一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，属于生物发酵【技术领域】，所述发酵工艺以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活化、种子罐培养和发酵罐发酵步骤制备含抗菌肽的枯草芽孢杆菌发酵液，菌株活化采用三次YPD平板划线法，以保证菌株种子处于最适状态，产生较多抗菌肽；活化后的菌株经过两级种子罐培养，保证菌株种子处于最优状态；经种子罐培养后的菌液进行发酵罐发酵，发酵过程中采用的发酵培养基成分简单、成本低廉，进而降低了整个发酵工艺的成本；发酵工艺中采用特定的培养和发酵控制条件，发酵时间缩短了25%~45%，本发明得到的发酵液效价与基础培养基培养所得发酵液相比，提高了45%~50%。
【专利说明】一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发酵工艺，适用于抗菌肽的生产，尤其适用于利用枯草芽孢杆菌生产抗菌肽，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，属于生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMP)是指生物体内经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫防御系统的一部分，此类蛋白通常具有耐酸性能好、抗菌谱广、水溶性好、安全性高以及作用快速等特点，其作用机理是，抗菌肽通过蛋白凝聚效应，将其末端尾链直接插入细菌细胞膜，打孔形成一个通道，使细菌内容物外泄导致细菌死亡。与抗生素相比，抗菌肽具有不杀灭益生菌、提高机体免疫机能、无副作用、无残留、无耐药性、可长期使用等优点。因抗菌肽所具有的特性，可将其广泛应用于多个领域。在医药方面，抗菌肽可平衡和调节炎症应答并激发抗原特异性的适应性免疫反应。在食品防腐方面，抗菌肽作为一种天然防腐剂，毒副作用小，可降解，使用安全，甚至对人体有保健作用。在饲料添加剂方面，抗生素的滥用已极大地影响了我国畜牧业的发展，而抗菌肽恰恰解决了其耐药残留、抗药性、环境污染等问题，是一种环保型高效饲料添加剂。
[0003]在以上这些领域，我国与国际上一些发达国家相比技术上和普及方面还有不小的差距，并且由于各方面的原因，我国目前尚未全面禁止饲用抗生素，而多数抗生素饲料添加剂为国外已淘汰或将被禁用的产品，这些问题无疑将影响我国畜产品在国际上的声誉，并造成巨大的经济损失。由于微生物生产抗菌肽有成本低、无毒害、周期短等明显优点，加快抗菌肽的研究已势在必行，但当前研究主要集中在乳酸菌，而乳酸菌产生的抗菌肽存在着耐热性差、抗菌谱窄等缺陷。枯草芽孢杆菌产的抗菌肽抑菌谱广、稳定性高，开始引起国内外研究人员的注意，而对于其发酵产生抗菌肽的工业化生产，目前仍然面临成本过高，过程复杂，产物效价较低等问题。
【发明内容】
[0004]本发明所解决的技术问题是针对现有技术的不足，以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过菌体活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵液制备等步骤制备抗菌肽成品，其培养基成分和发酵步骤简单、生产成本较低且产品效价较高。
[0005]为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案:一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，包括如下依次进行的步骤:菌株活化、种子罐培养和发酵罐发酵。
[0006]—种优化方案，所述种子罐培养包括一级种子罐培养；
所述一级种子罐培养包括以下步骤:将YPD培养基装入摇瓶中，灭菌，然后接入菌株活化步骤中得到的活化后的枯草芽孢杆菌单菌落，于35~37°C恒温振荡培养16~20 h，转速为160~200 rpm，得到摇瓶发酵液。
[0007] 另一种优化方案，所述种子罐培养还包括二级种子罐培养；所述二级种子罐培养包括以下步骤:在发酵罐中装入发酵培养基，发酵培养基的加入量占发酵罐总体积的50%，发酵罐灭菌冷却后，将一级种子罐培养步骤中得到的摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的0.5%~1.5%进行接种，得到枯草芽孢杆菌菌液。
[0008]再一种优化方案，所述二级种子罐培养步骤中接种的发酵控制条件为:温度为35~37°C，转速为300~400 rpm，时间为16~20 h，接种前起始pH值为7.8，通风量为1: 0.5。
[0009]进一步的优化方案，所述发酵罐发酵包括以下步骤:将种子罐培养步骤中得到的枯草芽孢杆菌菌液以3%~8%的体积比接种于发酵罐中，在35~37°C、120~180 rpm条件下持续24~48 h，接种前起始pH值为7.8，通风量为1: 0.6，末期升温10~15°C，维持 2h0
[0010]再进一步的优化方案，所述菌株活化采用三次YPD平板划线法；
