新启动子及其用途

新启动子及其用途
【专利摘要】本发明的启动子引起目的基因高表达，尤其在耐热性酵母中高表达。所述启动子位于马克斯克鲁维酵母染色体上的PIR1基因上游或CTR1基因上游并且包含控制PIR1基因或CTR1基因的表达的区域。
【专利说明】新启动子及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及在耐热性酵母中发挥功能的新启动子及其用途。

【背景技术】
[0002] 通过利用其发酵能力和作为生产多种物质的宿主，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)所代表的酵母广泛用于食品工业中。此外，酵母是基因工程领域的主要研究主 体。作为酵母的例子，其最佳温度范围落在相对高的温度范围内的酵母（也称作耐热性酵 母）是熟知的，酿酒酵母也是熟知的。
[0003] 使用这类耐热性酵母，可以在相对高的温度范围内维持反应体系，使得防止污染 成为可能。此外，需要在相对高的温度范围内培养酵母，这取决于待生产的物质的类型或反 应体系。在这种情况下，特别优选的是使用耐热性酵母。
[0004] 此外，通常，在酵母中表达给定的基因时，使用恒定允许高表达的启动子。可以在 酵母中使用的已知启动子的例子包括TDH3启动子、ADHl启动子和TEFl启动子。此外，非 专利文献1公开了使用TDH3启动子，在耐热性酵母中表达纤维素酶基因。
[0005] 虽然以上的不同启动子可以总是引起位于其下游的基因在通常可获得的酵母如 酿酒酵母中高表达，但是当使用耐热性酵母作为宿主时，这类下游基因的表达水平不足。 艮P，不存在可以引起目的基因在耐热性酵母中高表达的常规已知的启动子。
[0006] 引文列表 [0007] 非专利文献
[0008] NPLI:JiongHong等人，JournalofBiotechnology130 (2007) 114-123
[0009] 发明概述
[0010] 技术问题
[0011] 考虑到以上情况，本发明的目的是提供能够引起目的基因商表达、特别在耐热性 酵母中高表达的新启动子。
[0012] 技术问题的解决方案
[0013] 作为为了实现以上目的的充分研究结果，发明人成功鉴定到能够引起目的基因在 耐热性酵母中高表达的新启动子。这已经导致本发明的完成。本发明包括以下。
[0014] (1)启动子，其位于马克斯克鲁维酵母染色体上的PIRl基因上游并且包含控制 PIRl基因表达的区域。
[0015] (2)启动子，其位于马克斯克鲁维酵母染色体上的CTRl基因上游并且包含控制 CTRl基因表达的区域。
[0016] (3)根据⑴的启动子,其包含核苷酸序列,所述核苷酸序列由来自SEQIDNO: 1 中所示的核苷酸序列的3'末端的至少1000个核苷酸组成。
[0017] (4)根据⑴的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQIDN0:1 中所示的核苷酸序列的3'末端的至少2000个核苷酸组成。
[0018] (5)根据⑵的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQIDNO:2 中所示的核苷酸序列的3'末端的至少384个核苷酸组成。
[0019] (6)根据⑵的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQIDNO:2 中所示的核苷酸序列的3'末端的至少429个核苷酸组成。
[0020] (7)核酸构建体，其包含根据⑴至（6)中任一项的启动子。
[0021] (8)表达载体，其包含根据（1)至（6)中任一项的启动子。
[0022] (9)根据（8)的表达载体，其还包含位于所述启动子下游的基因。
[0023] (10)转化体，其中根据⑴至（6)中任一项的启动子插入目的基因的上游。
[0024] (11)根据（10)的转化体，其中目的基因是外来基因。
[0025] (12)根据（10)的转化体，其中使用耐热性酵母细胞作为宿主细胞。
[0026] (13)根据（10)的转化体，所述转化体能够引起基于纤维素的生物量糖化和乙醇 发酵。
[0027] (14)用于制备物质的方法，包括培养根据（10)至（13)中任一项的转化体并且在 培养后收集培养基和/或转化体中产生的目的物质。
[0028] (15)用于制备根据（14)所述的物质的方法，其中目的物质是通过乙醇发酵从糖 合成的乙醇，所述糖通过糖化基于纤维素的生物量获得。
[0029] 有利的发明效果
