基因；
[0015] b)将步骤a)的表达谱与至少一种参考表达谱进行比较；以及
[0016] c)从所述比较中诊断肺癌的侵袭性或非侵袭性。
[0017] 在本发明方法的优选实施方案中，所述标记进一步包括RAD51基因。在本发明方 法的另一优选实施方案中，所述标记由⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因组成。在一个甚至 更优选的实施方案中，所述标记由〇^6、0^5?預、？0(1、？01^和狀051基因组成。
[0018] 如本文所用，术语"癌"和"癌性的"指或描述哺乳动物中通常以失控的细胞生长为 特征的病理状态。本文使用的术语"癌"和"癌性的"意为包括该疾病的所有分期。因此， 本文所用的"癌"可包括良性和恶性肿瘤两者。
[0019] 根据本发明的"肺癌"是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。优选地，本发明的肺癌是非 小细胞肺癌（NSCLC)。更优选地，本发明的NSCLC选自：鳞状细胞癌、大细胞癌、腺癌、多形 性癌、类癌瘤和未分类的肺癌。最优选地，NSCLC是鳞状细胞癌、大细胞癌或腺癌。
[0020] 如本文所用，术语"P0LQ"指编码DNA聚合酶Θ的人类基因（Entrez基因 ID号： 10721;mRNA 序列参照号：NM_199420. 3;蛋白序列参照号：NP_955452. 3);术语"PLK1" 指编码polo样激酶1的人类基因（mRNA序列参考号：NM_005030 ;蛋白序列参考号： NP_005021.2);术语"CLASPIN"指编码Chkl的调节因子的人类基因，所述基因也被指定 为CLSPN(mRNA序列参考号：NM_001190481. 1 ;蛋白序列参考号：NP_001177410. 1);术语 "CDC6"指编码复制起始所需蛋白的人类基因（mRNA序列参考号：NM_001254. 3 ;蛋白序列参 考号：NP_001245. 1);以及术语"RAD51"指编码协助修复DNA双链断裂的蛋白的人类基因 (mRNA序列参考号：NM_002875 ;蛋白序列参考号：NP_002866)。
[0021] 此外，本发明包括所述基因的所有同种型。如此处所用的同种型，涉及所述基因的 所有不同形式，并可能由突变产生，或可通过可变剪接由相同基因产生。很多同种型由单核 苷酸多态性或SNP、相同基因的等位基因间小的遗传差别所引起。这些发生在基因内特定 个别核苷酸位点上。在此定义中也包括通过采用不同的启动子从相同基因产生不同版本的 信使RNA的情况，其导致转录跳过某些外显子。因而，应当理解本发明的方法不局限于所述 ⑶C6、CLASPIN、PLK1、P0LQ和RAD51本身，也包含一个或几个所述基因中的一个或几个同种 型。根据本发明的方法，测量所述基因和/或其一个或几个同种型的表达水平并确定表达 谱。
[0022] 根据本发明，肺癌的"侵袭性"意欲指所述肺癌浸润相邻组织并发生转移的倾向以 及所述浸润可能出现的速度。
[0023] 根据本发明的方法，当步骤a)的表达谱与步骤b)的至少一种参考表达谱不相同 时，那么癌为侵袭性的。例如，假如步骤b)的所述参考谱获自健康、非癌性的样本，如果步 骤a)的所述表达谱与步骤b)的所述参考表达谱相比是升高的，那么癌为侵袭性的。换言 之，假如，例如步骤b)的所述参考谱获自健康、非癌性样本，如果在来自受测试的患者的样 本中本发明标记的基因比在健康、非癌性的、参考样本中表达更多，那么癌为侵袭性的。
[0024] 肺癌的侵袭性与生存明显相关，可以使用上述方法预后患者的生存，其中诊断为 侵袭性的病例导致不好的生存预后，而诊断为缺乏侵袭性则产生良好的生存预后。
[0025] 因此，本发明还涉及一种用于评估患肺癌的患者生存方法，其包括以下步骤：
[0026] a)从所述患者的生物样本中检测DNA复制应力基因标记的表达谱,所述标记包括 CDC6、CLASPIN、PLK1 和 P0LQ 基因；
[0027] b)将步骤a)的表达谱与至少一种参考表达谱进行比较；以及
[0028] c)从所述比较中评价所述患者的生存预后。
[0029] 在本发明方法的优选实施方案中，所述标记进一步包括RAD51基因。在本发明方 法的另一优选实施方案中，所述标记由⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因组成。在一个甚至 更优选的实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1、P0LQ和RAD51基因组成。
[0030] "表达谱"意为DNA复制应力标记的基因，包括⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ，以及 任选地RAD51的表达水平。在优选实施方案中，所述表达谱由⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ 基因组成，因为这些基因的表达模式已经被证明对于评估所述肺癌的肺癌侵袭性是特别相 关的。在最优选实施方案中，如果所述肺癌是侵袭性的，那么所述用于诊断的表达谱还包括 RAD51基因。
[0031] 可以通过由本领域技术人员已知的任何技术来确定根据本发明的表达谱。优选 地，确定根据本发明的表达谱涉及测量每个DNA复制应力标记基因的表达水平。特别地，可 以在基因组和/或核酸和/或蛋白水平测量每个基因的表达水平。在优选的实施方案中， 通过测量各基因的核酸转录物的量来确定表达谱。在另一个实施方案中，通过测量每个基 因所产生的蛋白质的量来确定表达谱。
[0032] 由于将获得的表达谱与在步骤（b)中的至少一种参考表达谱相比较，得以进行肺 癌侵袭性的诊断。