第一次Yro平板划线包括以下步骤:取枯草芽孢杆菌冻干粉加入Yro培养基中，待完全溶解后在YPD平板上进行第一次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24 h ；
第二次YPD平板划线包括以下步骤:第一次YPD平板划线培养后挑取单菌落在另一Yro平板上进行第二次划线，整个过程保持无菌，划线后的Yro平板置于37°C温箱中培养24h ；
第三次YPD平板划线包括以下步骤:第二次YPD平板划线培养后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第三次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h0
[0011]更进一步的优化方案，所述Yro培养基，其有效成分包括:酵母膏、蛋白胨和葡萄糖；
所述YPD培养基采用以下步骤制备:
(1)取酵母膏10份和蛋白胨20份溶于900份纯化水中，121°C灭菌20min；
(2)取葡萄糖20份溶于100份纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌后混入步骤(1)所得的溶液中，得到YPD培养基。
[0012]一种优化方案，所述YPD培养基，其有效成分包括:麦麸汁、玉米粉、酵母膏和葡萄糖；
所述YPD培养基采用以下步骤制备:
(1)取麦麸汁IOg和玉米粉IOg加入纯化水300mL，煮沸后糊化I~2h，补足挥发的水
分；
(2)取酵母膏IOg溶于600mL纯化水中，121°C灭菌20min；
(3)取葡萄糖20g溶于IOOmL纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌；
(4)将步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中所得的溶液混合均匀，得到YPD培养基。
[0013]另一种优化方案，所述发酵培养基，其有效成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰；
所述发酵培养基采用以下步骤制备:取葡萄糖1.6份、蛋白胨1.45份、磷酸氢二钾0.2份、氯化钠0.08份、无水氯化钙0.05份和硫酸锰0.002份，加入纯化水至100份，将pH值调节至7.2~7.4,115°C灭菌30 min。[0014]再一种优化方案，所述发酵培养基，其有效成分包括:葡萄糖、土豆汁、干酪素、维生素B1、硫酸锰和脯氨酸；
所述发酵培养基的制备包括以下步骤:取葡萄糖1.6g、土豆汁1.58g、干酪素0.34g、维生素B1 0.0Olg、硫酸锰0.002g和脯氨酸0.2g，加入纯化水至IOOmL,将pH值调节至7.2~
7.4,115°C灭菌 30min。
[0015]本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点:以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活化、种子罐培养和发酵罐发酵步骤制备含抗菌肽的枯草芽孢杆菌发酵液，菌株活化采用三次YPD平板划线法，以保证菌株种子处于最适状态，产生较多抗菌肽；活化后的菌株经过两级种子罐培养，保证菌株种子处于最优状态；经种子罐培养后的菌液进行发酵罐发酵，发酵过程中采用的发酵培养基成分简单、成本低廉，进而降低了整个发酵工艺的成本；发酵工艺中采用特定的培养和发酵控制条件，发酵时间缩短了 25%~45%，经过对发酵液中抗菌肽效价的检测证明，本发明中得到的发酵液中抗菌肽效价较高，发酵液效价与基础培养基培养所得发酵液相比，提高了 45%~50%。
[0016]本发明所述发酵方法成本低廉，后续处理简单，所得抗菌肽效价较高且大幅度缩短了生产时间。
[0017]下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]附图1是本发明 实施例中抗菌肽的效价检测。
【具体实施方式】
[0019]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0020]实施例1，一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，包括如下步骤:
I)菌株活化
①第一次划线:取Ig枯草芽孢杆菌冻干粉加入IrnLYro培养基中，待完全溶解后在YPD平板上进行第一次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
②第二次划线:挑取单菌落在另一YPD平板上进行第二次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
③第三次划线:第二次划线后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第三次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h。
[0021]YPD平板划线进行三次，以保证菌株种子处于最适状态，产生较多抗菌肽。