[0030] 本发明的启动子可以甚至在耐热性酵母中引起位于其下游的基因高表达。具体而 言，对于耐热性酵母，可以使用本发明的启动子增加目的基因的表达水平。
[0031] 另外，根据用于生产本发明物质的方法，可以实现目的物质的优异生产率，原因是 使用上述启动子可以改进给定基因的表达水平。即，根据用于产生本发明物质的方法，可以 明显增加由基因编码的蛋白质和/或使用这类蛋白质待产生的多种物质的生产率，其中所 述基因受以上启动子促进时高度表达。
[0032] 附图简述
[0033] [图1]图1是显示KmPIRlp、KmCTRlp和ScTDH3p的报道分子测定法结果的特征 图。
[0034] [图2]图2是显示KmPIRlp、KmCTRlp和其他启动子的报道分子测定法结果的特 征图。
[0035] [图3]图3是显示KmPIRlp的功能性区域的报道分子测定法结果的特征图。
[0036] [图4]图4是显示KmCTRlp的功能性区域的报道分子测定法评价结果的特征图。
[0037] [图 5]图 5 显示pRS434XYL2d_RsXI的构建体。
[0038] [图 6]图 6 显示pRS434KmPIRlp-RsXI的构建体。
[0039] [图 7]图 7 显示pRS434KmCTRlp-RsXI的构建体。
[0040] [图 8]图 8 是显示DMKU3-1042 株、RAK6163 株、KM103 株、KM203 株、KM303 株和 KM306株的增殖测试结果的特征图。
[0041] [图9]图9是显示KM203株、KM303株、KM306株和W700M2株的增殖测试结果的 特征图。
[0042] 实施方案描述
[0043] 下文参考附图和实施例更详细地描述本发明。
[0044] 本发明的启动子包括马克斯克鲁维酵母中的PIRl基因启动子和CTRl基因启动 子。在马克斯克鲁维酵母中的PIRl基因启动子对应于马克斯克鲁维酵母染色体上控制PIRl基因表达的区域。类似地，在马克斯克鲁维酵母中的CTRl基因启动子对应于马克斯克 鲁维酵母染色体上控制CTRl基因表达的区域。
[0045] 将PIRl基因称作受酿酒酵母中转录因子Swi5p控制的基因（Overlappingand distinctrolesoftheduplicateyeasttranscriptionfactorsAce2pandSwi5p, Marie-ThereseDoolin等人，MolecularMicrobiology(2001)40(2), 422-432)。还已知 PIRl基因编码构成细胞壁的糖蛋白。此外，已知转录因子Swi5控制参与细胞周期的基因 的转录（DistinctRegionsoftheSwi5andAce2TranscriptionFactorsAreRequired forSpecificGeneActivation，HelenJ.McBride等人，第 274 卷，第 30 期，1999 年 7 月 23 日发行，第21029-21036页）。
[0046] 此外已知CTRl基因编码酿酒酵母中铜离子的转运蛋白（CopperIon-sensing TranscriptionFactorMaclpPost-translationalIyControlstheDegradationof ItsTargetGeneProductCtrlp*，JesseYonkovich等人，THEJOURNALOFBIOLOGICAL CHEMISTRY，第 277 卷，第 27 期，2002 年 7 月 5 日发行，第 23981-23984 页）。
[0047] 能够控制位于其下游的基因表达的启动子可以充当本发明的启动子。这类启动子 可以对应于位于马克斯克鲁维酵母中PIRl基因或CTRl基因上游的任何区域。作为启动子 的核苷酸序列的例子，SEQIDNO: 1中显示了包含马克斯克鲁维酵母中PIRl基因上游2873 个核苷酸的区域的核苷酸序列。此外，SEQIDNO: 1中所不的核苷酸序列从5'末端向3'末 端读取。这意指PIRl基因位于马克斯克鲁维酵母中SEQIDNO: 1中所显示的核苷酸序列 的下游（即，在其3'末端侧上）。类似地，SEQIDN0:2中显示了包含马克斯克鲁维酵母中 CTRl基因上游840个核苷酸的区域的核苷酸序列。SEQIDNO: 2中所示的核苷酸序列也从 5'末端向3'末端读取。这意指CTRl基因位于马克斯克鲁维酵母中SEQIDNO: 2中所显示 的核苷酸序列的下游（即，在其3'末端侧上）。