[0033] "参考表达谱"是获自参考样本的预先确定的表达谱。优选地，通过测量在所述参 考样本中每个所述标记基因的表达水平来获得所述参考表达谱。根据本发明的"参考样本" 是与特定结局分类相关的生物样本。在一个实施方案中，可以从与不良生存结局相关的参 考样本获得参考表达谱。例如，这样的参考样本可以由在一个特定的、容易鉴定分期的癌性 组织所制成。在另一个实施方案中，参考表达谱可以获自与良好生存结局相关的参考样本。 这种与良好生存结局相关的生物样本的一个实例是由健康、非癌性肺组织所制成的生物样 本。所述健康、非癌肺组织的组成可以仅有一个受试者的健康肺组织，或者可以是由几个受 验者的健康肺组织制成的合并样本。当样本仅由一个受试者的健康肺组织制成时，所述受 试者可以是受测试的患者或另一受试者。有利地，从待诊断的肺癌患者中获得所述生物样 本。事实上，如上所述，甚至在癌患者中肺组织仍然包含非肿瘤的健康组织。特别地，当肺 癌样本取自手术切除治疗时，待诊断患者的相邻的、非肿瘤的、健康的肺组织通常是可获得 的并且可用作健康对照样本。在这种情况下，在受测试的癌生物样本和参考健康样本之间 在基因表达上所观察到的变化可主要归因于肺癌，而不是人与人之间和/或组织之间在基 因表达上的变化。
[0034] 使用待测患者的癌样本来进行上述方法。在一些情况中，根据本发明的方法可进 一步包括从患者获取癌样本的预备步骤。通过"癌样本"或"肺癌样本"，是指肺肿瘤样本。 甚至在癌性患者中，肿瘤位点的肺组织也包括非肿瘤的健康组织。因而，"癌样本"应当被限 定于取自患者的肿瘤组织。所述"癌样本"可以是活检肺样本或取自患者的手术切除治疗 的肺样本。
[0035] 另外，根据本发明的方法，在从患者取得样本和如上述限定的步骤a)之间可以包 括另一预备步骤，其对应于将癌样本（以及任选地健康的组织样本）转化成mRNA(或相应 的cDNA)样本或转化成蛋白质样本，随后其可备用于步骤a)中的体外测量基因表达水平。 从组织样本中制备或提取mRNA(以及逆转录为cDNA)或蛋白质仅是本领域技术人员公知的 常规程序。
[0036] 一旦获得了即用的癌mRNA(或相应的cDNA)或蛋白质样本，可进行标记基因表达 水平的测量，所述标记基因包括或由⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ、以及任选地RAD51所组 成，这取决于转化和可获得的即用样本的类型，是在mRNA水平（即，基于样本中mRNA的含 量）还是在蛋白质水平（即，基于样本中蛋白质的含量）。在某些实施方案中，可以在mRNA 水平测量一些基因的表达水平，而在蛋白质的水平测量其它基因的表达水平。在这个情况 中，取自患者的癌样本的一部分被转化为mRNA (或相应的cDNA)样本而另一部分被转化成 蛋白质样本。在其它实施方案中，在mRNA水平测量或在蛋白质水平测量所有受测试的基因 的表达水平。
[0037] 用于定量mRNA的方法是本领域公知的。事实上，当在mRNA水平测量表达水平时， 显著地可以使用公知的技术进行，例如定量PCR或核酸微阵列技术（包括cDNA和寡核苷酸 微阵列）。这些技术现在已被本领域技术人员常规使用，因此不需要在此详细地描述。使 用定量PCR的实施方案的实施例在实验部分描述。可选地，可以使用任何已知或未来技术 以便基于mRNA含量来评估基因表达水平。例如，可以使用原位杂交中偶联荧光的组织微阵 列。组织微阵列（也称为TMA)由石蜡块组成，其中多达1000个独立的组织核以阵列形式 组装以便允许多重组织学分析。在组织微阵列技术中，使用空心针从石蜡包埋的组织（如 临床活检或肿瘤样本）的目标区域取出直径小如〇.6mm的组织核。然后将这些组织核以精 确的空间阵列模式插入受体石蜡包块中。使用切片机对所述包块切片，安装于显微镜玻片 上，然后通过任何标准组织学分析的方法进行分析。每个微阵列包块可被切为100-500个 切片，其可用于独立测试。在组织微阵列中通常采用的测试包括免疫组织化学和荧光原位 杂交。对于在mRNA水平的分析，可以将组织微阵列技术偶联荧光原位杂交。
[0038] 当在蛋白质水平测量表达水平时，尤其可以使用特异性抗体来进行测量，具体地 使用公知的技术，如western印迹、ELISA或ELISP0T、抗体微阵列、或偶联免疫组织化学 的组织微阵列。其它合适的技术包括FRET或BRET，使用单个或多个激发波长的单细胞显 微或组织化学方法，和采用任意合适的光学方法，例如电化学方法（伏安法和电流分析法 技术），原子力显微镜和无线电频率方法，例如共焦和非共焦的多极共振光谱法，荧光检 测、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射或折射率（例如，表面等离子体共振、 椭圆对称、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉量度分析法）、细胞ELISA、流式细胞术、放 射性同位素、磁共振成像、通过质谱分析法（MS)的分析、串联质谱分析法（MS-MS)、MS 3 ; 基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间（MALDI-T0F)质谱分析法；聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) ;HPLC-质谱分析法；液相色谱/质谱分析法/质谱分析法（LC-MS/MS)。所有这 些技术都是本领域公知的，不需要在此进一步详述。
