改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法
【专利摘要】本文中提供将生物材料染色以用于检测，且在一些例子中还鉴定微生物的目的的方法。使用慢作用脱色制剂，如一种包含1，2-丙二醇或乙二醇的脱色制剂来对细菌革兰氏染色的方法可用于延长脱色步骤的时间，如此允许革兰氏染色方法的自动化。还提供用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色的组合物和试剂盒。
【专利说明】改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革 兰氏染色方法
【技术领域】
[0001] 本公开涉及，为了检测微生物以及在一些例子中鉴定微生物的目的，而对生物材 料进行染色的方法。更具体地，本公开涉及用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色 的方法、组合物和试剂盒。
[0002] 置量
[0003] 革兰氏染色是一种公知的、普遍使用的微生物学技术，其用于微生物尤其是细菌 的检测、分类和鉴定。革兰氏染色的最常见方法涉及四个步骤：染色、捕获、脱色和复染色。 组织学实验室中常用的革兰氏染色已知是不稳定的，特别是由于脱色步骤中的波动所致。 影响脱色步骤的变量包括溶剂强度、浓度、体积和暴露持续时间。在手动革兰氏染色过程 中，脱色步骤常规使用醇或丙酮，且该步骤仅需数秒。然而，对于自动化染色过程，该脱色过 程发生得太快。本公开针对在自动化染色平台上的革兰氏染剂脱色的问题。
[0004] 概沭
[0005] 本文中提供了能自动进行革兰氏染色的方法、组合物和试剂盒。发明人已鉴定出 延长革兰氏染色脱色步骤的组合物，其允许革兰氏染色的自动化，例如，使用自动化的和/ 或计算机执行的染色装备来实现自动化。
[0006] 本文中提供了对样品（如在显微镜载玻片上的样品）进行革兰氏染色的方法。所 述方法可用于检测和区分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在一些例子中，所公开的革 兰氏染色方法被用于检测并非细菌的微生物，如酵母（例如假丝酵母（Candida)和隐球酵 母（Cryptococcus))。
[0007] 在具体的例子中，所述方法包括使样品与慢作用脱色制剂（如一种包含1，2-丙二 醇或乙二醇的制剂）在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌显著除去初级染剂-捕 获剂复合物的条件下接触。所述样品是先前与初级染剂（如结晶紫）和捕获剂（如碘）接 触过的样品。在具体的例子中，所述方法包括革兰氏染色过程的一个或多个另外的步骤， 如使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁和细胞膜 染色的条件下接触；使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接 触；使所述样品与复染剂在足以对已脱色的革兰氏阴性细菌进行染色的条件下接触，或其 组合。
[0008] 本文还提供能充当慢作用脱色制剂的组合物。在一个例子中，所述组合物包含至 少80%的慢作用脱色剂（如1，2_丙二醇或乙二醇）和不超过20%的快作用脱色剂（如 0. 1-20 %的快速作用脱色剂，例如乙醇或丙酮）。这类组合物可用作自动化革兰氏染色中的 慢作用脱色制剂。
[0009] 本文还提供用于自动化革兰氏染色的试剂盒。在一个例子中，所述试剂盒在容器 中包含慢作用脱色制剂，如包含至少80%或至少90%的慢作用脱色剂（如1，2-丙二醇或 乙二醇）和不超过20%的快作用脱色剂（如0. 1-20%或1-10%的快速作用脱色剂，例如乙 醇或丙酮）的制剂。在一些例子中，试剂盒可另外包含其他组分，如在容器中的一种或多种 初级染剂；在容器中的捕获剂；在容器中的复染剂，显微镜载玻片，盖玻片，其他染剂，和对 照载玻片。在具体的例子中，所述容器配置为与自动化革兰氏染色平台一起使用。
[0010] 本公开的前述和其他对象和特征将从下列详细描述并参照附图而变得更加明显。
[0011] 附图简沭
[0012] 图1是显示用于自动化革兰氏染色的例示性方法的流程图。
[0013] 迸述
[0014] 提供对术语和方法的以下解释以更好地描述本发明及指导本领域普通技术人员 实施本发明。除非上下文清楚地另外指示，单数形式"一个"、"一种"和"该"指一种或超过 一种。例如，术语"包含一个/ 一种标本"包括单数或复数标本，且视为等同于短语"包含至 少一种标本"。除非上下文清楚地另外指示，术语"或"指所述备选要素中的单个要素或者指 两个或更多个要素的组合。如本文中使用的，"包含"意指"包括"。如此，"包含A或B"意 指"包含A、B或A和B"，而不排除别的要素。
[0015] 除非另外解释，本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所述领域中的 普通技术人员普遍理解的相同的含义。在有冲突的情况下，将以包括术语解释的本说明书 为准。微生物学中的常见术语和方法的解释可见于Wistreich and Lechtman，Laboratory Exercises in Microbiology (微生物学的实验室手册），第 6 版，1988 和 Boyd，General Microbiology (微生物学概述），第2版，1988。
[0016] 本文中提到的所有公开出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过提述完整 并入以用于所有目的。
[0017] 尽管可将类似或等同于本文中描述的抗体和材料的那些用于实践或测试所公开 的技术，但下文描述了适宜的方法和材料。所述材料、方法和例子仅为例示性的且不意图为 限制的。
[0018] 为了促进对本公开的各实施方案的评述，提供了对特定术语的以下解释：