[0022]所述YPD培养基，其有效成分包括:酵母膏、蛋白胨和葡萄糖。
[0023]所述YH)培养基的制备包括以下步骤:(I)取酵母膏IOg和蛋白胨20g溶于900mL纯化水中，121°C灭菌20min ; (2)取葡萄糖20g溶于IOOmL纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌后混入步骤(1)所得的溶液中。[0024]所述YPD平板的制备包括以下步骤:在所述YPD培养基内加入2g琼脂制成YPD固体培养基，将所述YPD固体培养基倒于培养皿中即制成YPD平板。
[0025]2) —级种子罐培养
将上述Yro培养基装入摇瓶中，灭菌，然后接入步骤I)中得到的活化后的枯草芽孢杆菌单菌落，于35°c恒温振荡培养16h，转速为160rpm，得到摇瓶发酵液。
[0026]3) 二级种子罐培养
IOOL发酵罐中装入50L发酵培养基，发酵罐灭菌冷却后，将步骤2)中得到的摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的0.5%进行接种，发酵控制条件为:温度为35°C，转速为300rpm，时间为16h，起始pH值为7.8，通风量为1:0.5，得到枯草芽孢杆菌菌液。
[0027]所述发酵培养基， 其有效成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰。
[0028]所述发酵培养基的制备包括以下步骤:取葡萄糖1.6g、蛋白胨1.45g、磷酸氢二钾0.2g、氯化钠0.08g、无水氯化钙0.05g和硫酸锰0.002g，加入纯化水至IOOmL，将PH调节至
7.2 ~7.4，115°C灭菌 30min。
[0029]4)发酵罐发酵
将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌菌液以3%的体积比接种于发酵罐中，所述发酵罐的体积为2m3，在35°C、120rpm条件下持续24h，起始PH值为7.8，通风量为1:0.6，末期升温
10。。，维持 2h。
[0030]实施例2，一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，包括如下步骤:
I)菌株活化
①第一次划线:取Ig枯草芽孢杆菌冻干粉加入IrnLYro培养基中，待完全溶解后在YPD平板上进行第一次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
②第二次划线:挑取单菌落在另一YPD平板上进行第二次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
③第三次划线:第二次划线后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第三次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h。
[0031]YPD平板划线进行三次，以保证菌株种子处于最适状态，产生较多抗菌肽。
[0032]所述YPD培养基，其有效成分包括:酵母膏、蛋白胨和葡萄糖。
[0033]所述YH)培养基的制备包括以下步骤:(I)取酵母膏IOg和蛋白胨20g溶于900mL纯化水中，121°C灭菌20min ; (2)取葡萄糖20g溶于IOOmL纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌后混入步骤(1)所得的溶液中。
[0034]所述YPD平板的制备包括以下步骤:在所述YPD培养基内加入2g琼脂制成YPD固体培养基，将所述YPD固体培养基倒于培养皿中即制成YPD平板。
[0035]2) —级种子罐培养
将上述Yro培养基装入摇瓶中，灭菌，然后接入步骤I)中得到的活化后的枯草芽孢杆菌单菌落，于36°c恒温振荡培养18h，转速为ISOrpm，得到摇瓶发酵液。
[0036]3) 二级种子罐培养
100L发酵罐中装入50L发酵培养基，发酵罐灭菌冷却后，将步骤2)中得到的摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的1.0%进行接种，发酵控制条件为:温度为36°C，转速为350rpm，时间为18h，起始pH值为7.8，通风量为1:0.5，得到枯草芽孢杆菌菌液。
[0037]所述发酵培养基，其有效成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰。
[0038]所述发酵培养基的制备包括以下步骤:取葡萄糖1.6g、蛋白胨1.45g、磷酸氢二钾
0.2g、氯化钠0.08g、无水氯化钙0.05g和硫酸锰0.002g，加入纯化水至IOOmL,将PH调节至7.2 ~7.4，115°C灭菌 30min。 [0039]4)发酵罐发酵
将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌菌液以5%的体积比接种于发酵罐中，所述发酵罐的体积为2m3，在36°C、150rpm条件下持续36h，起始PH值为7.8，通风量为1:0.6，末期升温12。。，维持 2h。
