一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，包括如下步骤：（1）提取胡杨的总RNA，反转录为cDNA，作为PCR的模板；（2）使用大于等于9个内参基因，设计特异性引物在实时荧光定量PCR仪上选择SYBR?Green法进行反应，得到CT值；（3）通过公式和geNorm软件的PV值计算功能，以0.15为阈值确定内参基因的数目；（4）根据所需数目选择内参基因，和目的基因一起进行qRT-PCR反应，将得到的CT值通过geNorm软件，计算得到目的基因在每个处理下用多内参基因组合得到相对表达量的变化数据。本发明所述方法与传统的单一内参基因方法相比，能够得到更为可靠的结论。
【专利说明】—种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及一种使用多内参基因组合进行实时荧光定量PCR研究胡杨抗逆关键基因的方法。
【背景技术】
[0002]胡杨(Populus euphratica Oliv)是第三世纪残余的古老树种,在6000多万年前就在地球上生存，分布于亚非荒漠地区，并且是唯一能在世界最大的流动性沙漠，塔克拉玛干沙漠，生长并建群的乔木树种，长期适应干旱盐碱和温差剧烈变化的极端沙漠环境，进化出了完整的应对干旱、盐碱、低温等逆境因素的机制，因此胡杨含有丰富的抗逆性基因资源等待开发，并且随着2013年中国科学家完成其全基因组测序工作，对于林木抗逆性机理等基础性研究，和定向培育抗逆造林新品种等应用型研究，胡杨将发挥十分重要的作用。
[0003]具有高度灵敏性、特异性和稳定性的实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)是目前应用最广泛的用于研究基因表达模式的分子生物学检测方法之一，它能检测极低含量的mRNA以及基因在不同样品间细微的表达差异变化，因此qRT-PCR常用来筛选有研究价值的关键基因。然而准确而又可信的实验结果受起始材料的用量、RNA的纯度、酶的效率、内参基因(内源对照)的选择等多方面因素的影响，其中稳定表达的内参基因是最为关键的如提条
件。目前最常用的计算方法2_“CT或者使用单一内参基因，目的基因表达量
的变化高度依赖于所使用的单一内参基因表达量的变化。广泛的实验数据表明内参基因可能受不同组织、不同发育阶段或不同环境胁迫等条件的影响而稳定性发生变化，所以单一内参可能导致有偏差不准确甚至错误的实验结果。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法。
[0005]一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，包括如下步骤:
[0006](1)对胡杨进行抗逆胁迫处理，并分别提取胡杨在每个处理下的总RNA，反转录为cDNA，作为PCR的模板；
[0007](2)使用多个胡杨常用的内参基因，所述内参基因数量大于等于9，设计特异性引物在实时荧光定量PCR仪上选择SYBR Green法进行反应，得到CT值；
[0008](3)通过geNorm软件的PV值计算功能，以0.15为阈值确定所选择的实验条件下需要的内参基因的数目η;
[0009](4)根据所需数目选择内参基因，将选择的η个内参基因和目的基因一起进行qRT-PCR反应，将得到的CT值通过geNorm软件，得到目的基因在每个处理下相对表达量的
变化数据，采用以下公式计算:
[0010]
【权利要求】
1.一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)对胡杨进行抗逆胁迫处理，并分别提取胡杨在每个处理下的总RNA，反转录为cDNA，作为PCR的模板； (2)使用多个胡杨常用的内参基因，所述内参基因数量大于等于9，设计特异性引物在实时荧光定量PCR仪上选择SYBR Green法进行反应，得到CT值； (3)通过geNorm软件的PV值计算功能，以0.15为阈值确定所选择的实验条件下需要的内参基因的数目η ； (4)根据所需数目选择内参基因，将选择的η个内参基因和目的基因一起进行qRT-PCR反应，将得到的CT值通过geNorm软件，得到目的基因在每个处理下相对表达量的变化数据，采用以下公式计算:
2.根据权利要求1所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:步骤(2)和(4)的PCR体系均为20 μ 1，加样顺序及用量依次为10 μ 12X SuperReal PreMixPlus, 0.3μ 120μΜ 正向引物，0.3μ 120μΜ 正向引物，I μ I cDNA 模板，2μ 150XROXReference Dye Δ , 6.4 μ I RNase-free ddH20，反应程序为 95°C 15min,95°C 20s60°C 60s循环数45，得到溶解曲线。
3.根据权利要求1或2所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:步骤(2)中使用的内参基因为16个，分别为18S、60S、Actin、Cpn60P、EF1 a、eIF_5A、GAPDH、GII a , HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB 和 UBQ, 16 个候选的内参基因引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 32所示。
4.根据权利要求3所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:所述环境胁迫处理为脱落酸处理、寒冷处理、脱水处理、干旱处理、短期盐胁迫处理或长期盐胁迫处理中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:目的基因为PeSCL7，其引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:37~SEQ ID N0:38所示，抗胁迫处理方式为脱水处理O、1、3、6、9、12小时，步骤(4 )中n=3，3个内参基因分别为HIS、60S 和 Actin0
6.根据权利要求4所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:步骤(4)中目的基因为 PePYLl，PeSCOF-1、PeCDPK6、PeCHYI 或PeWRKYl，其中 PePYLl，PeSCOF-1引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:33~SEQ ID N0:36所示。
7.根据权利要求4所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:所述抗逆胁迫处理包括如下步骤:在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，四月上旬种植于直径60cm高50cm的圆盆内，每盆3_5棵,土壤以沙土为主,含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高60~80cm的时候进行抗逆胁迫处理，所述抗逆胁迫处理方法为以下方法中的一种或几种:A、脱落酸处理:对胡杨小苗叶面喷洒200mMABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为12个小时，未喷洒ABA溶液的植株作为对照； B、冷处理，将胡杨小苗连盆放在4-6°C的环境下，室温约25°C度下的植株作为对照，保持对照和处理的光照一致，处理时间12h ； C、脱水处理，从土壤中避免损伤根 的前提下取出小苗，洗尽根部泥土直接裸露放置于湿度70%、温度25°C的环境下，正常生长的植株作为对照，处理时间12h ； D、干旱处理；通过浇水量控制相对土壤水分含量75%-10%，呈六个梯度，一直充分浇水的植株RSMC约75%-70%的作为对照，处理时间为一个月； E、短期盐处理，将土壤中移出未伤根的胡杨苗洗尽根部泥土后水培于含有350mMNaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作为对照，每隔6h换一次水避免根部缺氧，处理时间12h ； F、长期盐胁迫，对长有胡杨苗的盆浇200mMNaCl水溶液2L，之后维持正常不含盐溶液的水25d ； 其中，每种处理6个梯度，每个梯度三盆植物材料；在ΑΒΑ、冷、脱水、短期盐胁迫处理1、3、6、9、12小时的时候，在长期盐胁迫5、10、15、20、25天的时候，干旱胁迫控制RSMC —个月后，取20-30片同一位置的叶子速冻于液氮中，然后再放置于_80°C保存材料。
8.根据权利要求1所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于:在提取胡杨叶片的总RNA操作过程的最后一步用DNA酶消化，用Thermo NanoDrop2000测RNA的浓度，通过测OD26tZOD28tl以及0D26(i/0D23(i两个值来检测RNA的纯度，用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的质量，Agilent2100微流控芯片检测RNA是否降解，每个处理每个梯度取1.8 μ g的RNA逆转录为cDNA，将得到的cDNA稀释8_10倍，保持终浓度的一致。
【文档编号】C12Q1/68GK103898223SQ201410138911
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】尹伟伦, 夏新莉, 王厚领 申请人:北京林业大学