与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用。本发明提供一种动物分子标记，具体涉及牛DNMT3a基因片段的克隆及作为分子标记的应用。所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示，在第278位有1个A278-G278碱基突变，导致肉质性状出现多态性。
【专利说明】与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物分子标记领域，具体地说，涉及一种与肉牛肉质性状相关的DNMT3a基因作为分子标记的应用。
【背景技术】
[0002]肉牛业作为我国畜牧业的重要组成部分，近年来发展迅速，对于促进生态农业的发展及国民膳食结构的改善等方面发挥了积极作用。肉牛的肉质性状是重要的经济性状，随着人们生活水平的提高,对肉质的要求越来越高,对优质牛肉的需求也越来越大，因此优质牛肉带来的可观经济效益决定了肉牛育种中肉质性状选择的重要性。肉质性状作为一种重要的经济性状，由于无法活体测定受到传统育种方法的限制，因此许多研究从分子标记入手对肉质性状进行探索。根据发达国家经济发展的一般规律，当国民经济收入达到人均1000美元的水平时，牛肉消费将趋于旺盛。随着我国人均国民收入的稳步提升，牛肉消费已经在我国大城市呈风靡之势，国产高档牛肉消费市场也不断升温，并进入到五星级餐饮企业。[0003]表观遗传学(Epigenetics)的概念最初由著名生物学家ConradH.Waddington在1942年提出。表观遗传是指DNA序列不发生变化的情况下，基因表达在细胞增殖和发育过程中发生了能稳定传递的可遗传的改变。传统育种中的表型可以剖分为遗传和环境两部分，说明表型是由基因和环境共同控制的，而表观遗传正如在基因和环境之间搭了一座桥梁，补充了“中心法则”的内容，说明核酸并不是存储遗传信息的唯一载体，表观遗传信息可通过调控基因的表达时间、空间位置和表达方式等方面影响生物机体的各种生理反应。因此，许多用DNA序列变异不能解释的现象可能通过表观遗传学的研究找到答案。
[0004]目前，表观遗传学已经成为生命科学研究的前沿和热点，其研究涉及到了多个领域，在疾病和肿瘤方面，通过表观遗传学研究其致病机理等有了更为成熟的认识。随着研究的进一步深入，发现表观遗传学在其他方面，比如环境因子中的营养状况，年龄及生长性能等都有一定的影响。但研究主要是表观相关基因的表达量的变化引起的相关基因的表观的改变，而对于表观遗传学相关基因本身的多态性研究还不多见。肉质性状作为一种重要的经济性状，从遗传学水平上对肉质性状的研究已经有很多了，控制肉质性状的主效基因也研究地比较清楚，然而从表观遗传的水平上研究肉质的报道还非常少。肉质性状是受遗传、营养、屠宰后处理等多因素共同控制的，尤其是在营养方面，可以通过改变一些饲料成分调节，比如说饲料中添加叶酸，可以影响甲基化的程度，从而调控主效基因的表达；在牛育肥的过程中，通过增加能量饲料，可能会影响到基因表达的变化，从而对肉质产生一定的影响，因此肉牛肉质性状很有可能受表观遗传的调控。
[0005]DNA甲基化是表观遗传调控中最重要的形式之一。本发明选择一个在催化DNA甲基化过程中起重要作用的基因一DNA甲基化转移酶3a (DNMT3a)作为对象，牛DNMT3a基因定位在11号染色体上(NCBI序列登陆号AC_000168.1), DNMT3a基因大约有40kb长，包含20个外显子，19内含子，编码909个氨基酸。针对该基因的SNP位点，在13个肉牛群体(西门塔尔、蒙贝利亚、挪威红牛、安格斯牛、夏洛莱牛、利木赞牛、和牛、复州牛、鲁西牛、渤海黑牛、新疆褐牛、三河牛以及和牛与复州牛杂交一代商品名雪龙黑牛)中进行多态性分析，同时，利用收集到的肉质性状记录进行SNP关联分析，探索表观遗传学相关基因与肉质性状的关系，以期利用遗传学手段对肉牛肉质性状的不断改良与提高提供准确的科学方法。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用。
[0007]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与肉牛肉质性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，在第278位有I个A278-G278碱基突变，导致肉质性状出现多态性；
[0008]所述肉质性状为排酸前/后胴体重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上脑盖厚。
[0009]进一步地，所述碱基突变的位点为Intronl 1-A27G位点，位于DNMT3a基因第11内含子第27bp处。
[0010]本发明还提供了一种前述分子标记的制备方法，其是以牛基因组DNA为模板，设计引物，进行PCR扩增，目的在于扩增包含Intronll-A27G位点的DNA序列。
[0011]本发明还提供了用于扩增前述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下:
[0012]正向引物:5’-agcactggattgaggtcctg-3’ ；
[0013]反向引物:5’-gccaagtctgtcctttgagg-3’。