[0019] 抗体（Ab):包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区，且特异性结合抗原（如 靶试剂）的表位的多肽。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或抗体片段以及本领域已知的 其他抗体。在一些例子中，抗体特异于靶物，如具体细菌或细菌类型，如此可与本文中提供 的方法相伴进行测定。
[0020] 抗体由重链和轻链构成，它们各自具有可变区，称为可变重链（VH)区和可变轻链 (VL)区。VH区和VL区一起负责结合抗体所识别的抗原。这包括完整的免疫球蛋白及本领 域公知的它们的变体和组成部分，如Fab'片段、F(ab) ' 2片段、单链Fv蛋白（"scFv"）和 被二硫键稳定的Fv蛋白（"dsFv")。scFv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可 变区和免疫球蛋白的重链可变区由接头结合，而在dsFv中，各个链经突变引入了二硫键， 从而稳定各个链的联合。该术语还包括重组形式如嵌合抗体（例如人源化的鼠抗体）和异 偶联抗体（如双特异性抗体）。亦参见 Pierce Catalog and Handbook，1994-1995 (Pierce Chemical Co. , Rockford, IL) ;Kuby, Immunology,第 3 版，W. H. Freeman&Co. , New York, 1997。
[0021] "单克隆抗体"是由B淋巴细胞的单个克隆或由转染了单个抗体的轻链和重链基因 的细胞所产生。单克隆抗体由本领域技术人员已知的方法来产生，例如通过从骨髓瘤细胞 与免疫脾细胞制备杂合的抗体形成细胞来产生。这些融合的细胞及其子代称作"杂交瘤"。 单克隆抗体包括人源化的单克隆抗体。
[0022] 细菌：在一些例子中，原核生物导致疾病（病原菌）。根据其细胞壁的结构特征可 将细菌分类。例如，"革兰氏阳性"细胞壁中多层厚厚的肽聚糖层染色呈紫色，而薄的"革兰 氏阴性"细胞壁呈现粉色。通过将形态学和革兰氏染色组合，可将大部分细菌归属至四个组 (革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性球菌和革兰氏阴性杆菌）。
[0023] 可利用公开的革兰氏染色方法检测的细菌的例子，包括但不限于：鲍曼不动 杆菌（Acinetobacter baumanii)、放线杆菌属物种（Actinobacillus sp.)、放射菌 (Actinomycetes)、放线菌属物种（Actinomyces sp.)(如伊氏放线菌（Actinomyces israelii)和内氏放线菌（Actinomyces naeslundii))、气单胞菌属物种（Aeromonas sp.) (如嗜水气单胞菌（八6!'011101^8 117(11'(^11；!_13)、维罗纳气单菌温和生物变种（八61'011101188 veronii biovar sobria)(温和产气单胞菌（Aeromonas sobria)和豚鼠气单胞菌 (Aeromonas caviae)、嗜吞嗤细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum)、木糖产喊杆 菌（Alcaligenes xylosoxidans)、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii)、伴放线 放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans)、杆菌属物种（Bacillus sp.) (如炭疽杆菌（Bacillus anthracis)、錯样芽孢杆菌（Bacillus cereus)、枯草芽孢杆 菌（Bacillus subtilis)、苏芸金杆菌（Bacillus thuringiensis)和嗜热脂肪芽孢杆 菌（Bacillus stearothermophilus)、类杆菌属物种（Bacteroides sp.)(如脆弱类杆 菌（Bacteroides fragilis)、巴尔通体菌属物种（Bartonella sp.)(如杆状巴尔通体 (Bartonella bacilliformis)和汉赛巴尔通体（Bartonella henselae)、双歧杆菌属物种 (Bifidobacterium sp·)、鲍特菌属物种（Bordetella sp.)(如百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis)、副百日咳鲍特菌（Bordetella parapertussis)和支气管败血性鲍特菌 (Bordetella bronchiseptica)、包柔氏螺旋体菌属物种（Borrelia sp.)(如回归热包柔 体（Borrelia recurrentis)和伯氏包柔体（Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属物种 (Brucella sp.)(如流产布鲁氏菌（Brucella abortus)、犬布鲁氏菌（Brucella canis)、 羊布鲁氏菌（Brucella melintensis)和猪布鲁氏菌（Brucella suis))、伯克霍尔德氏 菌属物种（Burkholderia sp.)(如类鼻疽伯克氏菌（Burkholderia pseudomallei)和 洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia)、弯曲菌属物种（Campylobacter sp.)(如空 肠弯曲菌（Campylobacter jejuni)、大肠弯曲菌（Campylobacter coli)、红嘴区鸟弯曲 菌（Campylobacter lari)和胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus))、二氧化碳嗤纤维 菌属物种（Capnocytophaga sp.)