[0039] 将受测试的患者的表达谱与参考表达谱进行比较允许确定所述表达谱是否相似 或不同。本领域技术人员将理解这种比较将取决于所使用的参考样本。例如，如果参考样 本由获自已知具有不良预后的受试者的癌性肺组织所制成，并且在表达谱上具有不同（例 如，较低的表达水平），那么受测试的肺癌可被诊断为非侵袭性的，受测试的患者可被预后 或分类为良好生存组。同样，如果在那种情况下表达谱是相似的，那么受测试的癌可被诊断 为侵袭性的，患者预后或分类为不良生存组。在另一方面，如果参考样本由健康组织所制 成，并且在表达谱上具有不同（例如，较高的表达水平），那么受测试的癌可被诊断为侵袭 性的，受测试的患者预后或分类为不良生存组；然而，如果在表达谱中没有不同，那么受测 试的癌可被诊断为非侵袭性的，受测试的患者预后为良好生存组。
[0040] 本文所用的术语"差异性表达的"或"差异表达"指在本发明的基因表达水平中的 差异，其可通过测量所述基因产物的表达水平来进行分析，例如，所述基因表达的信使RNA 转录物水平或表达的蛋白质水平中的差异。在优选的实施方案中，所述差异是统计学上显 著的。术语"表达水平中的差异"是指给定基因的可测量的表达水平中的增加或减少，其通 过将在测试样本中信使RNA转录物的量和/或蛋白质的量与参考样本中给定基因的可测量 表达水平进行比较来测量。本文所用的术语"在表达中的相似性"意思是在测试样本和对 照或参考谱之间的生物标志物的表达水平上没有差别或有微小的差别。例如，相似性可以 指与对照相比成倍的差异。在优选的实施方案中，在生物标志物的表达水平中没有统计学 上显著的差异。
[0041] 可以以多种方式来进行表达谱的比较。可使用统计分析。例如，可使用目的在于 提取成分的PLS回归（偏最小二乘法）来进行比较，其是解释变量（基因）的线性组合以 便为可变响应建模（例如，如果为非侵袭性，则为〇 ;如果为侵袭性，则为1)。PLS回归分析 特别关系在小参考样本的情况下给出预测。也可以使用支持向量机（SVM)、逻辑回归、线性 判别分析、随机森林、k-NN(k = 3、4、5、6)或PAM(微阵列预测分析）统计方法进行比较。优 选为Fisher的线性判别分析。
[0042] 优选地，对于每个标记基因通过计算在测试生物样本中的表达水平和参考样本中 的表达水平之间表达水平比来进行表达谱的比较，所述标记基因包括或由⑶C6、CLASPIN、 PLK1和POLQ、以及任选地RAD51所组成。
[0043] 然后，通过将所获得的表达水平比与相应阈值进行比较可以获得所述肺癌侵袭性 的诊断。
[0044] 因此，本发明提供一种用于诊断患者中肺癌的侵袭性的方法，其包括以下步骤：
[0045] a)在所述患者的生物样本中针对DNA复制应力基因标记的每个基因测量表达水 平，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因；
[0046] b)在所述患者的参考样本中针对DNA复制应力基因标记的每个所述基因测量表 达水平；
[0047] c)针对DNA复制应力基因标记的每个基因计算在测试生物样本中的表达水平和 参考样本中的表达水平之间的表达水平比；以及
[0048] d)通过将获得的表达水平比与相应的阈值进行比较来诊断肺癌的侵袭性或非侵 袭性。
[0049] 在本发明方法的优选实施方案中，所述标记进一步包括RAD51基因。在本发明方 法的另一优选实施方案中，所述标记由⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因组成。在一个甚至 更优选的实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1、P0LQ和RAD51基因组成。
[0050] 因此，当参考样本由健康组织制成时，如果每个基因的比高于其对应阈值，或者当 参考样本由癌性肺组织制成时，如果这些基因中每个的比低于其对应阈值，则诊断肺癌为 侵袭性的。如上所述，有利地使用来自受测试的患者的健康肺组织所制成的参考样本。在 这种具体实施方案中，如果每个所述基因的比高于阈值，则诊断肺癌为侵袭性的。
[0051] 在一些实施方案中，本发明的方法在计算表达水平比之前，还包括将所述标记基 因的表达水平对于一个或更多个对照基因的表达水平进行归一化的步骤。根据本发明的 "对照基因"是在所有细胞类型中表达的基因。更特别地，根据本发明的对照基因是在肺 的所有细胞中表达的基因。在另一方面，对照基因的表达水平不受细胞状态影响，即，在健 康肺细胞和癌性肺细胞中对照基因表达为相同的水平。在一个特定的实施方案中，对照基 因是管家基因。管家基因是在所有细胞类型中表达的基因，其为所有细胞类型的维持提 供所需的基本功能。人类管家基因的列表可见于Eisenberg等人（Trends in Genetics 19:362-365, 2003)。根据本发明优选的管家基因是选自 B2M、TFRC、YWHAZ、RPL0、18S、(iUSB、 UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS 的基因。根据本发明，进一 步优选的管家基因选自IP〇8、HMBS、⑶SB和UBC。
[0052] 在本实施方案中，在受测试的肺癌样本和参考样本中也测量所述对照基因的表达 水平。然后，针对每个标记基因和每个样本将表达水平相对于对照基因的表达水平进行归 一化。然后计算在肺癌样本归一化的表达水平和参考样本归一化的表达水平之间表达水平 t匕。如上所述，通过将获得的表达水平比和相应阈值进行比较来诊断侵袭性。
[0053] 根据本发明，"阈值"意指允许区分样本的值，其中目标基因的表达水平比对应于 患者肺癌样本中所述目标基因或低或高的表达水平。特别地，当参考样本由来自受测试的 患者的健康肺组织制成时，如果基因表达水平比低于或等于阈值，那么在患者肺癌样本中 的这种基因表达水平被认为是低的，而如果基因表达水平比高于阈值，那么在患者肺癌样 本中的这种基因表达水平被认为是高的。对于每个基因且根据测量基因表达水平所用的方 法不同，最佳的阈值可不同。然而，本领域技术人员基于几种对照癌样本的分析以及比较其 与对照基因（例如，管家基因）的表达可以容易地确定阈值，已知在所述对照癌样本中特定 基因的表达水平（低或高）。