[0048] 更具体地，作为本发明启动子的例子，位于马克斯克鲁维酵母中PIRl基因上游的 启动子优选地包含这样的区域，所述区域包含位于PIRl基因上游的1000个核苷酸（即，在 SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列的3'末端侧上的1000个核苷酸）。更优选地，它包含这 样的区域，所述区域包含位于PIRl基因上游的2000个核苷酸（S卩，在SEQIDNO: 1中所示 的核苷酸序列的3'末端侧上的2000个核苷酸）。可以使用包含位于PIRl基因上游的1000 个核苷酸的区域作为明显显示优异表达促进活性的启动子。此外，可以使用包含位于PIRl 基因上游的2000个核苷酸的区域作为进一步显示优异表达促进活性的启动子。
[0049] 另外，对位于马克斯克鲁维酵母中PIRl基因上游的启动子而言是最优选的是包 含这样的区域，所述区域包含SEQIDN0:1中所示的核苷酸序列。可以使用包含SEQID NO: 1中所示的核苷酸序列的区域作为显示最高反式激活活性的启动子。
[0050] 同时，作为本发明启动子的例子，位于马克斯克鲁维酵母中CTRl基因上游的启动 子优选地包含这样的区域，所述区域进一步位于包含CTRl基因的384个核苷酸的区域上 游。具体而言，位于CTRl基因上游的启动子优选地包含在来自SEQIDN0:2中所示核苷酸 序列的3'末端的第384核苷酸和第384核苷酸的5'-端侧上的核苷酸之间的区域。特别 优选地，位于CTRl基因上游的启动子包含在来自SEQIDN0:2中所示核苷酸序列的3'末 端的第384核苷酸和来自相同末端的第429核苷酸之间的区域。可以使用位于CTRl基因 上游的这些区域用作为显示特别高的反式激活活性的启动子。
[0051] 此外,可以使用如上文所述的SEQIDNO: 1或2中所示的核苷酸序列作为参考序 列限定本发明的启动子；然而，参考核苷酸序列不限于SEQIDN0:1和2中所示的序列。例 如，参考核苷酸序列可以是具有启动子活性并包含相对于SEQIDNO: 1或2中所示的核苷 酸序列80 %或更大、优选地90 %或更大和更优选地95 %或更大同一性的多核苷酸的序列。 具体而言，本发明的启动子可以包含核苷酸序列或区域，所述核苷酸序列与SEQIDNO: 1中 所示的核苷酸序列具有80%或更大、优选地90%或更大和更优选地95%或更大同一'丨生，所 述区域包含在核苷酸序列的3'末端侧上的1000个核苷酸和优选地200个核苷酸。
[0052] 另外，将本发明的启动子限定为对应于与SEQIDN0:2中所示的核苷酸序列具有 80 %或更大、优选地90 %或更大和更优选地95 %或更大同一性的核苷酸序列，或在来自3' 末端的第384核苷酸和第384核苷酸的5'端侧上的核苷酸之间的区域和优选地在来自3' 末端的第384核苷酸和来自相同末端的第429核苷酸之间的区域。
[0053] 这里，同一性的值是使用序列同源性检索程序（有时称作同源性检索程序）在核 苷酸序列和SEQIDN0:1或2中所示的核苷酸序列之间比对时，计算为该核苷酸序列中与 SEQIDN0:1或2中所示核苷酸序列的核苷酸相对应的核苷酸的百分数值。
[0054] 另外，使用SEQIDN0:1或2中所示的核苷酸序列作为参考序列限定本发明的启 动子；然而，参考核苷酸序列不限于SEQIDN0:1和2中所示的核苷酸序列。例如，下述多 核苷酸的核苷酸序列可以是参考序列，所述多核苷酸具有启动子活性并且包含通过替换、 缺失、添加或插入一个或多个核苷酸而从SEQIDN0:1或2中所示的核苷酸序列衍生的核 苷酸序列。本文所用的表述"多个核苷酸"指例如2至200个氨基酸、优选地2至100个氨 基酸、更优选地2至50个基酸和最优选地2至25个氨基酸。
[0055] 另外，可以使用下述多核苷酸的核苷酸序列作为参考序列限定本发明的启动子， 所述多核苷酸具有启动子活性并且在严格条件下同包含与例如SEQIDN0:1或2中所示 核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸的部分或全部杂交。这里，在严格条件下杂交 指在60°C在用2xSSC洗漆期间维持偶联。杂交可以通过常规的已知方法如J.Sambrook 等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第 2 版,ColdSpringHarbor Laboratory(1989)中所述的方法进行。
[0056] 此外，可使用适宜的宿主，通过报道分子测定法验证具有某种核苷酸序列的多核 苷酸是否具有启动子活性。本文所用的适宜宿主可以优选地是耐热性酵母如马克斯克鲁维 酵母；然而，也可以使用酵母如酿酒酵母。不限制用于报道分子测定法的报道基因。例如， 可以使用萤光素酶（LUC)基因或β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS)基因。采用报道基因的此类测 定法可以根据常规已知方案的适当改良形式使用。