[0014]本发明还提供了前述分子标记在肉牛标记辅助选择中的应用。
[0015]进一步地，所述应用具体为利用前述分子标记对肉牛进行基因分型，选择基因型为AA的肉牛进行育种。作为优选，所述肉牛为雪龙黑牛。
[0016]本领域的技术人员都清楚，有很多分析方法可用于检测基因序列中是否存在该单核苷酸多态性。这些技术包括但并不限于:DNA测序、杂交测序、DNA芯片、PCR-RFLP,PCR-SSCP、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱(DHPLC )、飞行质谱法等。
[0017]作为一个实施例，所述对肉牛进行基因分型的方法如下:
[0018](I)提取待测肉牛的基因组DNA ;
[0019](2)以基因组DNA为模板，运用飞行质谱法对所述分子标记进行基因分型，确定待测肉牛的基因型为AA或AG或GG。
[0020]本发明的有益效果在于:
[0021]本发明首次发现雪龙黑牛群体中DNMT3a基因内含子11中存在一个SNP分子标记(A/G)，在雪龙黑牛群体共141头个体中经过关联分析得出该SNP对排酸前/后胴体重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上脑盖影响显著(P〈0.05)，AA型表现为优势基因型。本发明提供的标记可靠，可用于对肉牛群体肉质性状的筛选。本发明为优质肉牛分子育种提供理论依据和遗传基础，有助于进一步加快肉牛育种进程，具有极其重大的应用价值和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为DNMT3a内含子11基因池的PCR扩增胶图；由左至右分别为:样品池I至样品池5的DNMT3a内含子11的PCR扩增条带、Marker ;其中，Marker:由上到下600，500，400，300，200，IOObp0
[0023]图2为DNMT3a内含子11基因池的测序峰图(丨处为突变位点)。
[0024]图3为部分基因组DNA提取琼脂糖检测电泳结果；由左至右分别为:雪龙黑牛样品I至样品9的基因组DNA电泳条带。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026]实施例1SNP的发现和分型
[0027]采用DNA池筛查SNPs，随机选取雪龙黑牛10个样品进行DNA混池，提取冻精基因组DNA，将其浓度配成大约IOOng/μ 1，用紫外分光光度计检测其浓度并达到均一，每个个体取10 μ I共100 μ I的DNA混合构建成DNA池。
[0028]对混池DNA中DNMT3a内含子11的一段序列进行PCR扩增。
[0029]PCR扩增的引物对如下:
[0030]正向引物F:5，-agcactggattgaggtcctg-3，；
[0031]反向引物R:5’ -gccaagtctgtcctttgagg-3’。
[0032]上述引物对针对的靶序列如下所示:SEQ ID N0.1
[0033]PCR反应体系见表1。
[0034]表1PCR反应体系
[0035]
【权利要求】
1.一种与肉牛肉质性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDN0.1所示，在第278位有I个A278-G278碱基突变，导致肉质性状出现多态性； 所述肉质性状为排酸前/后胴体重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上脑盖厚。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述碱基突变的位点为Intronl 1-A27G位点，位于DNMT3a基因第11内含子第27bp处。
3.权利要求1所述的分子标记的制备方法，其特征在于，以牛基因组DNA为模板，设计引物，进行PCR扩增，目的在于扩增包含Intronll-A27G位点的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下: 正向引物:5，-agcactggattgaggtcctg-3’ ；
反向引物:5’ -gccaagtctgtcctttgagg-3’。
5.一种用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下: 正向引物:5，-agcactggattgaggtcctg-3’ ； 反向引物:5’ -gccaagtctgtcctttgagg-3’。
6.权利要求1所述的分子标记在肉牛标记辅助选择中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体为利用权利要求1所述的分子标记对肉牛进行基因分型，选择基因型为AA的肉牛进行育种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肉牛为雪龙黑牛。
【文档编号】C12Q1/68GK103911375SQ201410120565
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】王雅春, 刘轩, 俞英, 张毅, 张旭, 吴蒙, 徐仙洲 申请人:中国农业大学