、人心杆菌（Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原 体（Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae)、婴| 鶴热衣 原体（Chlamydophila psittaci)、梓檬酸杆菌属物种（Citrobacter sp.)、贝纳柯克斯 体（Coxiella burnetii)、棒状杆菌属物种（Corynebacterium sp.)(比如，牛棒杆菌 (Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒杆菌（Corynebacterium jeikeum)和棒状杆菌 (Corynebacterium))、梭菌属物种（Clostridium sp.)(如产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)、又艮难梭菌（Clostridium difficile)、肉毒梭菌（Clostridium botulinum) 和破伤风梭菌（Clostridium tetani))、侵蚀艾肯菌（Eikenella corrodens)、肠杆菌 属物种（Enterobacter sp.)(如产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes)、成团肠杆 菌（Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)和大肠杆菌 (Escherichia coli)、包括条件性大肠杆菌（opportunistic Escherichia coli)，如肠产 毒性大肠杆菌（enterotoxigenic E. Coli)，肠侵袭性大肠杆菌（enteroinvasive E. Coli)、 肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic E.Coli)、肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli)、肠聚集性大肠杆菌（enteroaggregative E. Coli)和尿道致病性大肠杆菌 (uropathogenic E. coli)肠球菌属物种（Enterococcus sp.)(如幾肠球菌（Enterococcus faecalis)和屎肠球菌（Enterococcus faecium)埃立克体属物种（Ehrlichia sp.)(如 恰菲埃里希氏体（Ehrlichia chafeensia)和犬艾利希体（Ehrlichia canis))、猪丹毒 杆菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、优杆菌属物种（Eubacterium sp·)、土拉热弗 朗西氏菌（Francisella tularensis)、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum)、阴道 嗜血杆菌（Gardnerella vaginalis)、麻疫孪生球菌（Gemella morbillorum)、嗜血杆菌 属物种（Haemophilus sp.)(如流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血 杆菌（Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血杆菌（Haemophilus aegyptius)、副流感嗜血杆 菌（Haemophilus parainfluenzae)、溶血嗜血杆菌（Haemophilus haemolyticus)矛口副 溶血嗜血杆菌（Haemophilus parahaemolyticus)、螺杆菌属物种（Helicobacter sp.) (如幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌（Helicobacter cinaedi)和芬 纳尔螺杆菌（Helicobacter fennelliae))、金氏金氏菌（Kingella kingii)、克雷伯氏 菌属物种（Klebsiella sp.)(如克雷白氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)、肉芽肿杆 菌（Klebsiella granulomatis)和产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)，乳酸杆菌属 物种（Lactobacillus sp·)、产单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes)、问号钩端 螺旋体（Leptospira interrogans)、嗜肺性军团病杆菌（Legionella pneumophila)、问 号钩端螺方定体（Leptospira interrogans)、消化链球菌属物种（Peptostreptococcus sp.)、粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis)、摩根氏菌属物种（Morganella sp.)、 动弯杆菌属物种（Mob iluncus sp.)、细球菌属物种（Micrococcus sp.)、分枝杆菌属 种（Mycobacterium sp.)(如麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)、胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare)、 鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis)和海分 枝杆菌（Mycobacterium marinum))、支原菌属物种（Mycoplasm sp.)