一种快速区分转基因植物及其产品的dna检测方法
【专利摘要】一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，其特点是，包括如下步骤：（1）提取并纯化已知转基因植物的DNA；（2）选取转基因构建中已知DNA序列，设计PCR反应一端的引物；（3）设计简并寡聚核苷酸；（4）设计PCR反应；（5）用凝胶电泳分离PCR产物，得出与每个转基因植物相应的特异的凝胶电泳图谱；（6）提取待检测的植物或其产品的DNA，扩增转基因及毗邻序列，获得凝胶电泳图谱；（7）比较待检测的植物或其产品与已知转基因植物的凝胶电泳图谱。本发明提供了一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，该方法利用转基因随机插入宿主基因组这一特性，鉴定转基因产品的来源。
【专利说明】—种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过生物DNA检测技术检测转基因产品的来源，尤其是一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法。
【背景技术】
[0002]随着基因技术在农业生产上的广泛应用，市场上出现了大量的转基因生物制品，造成了公众难以避免的担心和焦虑。因此准确地检测转基因制品，追溯其来源，已成为转基
因产品安全管理的重要一步。
[0003]现有转基因制品的检测方法主要是检测转基因本身。例如；检测抗昆虫转基因玉米就是检测转基因苏云金杆菌毒素基因是否存在(Bacillus thuringiensis, cry gene)；检测转基因抗草甘磷大豆就是检测转基因5-烯醇内酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因是否存在(Agrobacterium sp,EPSP gene)。虽然这样的检测方法能有效地区分转基因和非转基因产品，但它并不能区分几个类似的转基因产品。例如:它无法区分两个不同实验室构建的转基因抗昆虫玉米，因为转基因都是苏云金杆菌毒素基因；它亦无法区分具有相同转基因的不同物种，如转基因抗草甘磷大豆油和转基因抗草甘磷玉米油，因为转基因同为细菌的EPSP基因；它也无法区分一个实验室生产的几个转基因品系，因为这些品系具有同样的转基因，只是转基因的嵌入位点不同而已。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，能够快速、准确的鉴定出转基因产品的来源。
[0005]一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，其特别之处在于，包括如下步骤:
[0006](1)提取并纯化已知转基因植物的DNA ；
[0007](2)选取转基因构建中已知DNA序列，设计PCR反应一端的引物；
[0008](3)设计简并寡聚核苷酸，作为PCR反应另一端未知序列的引物；
[0009](4)设计PCR反应，并扩增转基因及毗邻未知DNA序列；
[0010](5)用凝胶电泳分离PCR产物，得出与每个转基因植物相应的特异的凝胶电泳图谱；
[0011](6)提取待检测的植物或其产品的DNA，用与步骤(4)中相同的方法扩增转基因及毗邻序列，然后按步骤(5)的方法获得凝胶电泳图谱；
[0012](7)比较待检测的植物或其产品与已知转基因植物的凝胶电泳图谱，以此确定未知转基因产品的来源。
[0013]步骤(7)中通过比较未知和已知植物或其产品的PCR凝胶电泳图谱来鉴定未知转基因产品的来源，如果图谱相同则说明待检测的植物或产品与已知转基因相同，如果图谱均不相同则说明待检测的植物或产品与已知转基因不同。[0014]步骤(2)和(3)中PCR反应一端的引子是用转基因的已知序列设计的，而另一端的引子是由简并多聚核苷酸构成的。
[0015]步骤(5)中将所有需检测的已知转基因植物的DNA用上述PCR方法扩增，并建立其凝胶电泳图谱标准文库。
[0016]更进一步的，将未知转基因产品的DNA用同样的方法扩增，并与已知转基因植物凝胶电泳图谱标准文库比较，如果图谱相同则说明待检测的植物或其产品与已知转基因相同，如果图谱不相同则说明待检测的植物或其产品与已知转基因不同。
[0017]本发明提供了一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，该方法利用转基因随机插入宿主基因组这一特性，鉴定转基因产品的来源。该方法的理论基础坚实，实验方法简单，且无需大型设备，从而为检验转基因产品提供了一个崭新的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]附图1为本发明方法的流程图；
[0019]附图2为用巢式PCR扩增与转基因毗邻的宿主DNA序列；
[0020]附图3为用巢式PCR扩增转基因嵌入位点的上游序列和下游序列；
[0021]附图4为转基因农杆菌Ti质粒构建图，在该图中，与Left Border (LB)紧邻的
3个寡聚核苷酸引子Knl、Kn2、Κη3被用作扩增转基因下游序列的巢式PCR引子；与RightBorder (RB)紧邻的3 个寡聚核苷酸引子Kn4、Kn5、Kn6被用作扩增转基因上游序列的巢式PCR引子；