[0057] 上文描述的本发明启动子发挥作用以控制位于其下游的基因表达。这里，术语"下 游"指转录方向，即，从有义链的5'末端至3'末端的方向。可以使用本发明的启动子提 供具有表达控制区的核酸构建体，所述表达控制区甚至在耐热性酵母中显示优异的转录活 性。此外，该核酸构建体不仅可以包含启动子，还可以包含可以改善启动子的转录活性的顺 式作用元件。可以构造这种核酸构建体以在两个末端都具有限制性酶识别序列。此外，还 能够将核酸构建体掺入，例如，常规已知的表达载体中。具体而言，当本发明的启动子掺入 可以引起目的基因表达的表达载体中时，可以提供可以引起该基因在耐热性酵母中高表达 的表达载体。
[0058] 可以通过将以上启动子掺入主要用于转化宿主细胞的任何常规已知的表达载体 中,产生这种表达载体。此外,可以将包含以上启动子的表达载体引入到宿主细胞的染色体 上或染色体外地保留。此外，可以使用任何表达载体如质粒载体、粘粒载体或噬菌体载体。 除启动子之外，本文中所用的表达载体可以包含增强子、选择标志物、复制起始位点、多克 隆位点等。
[0059] 当表达载体用于转化酵母（包括耐热性酵母）时，可以通过将目的基因掺入表达 载体中产生重组载体。当使用这种重组载体转化宿主细胞时，基因的高水平转录在宿主细 胞中发生。不具体地限制本文所用的宿主细胞；然而，优选地是酵母，包括耐热性酵母，并且 特别优选地是耐热性酵母。
[0060] 本文所用的选择标志物是引入以充当表达载体引入的标志物的基因。通常而言， 使用编码荧光蛋白或产生颜色反应的酶的基因、弥补宿主营养缺陷型的基因或耐药基因。 在本发明中，可以使用这种通常使用的选择标志物基因构建表达载体。
[0061] 不具体地限制可以作为宿主使用的酵母；然而，优选地使用耐热性酵母。耐热性酵 母指可以在比下文所述的通常可获得的酵母更高的温度范围内增殖的酵母。允许增殖的温 度可以定义为可以维持某个增殖速率的上限温度。更具体地，耐热性酵母可以定义为允许 增殖的温度是40°C或更高、优选地42°C或更高，和更优选地45°C或更高的酵母。
[0062] 耐热性酵母的例子包括，但是不特别地限于马克斯克鲁维酵母、多形汉逊 酵母（Hansenulapolymorpha)、光滑假丝酵母（Candidaglabrata)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)和汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii) 〇 [0063] 此外，可以作为宿主使用的酵母不限于以上耐热性酵母，并且可以使用通常可获 得的酵母。通常可获得的酵母的例子包括休哈塔假丝酵母（Candidashehatae)、树干毕赤 酵母（Pichiastipitis)、嗜单宁管囊酵母（Pachysolentannophilus)、酿酒酵母和粟酒裂 殖酵母（Schizosaccharomycespombe)。特别地，优选酿酒酵母。
[0064] 常规已知作为酵母转化方法的任何方法可以用作将包含本发明启动子的表达 载体引入酵母的方法。可以在本发明中使用的方法的具体例子包括但不限于电穿孔法 (Meth.Enzym.，194,第 182 页（1990))、球状质体法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75 第 1929 页（1978))和乙酸锂法（J.Bacteriology, 153，第 163 页（1983)、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 75 第 1929 页（1978),Methodsinyeastgenetics, 2000 版：AColdSpringHarbor LaboratoryCourseManual)〇
[0065] 另外，位于本发明启动子下游的基因是意在宿主酵母如耐热性酵母中表达的基 因。不具体地限制基因并且因此它可以是编码任何蛋白质的基因。例如，其例子包括编码 参与基于纤维素的生物量糖化的多种酶的基因和编码参与利用来自生物量的糖进行乙醇 发酵的多种酶的基因。基因的具体例子包括碱性蛋白酶基因、α-淀粉酶基因、抗坏血酸氧 化酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、纤维二糖水解酶基因、纤维素酶基因、角质酶基因、内切葡 聚糖酶基因、葡糖淀粉酶、β-葡糖苷酶基因，乙二醛氧化酶基因、漆酶基因、木质素氧化酶 基因、木质素过氧化物酶基因、脂肪酶基因、锰过氧化物酶基因、1，2-α_甘露糖苷酶基因、 核酸酶基因、果胶裂合酶基因、果胶甲酯酶基因、酸性磷酸酶基因、多聚半乳糖醛酸酶基因、 木聚糖酶基因和木糖苷酶基因。