(如肺炎支 原体（Mycoplasma pneumoniae)、人支原体（Mycoplasma hominis)和生殖器支原 体（Mycoplasma genitalium))、诺卡氏菌属物种（Nocardia sp.)(如星形诺卡氏菌 (Nocardia asteroides)、盖尔森基兴诺卡氏菌（Nocardia cyriacigeorgica)和巴西诺 卡氏菌（Nocardia brasiliensis))、奈瑟氏菌属物种（Neisseria sp.)(如淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis))、出血败血性巴 斯德氏菌（Pasteurella multocidla)、类志贺氏邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides)、 普雷沃氏菌属物种（Prevotella sp.)、卩卜啉单胞菌属物种（Porphyromonas sp.)、产黑 素普雷沃氏菌（Prevotella melaninogenica)、变形菌属物种（Proteus sp.)(如普通 变形菌（Proteus vulgaris)和奇异变形菌（Proteus mirabilis))、普罗威登斯菌属物 种（Providencia sp.)(如产喊普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗 威登斯菌（Providencia rettgeri)和斯氏普罗威登斯菌（Providencia stuartii))、绿 胺假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、短小棒状杆菌（Propionibacterium acnes)、 马红球菌（Rhodococcus equi)、立克次体属物种（Rickettsiasp.)(如立克氏立克 次体（Rickettsia rickettsii)、螨立克次体（Rickettsia akari)和普氏立克次体 (Rickettsia prowazekii)、恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi)(学名：恙虫病立克 次体（Rickettsia tsutsugamushi)和地方性斑疫伤寒立克次氏体（Rickettsia typhi)、 红球菌属物种（Rhodococcus sp.)、粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcescens)、嗜麦芽寡 养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)、沙门氏菌属物种（Salmonella sp.)(如 肠道沙门氏菌（Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi)、副伤寒沙 门氏菌（Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙 门菌（Salmonella cholerasuis)和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)、沙雷 氏菌属物种（Serratia sp.)(如粘质沙雷氏菌（Serratia marcesans)和液化沙雷氏菌 (Serratia liquifaciens)、志贺氏菌属物种（Shigella sp.)(如志贺氏痢疾菌（Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌（Shigella flexneri)、波伊德志贺氏菌（Shigella boydii) 和宋内志贺菌（Shigella sonnei)、葡萄球菌属物种（Staphylococcus sp.)(如金黄色酿 胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)、 溶血葡萄球菌（Staphylococcus hemolyticus)、腐生性葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus)、链球菌属物种（Streptococcus sp.)(如肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)(例如氯霉素-抗性血清型4肺炎链球菌（chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、壮观霉素-抗性血清型6B炎链球菌 (spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、链霉素-抗 性血清型 9V 月市炎链球菌（streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、红霉素-抗性血清型 14肺炎链球菌（erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣-抗性血清型 14肺炎链球菌（optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎链球菌 (rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、四环素-抗 性血清型 19F 肺炎链球菌（tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)、青霉素-抗性血清型 19F 肺炎链球菌（penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)和甲氧节氨啼陡-抗性血清型23F肺炎链球菌 (trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、氣霉素-抗 性血清型 4 月市炎链球菌（chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae，e 