饲用乳酸菌发酵培养基、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种饲用乳酸菌发酵培养基，其配方为：葡萄糖37～43g/L、玉米浆干粉47～55g/L、鱼粉42～48g/L、K2HPO4·3H2O0～2g/L、乙酸钠8～12g/L、柠檬酸三铵2～4g/L、MgSO4·7H2O0～0.5g/L、MnSO4·H2O0.25～0.5g/L和吐温-801～2ml/L，pH值7.0～7.2，以水配制。本发明还提供了所述发酵培养基的制备方法及其应用。采用廉价易得的玉米浆干粉和鱼粉替代MRS培养基中的氮源成分，并对培养基的组分进行了优化，所得培养基的价格仅为MRS培养基价格的40％，通过对发酵初始pH值和发酵温度的优化，同时采用流加NaOH溶液的方式解除乳酸的反馈抑制作用，使菌体密度较普通发酵显著提高，使得发酵液中活菌数高达1010CFU/ml以上，实现了饲用乳酸菌的高密度发酵，提高了比生产率和产品质量。
【专利说明】饲用乳酸菌发酵培养基、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种饲用乳酸菌发酵培养基、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]长期以来，饲料中添加抗生素对畜牧业发展起到了巨大的推动作用，但随着饲用抗生素的广泛应用，造成动物肠道菌群失调、二重感染以及细菌耐药性等不良反应也逐渐凸显，给养殖业和饲料工业带来严重威胁。因此，开发无毒副作用、无污染和无残留的抗生素替代品，对畜牧业意义重大。乳酸菌作为猪消化道内优势菌群，在国内外已受到了广泛的关注和研究。研究表明，猪肠道内至少存在上百种乳酸菌，且其能调节肠道内正常菌群的共性比例，维持肠道生态系统的平衡。
[0003]由于乳酸菌不能合成许多氨基酸、维生素及相关生长因子，因此导致其营养要求及培养条件复杂，目前所用的MRS培养基原料昂贵，特别是培养基中氮源成分，其价格占MRS培养基总价格的80%以上。
[0004]乳酸菌在生长过程中会产生乳酸等有机酸类代谢产物，使培养基的pH值不断下降，从而抑制乳酸菌的生长，导致乳酸菌细胞活性下降甚至菌体死亡。因此，采用传统的生产工艺，菌种质量得不到保证，而且生产成本高。
[0005]高密度发酵是指应用一定的培养技术或装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较常规培养方法显著 提高。利用高密度培养技术实现微生物的高密度发酵，可以提高单位体积培养液中菌体的浓度，提高比生产率、降低生产成本。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种廉价易得的饲用乳酸菌发酵培养基。
[0007]本发明的另一目的是提供所述发酵培养基的制备方法。
[0008]本发明的再一目的是提供所述发酵培养基在饲用乳酸菌高密度发酵中的应用。
[0009]为了实现本发明目的，本发明的一种饲用乳酸菌发酵培养基，所述发酵培养基的配方为:葡萄糖37~43g/L、玉米浆干粉47~55g/L、鱼粉42~48g/L、K2HPO4.3H200~2g/L、乙酸钠 8 ~12g/L、柠檬酸三铵 2 ~4g/L, MgSO4.7H200 ~0.5g/L、MnS04.H2O0.25 ~0.5g/L和吐温-801~2ml/L，pH值7.0~7.2，以水配制。
[0010]其中，所述玉米浆干粉的制备方法为:将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，干粉中蛋白质含量不低于42 %。
[0011]所述鱼粉的制备方法为:鱼肉经去油、脱水和粉碎加工即得鱼粉，鱼粉中蛋白质含量不低于55%。
[0012]鉴于上述两种原料价格低廉，具有替代MRS中氮源成分的潜力。
[0013]本发明还提供所述发酵培养基的制备方法，包括以下步骤:
[0014]I)分别称取除玉米浆干粉和鱼粉以外的各组分，用蒸馏水溶解；[0015]2)称取玉米浆干粉和鱼粉加入步骤I)配制的溶液中，补足蒸馏水，纱布过滤；
[0016](3)调 pH 值至 7.0 ~7.2 ;
[0017](4) 121 °C，灭菌15min，冷却至室温，即得。
[0018]本发明进一步提供所述发酵培养基在饲用乳酸菌高密度发酵中的应用。
[0019]本发明中涉及的饲用乳酸菌包括但不限于植物乳杆菌等。例如，植物乳杆菌BM-1能够产生细菌素，对致病菌单增李斯特菌具有较强的抑制作用，在饲料工业中具有应用潜力。
[0020]具体地，所述植物乳杆菌的高密度发酵方法包括以下步骤: [0021](I)将冷冻保藏的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，于37°C培养12小时，连续活化三代后，作为种子液；
[0022](2)将上述配制好的发酵培养基的初始pH值调至6.2~6.6 ;
[0023](3)按2v/v%的接种量将步骤(1)的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中振荡
培养；
[0024](4)当发酵培养基的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养基的pH值稳定在5.8~6.0,发酵过程中不通气，于30~34°C,转速IOOrpm条件下发酵14~16小时，获得的植物乳杆菌发酵液中活菌数达101(lCFU/ml以上。
[0025]本发明采用廉价易得的玉米浆干粉和鱼粉替代MRS培养基中的氮源成分，并对培养基的组分进行了优化，所得培养基的价格仅为MRS培养基价格的40%，通过对发酵初始PH值和发酵温度的优化，同时采用流加NaOH溶液的方式解除乳酸的反馈抑制作用，使菌体密度较普通发酵显著提高，使得发酵液中活菌数高达101(lCFU/ml以上，实现了饲用乳酸菌(例如植物乳杆菌)的高密度发酵，提高了比生产率和产品质量。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0027]以下实施例中使用的玉米浆干粉购自上海西王淀粉糖有限公司，其制备方法为:将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，干粉中蛋白质含量不低于42%。
[0028]以下实施例中使用的鱼粉购自荣成利泰鱼粉有限公司，其制备方法为:鱼肉经去油、脱水和粉碎加工即得鱼粉，鱼粉中蛋白质含量不低于55%。