[0066] 更具体地，编码参与来自生物量的糖的乙醇发酵的多种酶的基因的例子包括编码 参与木糖代谢的酶的基因（即，木糖代谢相关基因）。木糖代谢相关基因包括编码将木糖转 化成木糖醇的木糖还原酶的木糖还原酶基因、编码将木糖醇转化成木酮糖的木糖醇脱氢酶 的木糖醇脱氢酶基因、编码使木酮糖磷酸化从而产生木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶的木酮 糖激酶基因、和编码将木糖转化成木酮糖的木糖异构酶的木糖异构酶基因。此外，木酮糖激 酶产生的木酮糖-5-磷酸进入磷酸戊糖途径，从而被代谢。
[0067] 不特别地限制引入酵母基因组中的木糖代谢相关基因。然而，其例子包括：来自 树干毕赤酵母的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因；和来自酿酒酵母的木酮糖激酶基因 (见EliassonA等人，Appl.Environ.Microbiol, 66:3381-3386和ToivariMN等人，Metab. Eng. 3:236-249)。可以使用的木糖还原酶基因的其他例子包括源自热带假丝酵母（Candida tropicalis)或源自Candidaprapsilosis的木糖还原酶基因。可以使用的木糖醇脱氢酶 基因的例子包括源自热带假丝酵母或源自Candidaprapsilosis的木糖醇脱氢酶基因。可 以使用的木酮糖激酶基因的例子包括源自树干毕赤酵母的木酮糖激酶基因。另外，可以使 用源自鼠灰链霉菌（Streptomycesmurinus)簇的木糖异构酶基因等。
[0068] 除以上木糖代谢相关基因之外，编码参与来自生物量的糖的乙醇发酵的多种酶的 基因可以是编码参与糖（如纤维二糖、半乳糖、乳糖、甘露糖和蔗糖）的乙醇发酵的多种酶 的基因。
[0069] 同时，可以使用本发明的启动子和酵母如耐热性酵母生产多种目的物质。这里，待 生产的物质是由通过以上启动子以高水平转录的基因所编码的任何蛋白质和使用该蛋白 质待生产的物质。使用该蛋白质待生产的物质的例子是该蛋白质作为代谢途径中的酶所涉 及的代谢产物。
[0070] 这里，不限制待生产的蛋白质，并且因此它可以是具有任何分子量的来自任何生 物物种的具有任何等电点并且包含任何氨基酸序列的蛋白质。特别地，待生产的蛋白质的 例子包括由来自高等生物基因编码的以下蛋白质：溶菌酶、凝乳酶、凝集素、白介素、乳铁 蛋白、抗体药物如抗-Fas抗体、螨变应原、花粉变应原、用于降解木质生物量的纤维素降解 酶，和细胞因子。
[0071] 此外，当蛋白质是纤维素酶时，使用该蛋白质待生产的物质的例子是使用培养基 中所含有的纤维素为底物，通过糖化反应获得的糖。另外，当在耐热性酵母中使用本发明的 启动子高度表达编码参与乙醇发酵的多种酶的基因时，乙醇是待生产的物质。
[0072] 如果待生产的物质通过胞外分泌产生，则可以在不破坏细胞的情况下通过标准方 法收集该物质。此外,如果胞内产生待生产的物质,则将细胞破碎,并且随后可以根据标准 方法收集该物质。如果待生产的物质是蛋白质，可以通过用本领域已知的十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)直接分析培养基上清样品或细胞破碎后所获得的上清样 品实施测量。在这种情况下，细胞培养期间生产的目的蛋白质分泌在培养基中，并且随后通 过例如从细胞培养基移走不必要的组分纯化或分离该蛋白质。为了纯化目的蛋白，例如可 以单独或组合地使用技术，如亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、乙醇沉淀、反相 HPLC、阳离子交换树脂（即，二氧化硅或DEAE)色谱、聚焦层析、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀法和 凝胶过滤。
[0073] 如果待生产的物质是乙醇，则从其中已经培养酵母的培养基收集乙醇。不特别地 限制用于收集乙醇的方法，并且因此可以使用任何常规的已知方法。例如，在上文描述的乙 醇发酵完成后，通过固-液分离将含有乙醇的液体层与含有重组酵母和固态组分的固相分 离。随后，通过蒸馏分离/纯化液相中所含的乙醇。因此，可以收集高纯度乙醇。可以根据 乙醇的使用目的适当地调节乙醇纯化的程度。