4 Streptococcus pneumoniae)、壮观霉素-抗性血清型6B肺炎链球菌 (spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、链霉素-抗 性血清型 9V 月市炎链球菌（streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣-抗性血清型14肺炎链球菌（optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎链球菌 (rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、青霉素-抗性血清 型 19F 月市炎链球菌（penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 或甲氧节氨啼陡-抗性血清型23F肺炎链球菌（trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)、变形链 球菌（Streptococcus mutans)、化胺性链球菌（Streptococcus pyogenes)、A 组链球菌 (Group A streptococci)、化胺性链球菌（Streptococcus pyogenes)、B 组链球菌属（Group B streptococci)、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)、C 组链球菌属（Group C streptococci)、咽颊炎链球菌（Streptococcus anginosus)、类马链球菌（Streptococcus equismilis)、D 组链球菌（Group D streptococci)、牛链球菌（Streptococcus bovis)、 F 组链球菌（Group F streptococci)和咽颊炎链球菌（Streptococcus anginosus)、G 组链球菌（Group G streptococci)、鼠咬热螺旋体（Spirillum minus)、念珠状链杆菌 (Streptobacillus moniliformi)、密螺旋体属物种（Treponema sp.)(如品他病密螺旋体 (Treponema carateum)、细弱密螺旋体（Treponema petenue)、苍白密螺旋体（Treponema pallidum)和地方性密螺旋体（Treponema endemicum)、Tropheryma whippelii、解服支原 体（Ureaplasma urealyticum)、韦荣球菌属物种（Veillonella sp·)、弧菌属物种（Vibrio sp.)(如霍乱弧菌（Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus)、嗜盐弧 菌（Vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus)、嗜盐弧菌（Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)、拟态弧菌（Vibrio mimicus)、霍氏弧菌 (Vibrio hollisae)、河流弧菌（Vibrio fluvialis)、梅氏弧菌（Vibrio metchnikovii)、 海鱼弧菌（Vibrio damsela)和弗氏弧菌（Vibrio furnisii)、耶尔森氏菌属物种 (Yersinia sp.)(如小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌 (Yersiniapestis)和假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis)和嗜麦芽黄单 胞菌（Xanthomonas maltophilia)等。
[0024] 接触：直接的物理结合；包括固体形式和液体形式两种。例如，接触可在体外发 生于试剂（如革兰氏染料中的一个成分）和样品之间，所述样品位于溶液中或一个表面上 (例如在显微镜载玻片上）。
[0025] 脱色剂（decolorizing agent):可从样品（利如用初级染剂和捕获剂染色的样 品）中基本上去除初级染剂（例如结晶紫）和捕获剂（例如碘）复合物的试剂，比如从革 兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌的细胞壁中基本上去除所述复合物的试剂。在一个例子 中，这样的复合物称作结晶紫-碘（cv-ι)复合物。在具体的例子中，脱色剂与含有初级染 剂-捕获剂复合物（例如cv-ι复合物）的样品一起孵育一段时间，所述时间足以从革兰氏 阴性细胞而非革兰氏阳性细胞中基本上去除（比如去除至少90%、至少95%或至少99% 的）所述复合物（且从而去除初级染剂）。
[0026] 脱色制剂（decolorizing formulation):组合物，包括一种或多种脱色剂。慢作 用脱色剂是需要更长的时间才能从革兰氏阴性细胞中去除初级染剂-捕捉剂（例如，CV-I) 复合物（且从而去除初级染剂，例如，结晶紫）的一种试剂，所述时间例如是，允许自动化设 备完成脱色步骤、从而维持该自动化设备在完成所需脱色后将要发生另外的脱色作用（比 如使革兰氏阳性细菌脱色）之前控制脱色步骤的完结的能力所需的时间。在一些例子中， 缓慢脱色的时间是至少30秒、至少60秒、至少120秒、或至少220秒，例如1至4分钟，以 从革兰氏阴性细菌中去除初级染剂-捕获剂（例如CV-Ι)复合物。慢作用脱色剂的例子包 括1，2_丙二醇和乙二醇。快作用脱色剂是仅需要短时间就能从革兰氏阴性细胞中去除初 级染剂-捕获剂（例如CV-Ι)复合物（且从而去除初级染剂，例如结晶紫）的一种试剂，所 述时间比如少于20秒、少于15秒、少于10秒、或少于5秒，例如1至2秒、1至5秒、1至10 秒或1至20秒。例子包括乙醇、丙酮、二乙醚、甲醚，乙醇与丙酮的共混物，以及乙醇与其他 醇类如甲醇或2-丙醇的共混物。