[0029]以下实施例中涉及的植物乳杆菌BM-1分离自福建黄花鱼干制品，由中国农业大学食品科学与营养工程学院乳酸菌遗传与代谢工程实验室提供。
[0030]实施例1植物乳杆菌BM-1的高密度发酵培养基及发酵方法
[0031]1、植物乳杆菌BM-1发酵培养基的组分及含量
[0032]高密度发酵培养基的组分及含量如下:葡萄糖40g/L、玉米浆干粉52g/L、鱼粉 45g/L、K2HPO4.3H201g/L、乙酸钠 10g/L、柠檬酸三铵 4g/L、MgSO4.7Η200.25g/L、MnSO4.H2O0.375g/L 和吐温 _801ml/L，pH 值 7.0 ~7.2，以水配制。
[0033]2、培养基的配制方法
[0034](I)按含量分别称取除玉米浆干粉和鱼粉以外的各组分，用蒸馏水溶解；
[0035](2)称取玉米浆干粉和鱼粉加入步骤⑴中的溶液，补足蒸馏水，纱布过滤；[0036](3)调节 pH 值至 7.0 ~7.2 ;
[0037](4) 121?，灭菌 15min。
[0038]3、高密度发酵方法
[0039](I)将冷冻保藏的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，于37°C培养12小时，连续活化三代后，作为种子液；
[0040](2)调节配制的发酵培养基的初始pH值为6.6 ;
[0041](3)以2v/v%的接种量将步骤(1)的种子液接种于步骤(2)的培养基中振荡培养;
[0042](4)当培养液的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养液的pH值稳定在5.8~6.0，从而解除乳酸的反馈抑制作用。发酵过程中不通气，于30°C，转速IOOrpm条件下发酵14~16小时，获得植物乳杆菌BM-1活菌数达1.32X1010CFU/ml以上的发酵液。
[0043]实施例2植物乳杆菌BM-1的高密度发酵培养基及发酵方法
[0044]1、植物乳杆菌BM-1发酵培养基的组分及含量
[0045]高密度发酵培养基的组分及其含量如下:葡萄糖43g/L、玉米浆干粉47g/L、鱼粉42g/L、乙酸钠 10g/L、柠檬酸三铵 2g/L、MnSO4.H2O0.375g/L 和吐温 _801ml/L，pH 值 7.0 ~
7.2，以水配制。
[0046]2、培养基的配制方法
[0047](I)按含量分别称取除玉米浆干粉和鱼粉以外的各组分，用蒸馏水溶解；
[0048](2)称取玉米浆干粉和鱼粉加入步骤(1)中的溶液，补足蒸馏水，纱布过滤；
[0049](3)调节 pH 值至 7.0 ~7.2 ;
[0050](4) 121°C，灭菌 15min。
[0051]3、高密度发酵方法
[0052](I)将冷冻保藏的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，于37°C培养12小时，连续活化三代后，作为种子液；
[0053](2)调节配制的发酵培养基的初始pH值为6.2 ;
[0054](3)以2v/v%的接种量将步骤(1)的种子液接种于步骤(2)的培养基中振荡培养;
[0055](4)当培养液的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养液的pH值稳定在
5.8~6.0， 从而解除乳酸的反馈抑制作用。发酵过程中不通气，于34°C，转速IOOrpm条件下发酵14~16小时，获得植物乳杆菌BM-1活菌数达1.05X1010CFU/ml以上的发酵液。
[0056]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种饲用乳酸菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的配方为:葡萄糖37~43g/L、玉米浆干粉 47 ~55g/L、鱼粉 42 ~48g/L、K2HPO4.3H200 ~2g/L、乙酸钠 8 ~12g/L、柠檬酸三铵 2 ~4g/L、MgSO4.7Η200 ~0.5g/L、MnS04.Η200.25 ~0.5g/L 和吐温-801 ~2ml/L，pH值7.0~7.2，以水配制。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述玉米浆干粉的制备方法为:将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，干粉中蛋白质含量不低于42%。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述鱼粉的制备方法为:鱼肉经去油、脱水和粉碎加工即得鱼粉，鱼粉中蛋白质含量不低于55%。
4.权利要求1-3任一项所述发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)分别称取除玉米浆干粉和鱼粉以外的各组分，用蒸馏水溶解； 2)称取玉米浆干粉和鱼粉加入步骤I)配制的溶液中，补足蒸馏水，纱布过滤； (3)调pH值至7.0~7.2 ; (4)121 °C，灭菌15min，冷却至室温，即得。
5.权利要求1-3任一项所述发酵培养基在饲用乳酸菌高密度发酵中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述饲用乳酸菌包括但不限于植物乳杆菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵方法包括以下步骤: (1)将冷冻保藏的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，于37°C培养12小时，连续活化三代后，作为种子液； (2)将权利要求1-3任一项所述发酵培养基的初始pH值调至6.2~6.6 ; (3)按2v/v%的接种量将步骤(1)的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中振荡培养; (4)当发酵培养基的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养基的pH值稳定在.5.8~6.0，发酵过程中不通气，于30~34°C，转速IOOrpm条件下发酵14~16小时，获得的植物乳杆菌发酵液中活菌数达101(lCFU/ml以上。
【文档编号】C12R1/25GK104004679SQ201410199313
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】郝彦玲, 张柱 申请人:中国农业大学