[0074] 具体而言，本发明的启动子优选地用于通过所谓"同时糖化和发酵"使用基于纤维 素的生物量生产乙醇。在这种情况下，本发明的启动子与编码酶的基因连接，所述酶参与用 于基于纤维素的生物量中所含非葡萄糖的糖组分（例如，木糖）的乙醇发酵的反应，并且随 后与基因连接的启动子被引入耐热性酵母（重组耐热性酵母）中。非葡萄糖的糖组分的实 例包括木糖、纤维二糖、半乳糖、乳糖、甘露糖和蔗糖。
[0075] 同时糖化和发酵指一种反应体系，其中用于降低培养基中所含多糖（如纤维素或 半纤维素）的分子量的糖化反应和用于从糖化反应中产生的糖（主要地是单糖）合成乙醇 的乙醇发酵同时进行。糖化反应例如是一种反应，其中涉及随机作用于纤维素链以产生纤 维寡糖的内切葡聚糖酶、作用于纤维素链末端以产生纤维二糖的纤维二糖水解酶I和II以 及作用于产生的寡聚糖以产生葡萄糖（即单糖）的葡糖苷酶。这些酶在一些情况下统 称为纤维素酶。市售纤维素酶制剂可以用于同时糖化和发酵的糖化反应中。此外，水解半 纤维素以获得低分子量物质的半纤维素酶可以用于同时糖化和发酵的糖化反应中。
[0076] 已经引入本发明启动子和以上基因的耐热性酵母可以在处于高温范围内的最佳 生长温度进行同时糖化和发酵。具体而言，以上基因可以在包括最佳生长温度的高温范围 内表达，并且因此可以改进乙醇发酵时乙醇生产率。另外，包括用于耐热性酵母的最佳生长 温度的高温范围对应于可以对上述纤维素酶、半纤维素等实现高反应速率的高温范围。因 此，可以通过在包括用于耐热性酵母的最佳生长温度的高温范围内实施同时糖化和发酵， 改进糖化效率。换句话说，可以减少为实现目的糖化效率所需要的酶量。如上文描述，作为 使用已经引入本发明启动子和以上基因的重组耐热性酵母同时糖化和发酵的结果，可以对 使用基于纤维素的生物量的乙醇生产实现成本降低和乙醇产率改善。
[0077] 此外，用于同时糖化和发酵的温度条件优选地包括，但不限于用于以上重组耐热 性酵母的最佳生长温度。例如，用于同时糖化和发酵的温度条件可以是20°C至50°C，优选 地30°C至50°C，并且更优选地35°C至45°C。此外，将培养溶液的pH优选地调节到4至6。 另外，可以在培养期间进行搅动或搅拌。 实施例
[0078] 下文参考以下实施例更详细地描述本发明，但是本发明的技术范围不限于此。
[0079] 实施例1
[0080] 在这个例子中，将作为耐热性酵母的马克斯克鲁维酵母中的PIRl基因启动子和 CTRl基因启动子分离并通过报道分子测定法方法就启动子活性进行评价。
[0081] 首先，根据标准方法制备马克斯克鲁维酵母的染色体DNA。使用获得的染 色体DNA作为模板，KmCTRl-1085(TAGGATCAGGAGACAATCGATATTA(SEQIDN0:3))和 CLuc+30c-KmCTRl-lc2
[0082] (caaagcgacagccaagatcaaggtcttcatCTTGATTGTTCAATTGTCAATTGTC(SEQID NO: 4))作为引物，以及KODplusDNA聚合酶（Toyobo)，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶 液进行电泳以获得目的DNA条带。
[0083] 此外，根据标准方法制备酿酒酵母RAK4296株（MATahis3 2001eu2 0metl5 0trpl-delta-63ura3 0::ScGAL10p-yCLuc-15C-LEU2)的染色体DNA。使用获得的染色体 DNA作为模板，yCLuc+1(ATGAAGACCTTGATCTTGGC(SEQIDNO: 5))和URA3-280c(CAGTCTGTGA AACATCTTTCTAC(SEQIDN0:6))作为引物，以及KODplusDNA聚合酶（Toyobo)，进行PCR。 在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
[0084] 使用上文获得的两个DNA片段的混合物和引物KmCTRlp-1086和URA3-280C进行 融合PCR。因此，获得包含两个融合的DNA片段的DNA。如此获得的DNA片段具有包含融合 在马克斯克鲁维酵母的CTRl基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。此外，这种DNA片段 含有URA3基因作为选择标志物基因。