[0027] 检测：为确定一种因素（如信号或具体生物，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌）是 否存在，例如具体细菌。在一些例子中，这可进一步包括定量。例如，本文公开的方法和试 剂在具体例子中的应用允许报告出较强和较弱的信号。
[0028] 革兰氏阳性细菌：在革兰氏染色过程中染色深蓝色或紫色的细菌，且具有厚的肽 聚糖层。革兰氏阳性细菌的例子包括：
[0029]
【权利要求】
1. 一种对样品进行革兰氏染色的方法，包括： 使所述样品与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初 级染剂-捕获剂复合物的条件下接触，其中所述样品事先已与初级染剂和捕获剂接触过。
2. 权利要求1的方法，进一步包括： 使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁染色的 条件下接触； 使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触； 使所述样品与复染剂在足以将脱过色的革兰氏阴性细菌染色的条件下接触；或 其组合。
3. 权利要求2的方法，其中复染色在脱色的至少30秒后进行。
4. 权利要求1的方法，其中使所述样品与所述慢作用脱色制剂接触达至少30秒。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，进一步包括将所述样品加载到自动染色装置中。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中使用压缩空气完成所述样品与慢作用脱色制剂 的接触。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述慢作用脱色制剂包含慢作用脱色剂和快作 用脱色剂。
8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述脱色制剂包含至少80%的所述慢作用脱色 剂和不超过20%的所述快作用脱色剂。
9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述慢作用脱色制剂包含1，2-丙二醇或乙二 醇。
10. 权利要求1-9中任一项的方法，其中从已知或怀疑有细菌感染的受试者获得所述 样品。
11. 权利要求1-9中任一项的方法，其中所述样品是环境样品或食物样品。
12. 权利要求1-11中任一项的方法，其中已经、同时或将要对所述样品在相同或分开 的载玻片上进行一种或多种另外的测定法。
13. 权利要求12的方法，其中使所述样品与针对特定细菌的一种或多种抗体接触、与 另一种染剂接触、或其组合接触。
14. 权利要求1-13中任一项的方法，其中通过自动化染色装备实施所述方法。
15. 权利要求14的方法，其中所述自动化染色装备是Ventana NexES Special Stainer 或 Ventana BenchMark Special Stainer。
16. 权利要求1-15中任一项的方法，其中所述方法进一步包括检测革兰氏阳性细菌或 革兰氏阴性细菌。
17. 权利要求1-16中任一项的方法，其中所述方法是计算机执行的方法。
18. -种使用自动染色装备在载玻片上对细菌进行革兰氏染色的方法，其中所述自动 染色装备包含： 用于放置多个载玻片的转盘式传送工具，每个上面都有待染色的样品 用于以预定速度旋转所述转盘式传送工具的工具；和 在所述转盘式工具旋转期间指引和控制各个试剂加载到所述载玻片和样品上的工具， 且其中所述方法包括： 将结晶紫试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述 结晶紫试剂接触； 将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻 片洗去结晶紫试剂； 将碘试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述碘试 剂接触； 将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻 片洗去碘试剂； 同时或分开地将慢作用脱色制剂和复染剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上；并 将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻 片洗去混合试剂。
19. 一种组合物，包含至少80%的一种或多种慢作用脱色剂和不超过20%的一种或多 种快作用脱色剂。
20. 权利要求19的组合物，其中所述一种或多种慢作用脱色剂包含1，2-丙二醇、乙二 醇或其混合物。
21. -种用于自动化革兰氏染色的试剂盒，包含： 在第一容器中的慢作用脱色制剂。
22. 权利要求21的试剂盒，进一步包含： 在第二容器中的初级染色制剂； 在第三容器中的捕获剂；和 在第四容器中的复染色制剂。
23. 权利要求21或22的试剂盒，其中所述容器配置为加载到自动化染色装置中。
24. 权利要求23的试剂盒，其中所述自动化染色装置是Ventana NexES Special Stainer 或 Ventana BenchMark Special Stainer。
25. 权利要求21-24中任一项的试剂盒，还包含一个或多个显微镜载玻片。
26. 权利要求21-25中任一项的试剂盒，还包含一个或多个对照载玻片。
27. 权利要求21-26中任一项的试剂盒，其中将所述各个容器的内容物按照以下次序 接触样品：第二容器、第三容器、第一容器、第四容器；其中可同时使用两个容器的内容物。
【文档编号】C12Q1/04GK104245955SQ201380020183
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年3月19日
【发明者】C.维德纳, C.康诺利 申请人:文塔纳医疗系统公司