[0054] 本发明进一步涉及专用于实施根据本发明方法的微阵列，其包含至多500、优选至 多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、 至多20、至多10个不同探针，其中至少4个特异性结合至mRNA(或相应的cDNA)或蛋白质， 所述mRNA或蛋白质由本发明的DNA复制应力标记基因所产生。
[0055] 在优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包含至多500、优选至多300、 至多200、更优选为至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多 20、至多10个不同探针（因此排除例如泛基因组（pangenomic)微阵列），其中至少4个特异 性杂交至mRNA (或相应的cDNA)，其由本发明的DNA复制应力标记基因所产生。因此，在更优 选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包含至多500、优选至多300、至多200、更优 选为至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10个 不同的探针、其中至少4个特异性杂交至mRNA (或相应的cDNA)，其由⑶C6、CLASP IN、PLK1、 和P0LQ基因所产生。在甚至更优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包含至多 500、优选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多 40、至多30、至多20、至多10个不同探针，其中至少5个特异性杂交至由⑶C6、CLASPIN、 PLK1、P0LQ和RAD51基因所产生的mRNA(或相应cDNA)。除了探针特异性地杂交至本发明 的DNA复制应力标记基因之外，所述微阵列还可以包含至少一个探针，其特异性地杂交至 管家基因。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPL0、18S、(iUSB、UBC、 TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS。更优选地，所述管家基因选自 IP08、HMBS、⑶SB和UBC基因。根据本发明，"核微阵列"由附着至基质的不同核酸探针所组 成，所述基质可以是微芯片、玻片或微球尺寸的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、 二氧化硅或二氧化硅基的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素构成。探针可以是核酸，例 如cDNA( "cDNA微阵列"）或寡核苷酸（"寡核苷酸微阵列"，所述寡核苷酸是约25至约60 对碱基对或更少的长度）。
[0056] 或者，在另一实施方案中，所述微阵列可以是一种抗体微阵列，其包含至多500、优 选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多 30、至多20、至多10个不同抗体，其中至少4个特异性结合至由本发明的DNA复制应力标记 基因所产生的蛋白质。优选地，所述微阵列可以是一种抗体微阵列，其包含至多500、优选至 多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、 至多20、至多10个不同抗体，其中至少4个特异性结合至由⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基 因所产生的蛋白质。更优选地，所述微阵列可以是一种抗体微阵列，其包含至多500、优选至 多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、 至多20、至多10个不同抗体，其中至少4个特异性地结合至由⑶C6、CLASPIN、PLK1、P0LQ 和RAD51基因所产生的蛋白质。除了所述抗体特异性地结合由本发明的DNA复制应力标记 基因所产生的蛋白质之外，所述微阵列还可以包含至少一种抗体，其特异性地结合管家蛋 白。在一个实施方案中，所述管家蛋白选自由B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、⑶SB、UBC、TBP、 GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS 基因所产生的蛋白质。在一个优选 的实施方案中，所述管家蛋白选自由IP08、HMBS、⑶SB和UBC基因所产生的蛋白质。
[0057] 作为核酸或抗体微阵列技术的替代，可使用定量PCR，因此对待测基因特异的扩增 引物对于进行根据本发明的方法也非常有用。因此，本发明还涉及用于从所述患者的肺癌 样本诊断患者中肺癌侵袭性的试剂盒，其包括上述专用微阵列或对本发明的DNA复制应力 标记基因特异的扩增引物。此处还有，当试剂盒包括扩增引物时，虽然所述试剂盒可包括对 其它基因特异的扩增引物，所述试剂盒优选地包括至多100、至多75、50、至多40、至多30、 优选至多25、至多20、至多15、更优选至多10、至多8、至多6、甚至更优选至多5、最多4、最 多3、或甚至2或1或甚至0对扩增引物，其对其它基因特异而不对本发明的DNA复制应力 标记基因特异。例如，除了对本发明的DNA复制应力标记基因特异的引物之外，所述试剂盒 可包括至少对至少一个管家基因特异的一对扩增引物。在一个实施方案中，所述管家基因 选自 B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、 IP08和HMBS。在优选的实施方案中，所述管家基因选自IP08、HMBS、⑶SB和UBC基因。