[0022]附图5为巢式PCR产物电泳图谱，用巢式PCR扩增4个独立产生的转基因紫花品系(Lnl、Ln2、Ln3、Ln4)DNA ;第二次和第三次巢式PCR分别用2nd和Slrd表示；根据设计，第二次巢式PCR产物比第三次巢式PCR产物略大，它们分别用箭头标出。
【具体实施方式】
[0023]现有转基因植物产品检测方法的缺陷在于，它们仅检测外源转基因本身，而无法区分基于同样转基因的不同产品。虽然根据转基因和毗邻的DNA序列，我们可以将转基因产品进一步细分，但它需要DNA测序仪等大型仪器和专门技术。本发明设计了一种方法，仅用分子生物学实验室常用的PCR仪，即可将转基因产品细分。
[0024]本发明公布了一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法。在生物的基因工程中，不论是农杆菌Ti质粒导入的或是基因枪钨弹射入的转基因，都是随机插入宿主基因组的，因此对于每一个独立产生的转基因植物，其转基因的毗邻DNA序列都是特异的。本发明利用已知农杆菌Ti质粒DNA序列，设计DNA聚合酶链式反应一端的引子(Polymerasechain reaction, PCR, primer),用简并多聚核苷酸作为PCR反应的另一端的引子,用PCR扩增转基因和宿主毗邻基因组DNA，并由此得出每一个转基因生物的特异PCR产物电泳图谱，这个电泳图谱就成为该转基因植物及其产品的检测标志。
[0025]本发明对转基因产品的检测做出了重大改进。它不再拘泥于检测转基因本身，而是将转基因的检测与转基因毗邻序列的检测综合在一起，用PCR—端的引子提取已知转基因的序列信息，用简并多聚核苷酸提取转基因毗邻未知DNA序列信息；用PCR产物的凝胶电泳图谱，将转基因与的转基因嵌入位点的特异结合展示出来。由于每一个转基因植物中转基因与宿主DNA的结合是随机的，因此它们的PCR凝胶电泳图谱亦将是特异的，这成为我们鉴定或追溯转基因产品的基础和根据。
[0026]具体试验过程如下:(I)提取并纯化已知转基因植物DNA ；(2)选取转基因构建中的已知DNA序列，设计PCR反应一端的引物；(3)设计简并多聚核苷酸，作为PCR反应另一端未知序列的引物；(4)设计PCR反应并扩增转基因及毗邻未知DNA序列；(5)用凝胶电泳分离PCR产物，得出与每个转基因植物相应的特异的凝胶电泳图谱；(6)提取未知转基因产品DNA，用相同的方法扩增转基因及毗邻序列，并比较未知转基因产品与已知转基因植物的凝胶电泳图谱，以此确定未知转基因产品的来源。
[0027]如下表1:巢式PCR扩增转基因毗邻序列的产物列表。分别用三次巢式PCR扩增四个独立产生的转基因紫花苜蓿品系，电泳图谱见图5。此表仅列可能是转基因毗邻序列的PCR产物，它们的特征是第二次巢式PCR产物略大于第三次巢式PCR产物
[0028]
【权利要求】
1.一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)提取并纯化已知转基因植物的DNA； (2)选取转基因构建中已知DNA序列，设计PCR反应一端的引物； (3)设计简并寡聚核苷酸，作为PCR反应另一端未知序列的引物； (4)设计PCR反应，并扩增转基因及毗邻未知DNA序列； (5)用凝胶电泳分离PCR产物，得出与每个转基因植物相应的特异的凝胶电泳图谱； (6)提取待检测的植物或其产品的DNA，用与步骤(4)中相同的方法扩增转基因及毗邻序列，然后按步骤(5)的方法获得凝胶电泳图谱； (7)比较待检测的植物或其产品与已知转基因植物的凝胶电泳图谱，以此确定未知转基因产品的来源。
2.如权利要求1所述的一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，其特征在于:步骤(7)中通过比较未知和已知植物或其产品的PCR凝胶电泳图谱来鉴定未知转基因产品的来源，如果图谱相同则说明待检测的植物或产品与已知转基因相同，如果图谱均不相同则说明待检测的植物或产品与已知转基因不同。
3.如权利要求1所述的一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，其特征在于:步骤(2)和(3)中 PCR反应一端的引子是用转基因的已知序列设计的，而另一端的引子是由简并多聚核苷酸构成的。
4.如权利要求1所述的一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，其特征在于:步骤(5)中将所有需检测的已知转基因植物的DNA用上述PCR方法扩增，并建立其凝胶电泳图谱标准文库。
5.如权利要求4所述的一种快速区分转基因植物及其产品的DNA检测方法，其特征在于:将未知转基因产品的DNA用同样的方法扩增，并与已知转基因植物凝胶电泳图谱标准文库比较，如果图谱相同则说明待检测的植物或其产品与已知转基因相同，如果图谱不相同则说明待检测的植物或其产品与已知转基因不同。
【文档编号】C12Q1/68GK103757120SQ201410030823
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】计皖, 李健, 柳金凤 申请人:宁夏林业研究所股份有限公司