[0085] 类似地，使用马克斯克鲁维酵母的染色体DNA作为模板，KmPIRl-2867(GGAAAGAGT CGATGTGATTCGATGC(SEQIDN0:7))和10tg-KmPIRl-lc(tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgTGTATAAATC GGGGTATGTG(SEQIDN0:8))作为引物，以及KODplusDNA聚合酶（Toyobo)，进行PCR。在 完成PCR后,将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
[0086] 另外，使用酿酒酵母RAK4296株的染色体DNA作为模板，10CA-yCLuc+l(cacacacac acacacacacaATGAAGACCTTGATCTTGGC(SEQIDN0:9))和URA3-280c作为引物，以及KODplus DNA聚合酶（Toyobo)，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
[0087] 使用上文获得的两个DNA片段的混合物和引物KmPIRl-2867和URA3-280C进行融 合PCR。因此，获得包含两个融合的DNA片段的DNA。如此获得的DNA片段具有包含融合在 马克斯克鲁维酵母的PIRl基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。此外，这种DNA片段含 有URA3基因作为选择标志物基因。
[0088] 同时，以相似方式通过报道分子测定法就启动子活性而言评价酿酒酵母中的TDH3 基因启动子。使用酿酒酵母RAK4920 株（MATahis3 2001eu20metl5 0trpl-A-63ura3 0: :ScTDH3p-yCLuc-15C-LEU2)的染色体DNA作为模板和URA3-290(GAGAAGGGCAACGGTTCATC ATCTC(SEQIDNO: 10))和15G-yCLuc+1662c(gggggggggggggggCTACTTGCACTCATCTGGGA(SEQ IDNO:11))作为引物，将ScTDH3启动子添加的yCLuc(ATT0Corporation)进行PCR。在完 成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。此外，使用酿酒酵母BY4704株（MATa ade2_::hisGhis3-2001eu2-01ys2-0metl5-0trpl-63)的染色体DNA作为模板和 15C-URA3 -223(cccccccccccccccaagcttttcaattcatcttttttttttttg(SEQIDN0:12))和URA3_280c 作为引物，进行PCR。在完成PCR后，将反应溶液进行电泳以获得目的DNA条带。
[0089] 使用上文获得的两个DNA片段的混合物和引物URA3-290和URA3-280C进行融合 PCR。因此，获得包含两个融合的DNA片段的DNA。如此获得的DNA片段具有包含融合在马 克斯克鲁维酵母的TDH3基因启动子下游的萤光素酶基因的结构。此外，这种DNA片段含有 URA3基因作为选择标志物基因。
[0090] 接着，将RAK4174株（马克斯克鲁维酵母leu2_ura3〇用上文获得的三种不同DNA 片段的每种片段转化。转化按以下方式实施。首先，使用Yro培养基在28°C和150转/分 钟实施振摇培养1日。将获得的培养物溶液（I. 5ml)以12, 000转/分钟离心1分钟。弃 去上清液，并添加TF缓冲液（40 %聚乙烯二醇3350,0.2M乙酸锂和0.IM二硫苏糖醇）（200 微升），随后搅拌混合15秒。随后，将混合物以12, 000转/分钟离心1分钟并弃去上清液。 将所得物悬浮于TF缓冲液（50微升）中。添加DNA(3微升），随后在47°C热休克处理15 分钟。将获得的细胞接种在缺乏尿嘧啶的固体培养基上并在28°C静置培养3日。随机选择 固体培养基上培育的菌落按如下文描述的方式进行活性测量。
[0091] 将通过用下述DNA片段转化RAK4174株所获得的菌株命名为"马克斯克鲁维酵母 RAK5689菌株"，所述DNA片段具有包含融合在PIRl基因启动子下游的萤光素酶基因的结 构。此外，将通过用下述DNA片段转化RAK4174株所获得的菌株命名为"马克斯克鲁维酵 母RAK5686菌株"，所述DNA片段具有包含融合在CTRl基因启动子下游的萤光素酶基因的 结构。