[0058] 如上所述，预后与肺癌侵袭性相关的肺癌进展的能力对于选择适当治疗非常重 要，因为除传统的外科治疗外，每次必要时且仅在必要时应当使用具有潜在严重副作用的、 剧烈且昂贵的治疗。
[0059] 因而，本发明提供用于确定肺癌是否对使用放射疗法和/或化学治疗剂的治疗易 感的方法，其包括：
[0060] a)使用如上所述的根据本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性 的，以及
[0061] b)如果所述肺癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则确定所述肺癌对使用放射疗法和/ 或所述化学治疗剂的治疗为易感的。
[0062] 本发明的化学治疗剂包括而不限制于抗微管剂，例如二萜和长春花生物碱；钼配 合物；烧化剂如氮芥、卩惡唑膦（oxazaphosphorines)、烧基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯；抗生 物剂，例如蒽环、放线菌素和博来霉素；拓扑异构酶II抑制剂，例如表鬼白毒素；抗代谢物， 例如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱；激素和激素类 似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂； 和细胞周期信号抑制剂。此外，本发明的方法可以与其它抗癌治疗、抗血管生成剂、或化学 治疗剂或放射疗法组合。优选的实例是多西他赛（docetaxel)和泰索帝（taxotere)。其它 的实例包括吉西他滨、顺钼二萜和长春花生物碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨、卡 钼、环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥、白消安、卡莫司汀、达卡巴嗪、环磷酰胺、美法仑、苯丁 酸氮芥、白消安、卡莫司汀、达卡巴嗪、抗肿瘤剂，其包括但不限于放线菌素如更生霉素、蒽 环霉素（anthrocyclin)如道诺霉素（daunorubicin)和阿霉素、博莱霉素、表鬼白毒素、鬼 臼乙叉甙和替尼泊苷；抗代谢抗肿瘤剂、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、硫基嘌呤、硫鸟 噪呤、喜树碱、盐酸伊立替康（irinotecan HC1)以及盐酸托泊替康（topotecan HC1)。
[0063] 多种不同的化学治疗剂或抗癌多肽也可以选择。信息源例如www. clinicaltrials. gov、www. ncbi. nlm. nih 和 www. drugs, com，包括可以选择的多肤和试剂 的参考文献。
[0064] 优选地，本发明的化学治疗剂已经被至少一个卫生当局批准用于治疗肺癌。 这种特别用于治疗肺癌的化学治疗药物的实例包括氨甲喋呤、培美曲塞二钠、贝伐单 抗（Bevacizumab)、卡钼（Carboplatin)、顺钼（Cisplatin)、甲氨蝶呤、克里唑替尼 (Crizotinib)、埃罗替尼（Erlotinib)、吉西他滨-顺钼（Gemcitabine-Cisplatin)、吉非替 尼（Gefitinib)、紫杉醇（Paclitaxel)、卡钼、培美曲塞（Pemetrexed)、顺钼、克里唑替尼、依 托泊苷（Etoposide)和拓扑替康（Topotecan)。
[0065] 在另一优选的实施方案中，化学治疗剂是基因毒性的。本实施方案是特别有利的， 因为所述标记的任何基因的过表达被预期干扰DNA复制，从而诱导针对基因毒性剂的超敏 反应。优选地，所述基因毒性剂是DNA修复的抑制因子、DNA复制/损伤检验点的抑制因子、 或DNA复制许可/起始的抑制因子。
[0066] 根据本发明，"DNA修复抑制因子"意指能够抑制DNA断裂，特别是双链DNA断裂修 复的分子。然而，这种表述不应当被理解为限定性的，DNA修复抑制因子的实例包括DNA修 复蛋白 PARP 的抑制因子（参见，例如 W02004080976、W02005/053662、W02009/046205)、组 蛋白脱乙酰基酶的抑制因子，如PCT申请W02008/082856中描述的那些、和DNA聚合酶β 的抑制因子（参见W02007/001684)。"DNA复制/损伤检验点抑制因子"是能够阻断参与 DNA复制检验点或DNA损伤检验点的任何蛋白质活性的分子。此种蛋白质的实例包括ATM/ ATR、Chk2和Chkl。"DNA复制许可/起始抑制因子"是能够阻断参与DNA复制许可的任何 蛋白质活性的分子，例如Cdtl、Mcml-7和其它为技术人员所知的。
[0067] 在另一方面，本发明还涉及用于为患有肺癌的患者选择合适治疗的方法，其包 括：
[0068] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及 [0069] b)如果所述癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则在外科治疗中增加辅助的放射疗法 或化学治疗剂。
[0070] 本文所用术语"辅助化学疗法"意为在外科手术之后使用化学治疗剂进行的癌症 治疗，其中外科手术后已经除去所有可检测疾病但仍然存留小量残余癌的风险。
[0071] 本发明还涉及用于为患肺癌的受试者设计使用放射疗法和/或化学治疗剂的治 疗的方法，所述方法包括以下步骤：
[0072] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及
[0073] b)根据步骤a)的诊断确定放射疗法或化学治疗剂治疗的剂量。
[0074] 出于本申请的目的，应当理解当肺癌被诊断为侵袭性时，步骤b)的剂量大于肺癌 被诊断为非侵袭性时。
[0075] 任选地，向受试者施用在步骤b)中确定的放射疗法或化学治疗剂的剂量。
[0076] 本发明还涉及化学治疗剂用于制备治疗肺癌的药物的用途，其包括以下步骤： [0077] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及
[0078] b)根据步骤a)的诊断确定化学治疗剂治疗的剂量。
[0079] 任选地，向受试者施用在步骤（b)中确定的化学治疗剂的剂量。
[0080] 本发明还涉及用于治疗肺癌的化学治疗剂，其中化学治疗剂被施用至患肺癌的受 试者，所述受试者的肺癌使用根据本发明的方法已被诊断为侵袭性。
[0081] 更具体地，本发明涉及用于在患有肺癌的受试者中治疗结直肠癌的化学治疗剂， 其中：
[0082] a)根据本发明的方法确定所述肺癌的侵袭性或非侵袭性，
[0083] b)根据所述鉴定的化学治疗剂反应或非反应表型确定化学治疗剂治疗的剂量，以 及
[0084] c)向所述受试者施用在步骤b)中确定的化学治疗剂的剂量。
[0085] 本发明还涉及调整患肺癌受试者的治疗的方法，其中所述治疗使用放射疗法或化 学治疗，方法包括：
[0086] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及 [0087] b)根据步骤a)的诊断调整放射疗法或化学治疗剂治疗。
[0088] 所述化学治疗剂治疗的调整可在于：
[0089] 一如果所述肺癌已被诊断为非侵袭性，则降低或压低所述放射疗法或化学治疗剂 治疗，或者
[0090] --如果所述肺癌已被诊断为侵袭性，则继续使用所述放射疗法或化学治疗剂进行 所述治疗。
[0091] 本发明还涉及用于治疗患有肺癌的患者的方法，其包括根据上述本发明的方法诊 断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，并使所述患者经受放射疗法和/或向所述患者施 用有效量的一个或更多个DNA修复抑制因子。
[0092] 除非另有其它说明，本发明实施采用常规技术或蛋白化学、分子病毒学、微生物 学、重组DNA技术和药理学，其在本领域技术范围内。这些技术在文献中充分阐明。（参见 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology,编，John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995 ；Remington, s Pharmaceutical Sciences,第 17 版，Mack Publishing Co.，Easton, Pa.，1985 ;以及 Sambrook 等人，Molecular cloning: A laboratory manual 第 二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor, NY,美国，1989) 〇
[0093] 本发明的其它特点和优点出现在具有实施例和附图的说明书的续文中，其附图说 明如下所示。
【专利附图】
【附图说明】
[0094] 图1 :CDC6、CLASPIN、PLK1、P0LQ和RAD51基因表达水平对患者的癌特异性生存的 影响。根据在原发肿瘤中的 DNA P0LQ(A)、PLK1 (B)、CLASPIN(C)、CDC6 (D)和 RAD51 (E)的 表达水平与相邻正常组织相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier总体生存。患者：n = 93 ;表明 来自每次对数秩（log-rank)检验的p值。
[0095] 图2 :在原发肿瘤中CDC6、CLASPIN、PLK1、P0LQ和RAD51基因的伴随表达。皮尔逊 (Pearson)测试分析（A)和等级递增分类（hierarchical ascending classification) (B)。
【具体实施方式】
[0096] 实施例
[0097] 材料和方法
[0098] 患者、肿瘤样本
[0099] 在2006年至2010年间，在Rangueil-Larrey图卢兹医院（法国）诊断为具有未 治疗（在活检时）的从分期I至III的原发性肺腺癌的患者中，手术收集配对的肿瘤样本 (η = 93)。样本即刻放于液氮中速冻。从手术标本中在离肿瘤大于3cm远处取得正常的肺 组织。合格标准包括我们得到冷冻肿瘤和相邻健康组织以及提取高质量RNA的能力。排 除标准包括非腺癌肿瘤、分期Illb和IV以及肿瘤细胞构成（cellularity)低于70%的肿 瘤细胞。由病理学家根据肿瘤、结节、转移（TNM)分期分类分别遵循2010 WHO指南和苏木 精-伊红染色从冷冻组织来定义肿瘤分期和形态。在表S1中描述两个群体的患者和肿瘤 的特征。
[0100] RNA提取和定量