[0092] 将包含YP培养基和浓度2 %的不同糖的每种培养物溶液在28 °C培养48小 时并采样，随后测量活性。将Cluc测量试剂盒（ΑΤΤ0Corporation)和光度计GLOMX 20/20LUMIN0METER(Promega)用于测量。本文所用的糖是葡萄糖、纤维二糖、半乳糖、乳糖、 甘露糖、蔗糖和木糖。图1显示测量结果。在图1中，KmPIRlp表示马克斯克鲁维酵母PIRl 启动子的启动子活性，KmCTRlp表示马克斯克鲁维酵母CTRl启动子的启动子活性，并且 ScTDH3p表示酿酒酵母TDH3启动子的启动子活性。
[0093] 如图1中所显示，发现马克斯克鲁维酵母的PIRl启动子和马克斯克鲁维酵母的 CTRl启动子在马克斯克鲁维酵母中具有胜过通常作为高表达启动子使用的酿酒酵母的 TDH3启动子的优异启动子活性。马克斯克鲁维酵母PIRl的启动子和马克斯克鲁维酵母的 CTRl启动子之间的比较揭示使用选自以上的任一种糖时，与CTRl启动子相比，马克斯克鲁 维酵母PIRl启动子显示优越的启动子活性。
[0094] 另外，在这个实施例中，就活性而言评价源自马克斯克鲁维酵母的许多启动子。具 体而言，使用以上文描述的方式制备的马克斯克鲁维酵母的染色体DNA和下表1中所列的 引物组，进行PCR，随后电泳。因此，获得目的DNA条带。此外，使用酿酒酵母RAK4296株 (MATahis3 2001eu20metl5 0trpl-A-63ura3 0::ScGAL10p-yCLuc-15C-LEU2)的染色体 DNA、yCLuc+l和URA3-280c作为引物，KODplusDNA聚合酶（Toyobo)，进行PCR，随后电泳。 因此，获得目的DNA条带。使用如此获得的两个DNA片段的混合物进行融合PCR，从而获得 包含两个已融合的DNA片段的DNA。将获得的DNA片段按上文描述的方式引入马克斯克鲁 维酵母RAK4174株中。随后，确定YH)培养基中的启动子活性。
[0095] [表 1]
[0096]

【权利要求】
1. 启动子，其位于马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus)染色体上的PIRl基 因上游并且包含控制PIRl基因表达的区域。
2. 启动子，其位于马克斯克鲁维酵母染色体上的CTRl基因上游并且包含控制CTRl基 因表达的区域。
3. 根据权利要求1所述的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQID NO: 1所示的核苷酸序列的3'末端的至少1000个核苷酸组成。
4. 根据权利要求1所述的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQID NO: 1所示的核苷酸序列的3'末端的至少2000个核苷酸组成。
5. 根据权利要求2所述的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQID NO: 2所示的核苷酸序列的3'末端的至少384个核苷酸组成。
6. 根据权利要求2所述的启动子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列由来自SEQID NO:2所示的核苷酸序列的3'末端的至少429个核苷酸组成。
7. 核酸构建体，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的启动子。
8. 表达载体，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的启动子。
9. 根据权利要求8所述的表达载体，其还包含位于所述启动子下游的基因。
10. 转化体，其中根据权利要求1至6中任一项所述的启动子插入在目的基因的上游。
11. 根据权利要求10所述的转化体，其中目的基因是外来基因。
12. 根据权利要求10所述的转化体，其中使用耐热性酵母细胞作为宿主细胞。
13. 根据权利要求10所述的转化体，所述转化体能够引起基于纤维素的生物量糖化和 乙醇发酵。
14. 用于制备物质的方法，包括培养根据权利要求10至13中任一项所述的转化体和收 集在培养后的培养基和/或转化体中产生的目的物质。
15. 根据权利要求14所述的用于制备物质的方法，其中目的物质是通过乙醇发酵从糖 合成的乙醇，所述糖是通过糖化基于纤维素的生物量获得的糖。
【文档编号】C12P1/02GK104220600SQ201380012169
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2012年3月2日
【发明者】志佐伦子, 赤田伦治, 星田尚司, 牟田口梢荣, 上村毅, 德弘健郎, 片平悟史 申请人:丰田自动车株式会社, 国立大学法人山口大学