[0101] 通过使用LE1CA CM3050S低温恒温器获得组织的厚冷冻切片。10 μ m(n = 60)和 300 μ m(n = 3-5)厚切片的冷冻组织通过使用5mm直径不锈钢珠和组织研磨仪（Qiagen) 在90s中进行粉碎，然后使用RNeasy提取试剂盒根据制造商（Qiagen)提取总RNA。使 用RNA纳米实验室（Nano Lab)芯片、6000纳米分析（Nano Assay)试剂盒（Agilent Technologies)通过 Agilent 2100 生物分析仪来评估总 RNA 的质量（D0260/D0280>1. 7)。 用 Nanodrop (Thermoscientific)估算其量。使用 TaqMan Universal PCR Master Mix、 TaqMan 低密度阵列技术（Low Density Array technology) (Applied Biosystems)和 7900HT快速实时PCR系统从4份配对的活检中以一式三份地扩增800ng cDNA，之后在 TaqMan低密度人类内源（Edogenous)对照阵列（Applied Biosystems)上测试的16个中通 过GeNorm和BestKeeper软件，来选择四个最稳定对照管家基因（⑶SB、IP08、HMBS、UBS)。
[0102] 为从肿瘤和正常组织中定量RNA，首先在存在3R探针时在TaqMan Preamp Master Mix(Early Access，Applied Biosystems)中预扩增 cDNA(TaqMan 基因表达分析，Applied Biosystems)。然后使用动态阵列（Dynamic Array)技术（Fluidigm, BioMark)扩增 这些产物。在DNA结合样本上样试剂（BioMark)中孵育预扩增的产物，然后将Master Mix(Applied)和探针注射到含纳米管的集成流体通路上样器（Integrated Fluidic Circuit loader)中，然后使用BioMark扩增仪进行扩增。在肿瘤（T)和正常（N)组织中将 转录物的水平相对于4个选择的稳定基因的平均水平进行归一化，之后使用GenEx软件来 分析Fluidigm数据。以T/N比来表示在肿瘤样本中与相邻正常组织相比的相对表达水平。 T/N>1表示在肿瘤样本中的表达比相邻正常组织中更高。T/N〈l表示在癌中比在对照组织 中表达更低。
[0103] 统计分析
[0104] 采用免费统计软件R(版本2·9·2)和StataSElL2软件（Stata公司，College Station, TX，美国）进行统计分析，统计软件R包括"生存"、"DiagnosisMed"和"rpart"程 序包(R开发团队，http://cran. r-proiect. org/)。当在癌组织中比较表达时，主要参数是 单个T/N比。通过二项检验来评估观察到50%以上的患者过度表达或低表达3R基因的概 率（阈值：对于过表达为T/N>1，以及对于低表达为T/N〈l/2)。以相同方式来检验其它阈值 (T/N>5 或 T/N〈l/5、T/NM 或 T/N〈l/4、T/N>3 或 T/N〈l/3 以及 T/N>2 或 T/N〈l/2)。用皮尔 逊相关系数来评估基因之间的相关性。聚类算法也适用：等级递增分类（HAC)。使用将联动 (linkage)和相关距离作为度量标准的Ward方法对基因进行聚类。根据T/N分布的百分位 点将表达水平分为3类。对于治疗（仅手术、手术-化学疗法-放射疗法、或手术-化学疗 法）、肿瘤分级（N或TNM)、肿瘤分化（很少分化、中等分化、或完全分化）、肺栓塞的存在、以 及吸烟习惯，通过卡方检验或Fisher精确检验对表达水平进行比较。使用Kaplan Meier 方法（总体生存、无疾病生存和无复发生存）来估算生存概率。使用对数秩检验来比较生 存曲线。根据Kaplan-Meier方法和多变量Cox比例风险回归模型，在性别、年龄、治疗、肿 瘤分级以及Ki67和PCNA基因的表达水平上调整，来估算与表达水平相关的生存率。我们 使用递归分割方法探索在基因表达和总体生存之间的关系。看上去，在第一个节点得到最 好分割的前三个基因为强关联，并且也已经鉴定为这三个基因与在多变量Cox回归模型中 的总体生存显著相关。已经计算最终多变量Cox回归模型以检验这三个基因中任一个的组 合，其表达大于由递归分割方法给出的阈值。
[0105] 针对二项检验的P值是单侧的。所有其它的P值是双侧的。对于所有统计检验， 在5%水平的差异被认为是显著的。
[0106] 结果
[0107] 在这项研究中，我们在来自一组93个NSCLC患者的原发肿瘤和相邻正常组织中 评估78个参与DNA复制的基因表达。我们发现这些基因中的许多在肿瘤中显著下调。 更重要地，其中一些的错误调节是手术治疗后生存的决定因素，这不依赖于治疗策略或 肿瘤分期。事实上，4个基因标记包括⑶C6、CLASPIN、PLK1和P0LQ基因，其将患者分为 具有显著不同生存的高风险和低风险亚组，并且不依赖于治疗或结节状态（分别为风险 t匕[HR]，36. 31 (95 % CI2. 6-517. 4P = 0· 04) ;[HR]，23. 49(95 % CI1. 9-288. 4P = 0· 01); [HR], 18. 50(95% CI1. 3-267. 4P = 0· 01)和[HR], 20. 65(95% CI1. 5-275. 9P = 0· 05))。
[0108] 大多DNA复制基因在配对的（coupled)肺肿瘤中下调
[0109] 从选择的78个基因中生成在进展的不同早期或中期的93例配对原发性肺腺癌 基因表达谱（表1)，所述基因参与基因组复制的过程，即在复制起点的起始/许可、跨损伤 (translesional，TLS)或常规的DNA延伸、与DNA损伤反应（DDR)相关的S期、DNA叉保护 或复制引发的双链断裂（DSB)的修复（表2)。然后，我们可以鉴定出这些基因中的哪些在 肿瘤（T)中与相邻对照组织（N)相比上调或下调。基于在肿瘤中T/N表达比在2以上或是 在2以下的肿瘤数目，将下调基因分为两组。已知我们没有发现任何下调2倍以上的基因 (数据未显示），我们还证明了那些显示1/2〈T/N〈2比的，即几乎未改变或下调小于2倍的 (表2)。还显示出针对一些代表DNA复制基因在全部93例配对肿瘤中的个体表达水平（图 S2)。
[0110] 表1 :患者的基线特征（η = 93)
[0111]
【权利要求】
1. 一种用于诊断患者中肺癌侵袭性的方法，其包括以下步骤： a) 从所述患者的生物样本检测DNA复制应力基因标记的表达谱,所述标记包括CDC6、 CLASPIN、PLK1 和 POLQ 基因； b) 将步骤a)的表达谱与至少一种参考表达谱进行比较；以及 c) 从所述比较中诊断肺癌为侵袭性或非侵袭性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述标记还包括RAD51基因。
3. 根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中通过测量所述标记的每个基因的表 达水平进行根据步骤a)的表达谱检测。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过测量在参考样本中所述标记的 每个基因的表达水平获得所述参考表达谱。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述参考表达样本是来自所述患者的健康肺组织 样本。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中对于所述标记的每个基因通过计算 在测试生物样本中的表达水平和参考样本中的表达水平之间的表达水平比来进行步骤b) 的比较。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中通过将获得的表达水平比与相应阈 值进行比较来获得诊断。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其包括将所述标记的每个基因的表达水 平对于对照基因的表达水平进行归一化的步骤。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述对照基因是管家基因。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述管家基因是选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、 18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS 的基因。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述基因选自IP〇8、HMBS、⑶SB和UBC。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述表达水平在mRNA水平测量。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述表达水平使用定量PCR或微阵列技术进行 测量。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述表达水平在蛋白水平测量。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述表达水平使用特异性抗体进行测量。
16. -种用于确定肺癌是否对使用放射疗法和/或化学治疗剂的治疗易感的方法，其 包括： a) 使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是 侵袭性，以及 b) 如果所述肺癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则确定所述肺癌对使用所述放射疗法或 化学治疗剂的治疗易感。
17. -种用于在患者中选择肺癌的合适治疗的方法，其包括： a) 使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述癌是或不是侵 袭性，以及 b) 如果所述癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则向外科治疗中增加辅助的放射疗法或化 学治疗剂。
18. -种用于为患肺癌的受试者设计使用放射疗法和/或化学治疗剂进行治疗的方 法，所述方法包括以下步骤： a) 使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是 侵袭性，以及 b) 根据步骤a)的诊断确定放射疗法或化学治疗剂治疗的剂量。
19. 一种调整患肺癌受试者的治疗的方法，所述治疗使用放射疗法或化学治疗剂，方法 包括： a) 使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是 侵袭性，以及 b) 根据步骤a)的诊断调整放射疗法或化学治疗剂治疗。
20. 根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述化学治疗剂是DNA修复的抑 制因子、DNA复制/损伤检验点的抑制因子、或DNA复制许可/起始的抑制因子。
【文档编号】C12Q1/68GK104145030SQ201380012144
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年1月7日 优先权日:2012年1月5日
【发明者】C·卡佐, J-S·霍夫曼 申请人:国家科学研究中心