[0040]实施例3，一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，包括如下步骤:
I)菌株活化
①第一次划线:取Ig枯草芽孢杆菌冻干粉加入IrnLYro培养基中，待完全溶解后在YPD平板上进行第一次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
②第二次划线:挑取单菌落在另一YPD平板上进行第二次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
③第三次划线:第二次划线后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第三次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h。
[0041]YPD平板划线进行三次，以保证菌株种子处于最适状态，产生较多抗菌肽。
[0042]所述YPD培养基，其有效成分包括:酵母膏、蛋白胨和葡萄糖。
[0043]所述YH)培养基的制备包括以下步骤:(I)取酵母膏IOg和蛋白胨20g溶于900mL纯化水中，121°C灭菌20min ; (2)取葡萄糖20g溶于IOOmL纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌后混入步骤(1)所得的溶液中。
[0044]所述YPD平板的制备包括以下步骤:在所述YPD培养基内加入2g琼脂制成YPD固体培养基，将所述YPD固体培养基倒于培养皿中即制成YPD平板。
[0045]2) —级种子罐培养
将上述Yro培养基装入摇瓶中，灭菌，然后接入步骤I)中得到的活化后的枯草芽孢杆菌单菌落，于37°c恒温振荡培养20h，转速为200rpm，得到摇瓶发酵液。
[0046]3) 二级种子罐培养
100L发酵罐中装入50L发酵培养基，发酵罐灭菌冷却后，将步骤2)中得到的摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的1.5%进行接种，发酵控制条件为:温度为37°C，转速为400rpm，时间为20h，起始pH值为7.8，通风量为1:0.5，得到枯草芽孢杆菌菌液。
[0047]所述发酵培养基，其有效成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰。
[0048]所述发酵培养基的制备包括以下步骤:取葡萄糖1.6g、蛋白胨1.45g、磷酸氢二钾
0.2g、氯化钠0.08g、无水氯化钙0.05g和硫酸锰0.002g，加入纯化水至IOOmL,将PH调节至7.2 ~7.4，115°C灭菌 30min。
[0049]4)发酵罐发酵
将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌菌液以5%的体积比接种于发酵罐中，所述发酵罐的体积为2m3，在37°C、180rpm条件下持续48h，起始PH值为7.8，通风量为1:0.6，末期升温15。。，维持 2h。
[0050]实施例4，一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，包括如下步骤:
I)菌株活化
①第一次划线:取Ig枯草芽孢杆菌冻干粉加入IrnLYro培养基中，待完全溶解后在YPD平板上进行第一次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
②第二次划线:挑取单菌落在另一YPD平板上进行第二次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h ；
③第三次划线:第二次划线后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第三次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h。
[0051]YPD平板划线进行三次，以保证菌株种子处于最适状态，产生较多抗菌肽。
[0052]所述YPD培养基，其有效成分包括:麦麸汁、玉米粉、酵母膏和葡萄糖。
[0053]所述YPD培养基的制备包括以下步骤:(I)取麦麸汁IOg和玉米粉IOg加入纯化水300mL，煮沸后糊化I~2 h，补足挥发的水分；(2)取酵母膏IOg溶于600mL纯化水中，121°C灭菌20min ；(3) 取葡萄糖20g溶于IOOmL纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌；(4)将步骤(1)、步骤(2 )和步骤(3 )中所得的溶液混合均匀，得YPD培养基。
[0054]所述YPD平板的制备包括以下步骤:在所述YPD培养基内加入2g琼脂制成YPD固体培养基，将所述YPD固体培养基倒于培养皿中即制成YPD平板。
[0055]2) —级种子罐培养
将上述Yro培养基装入摇瓶中，灭菌，然后接入步骤I)中得到的活化后的枯草芽孢杆菌单菌落，于37°c恒温振荡培养20h，转速为200rpm，得到摇瓶发酵液。
[0056]3) 二级种子罐培养
100L发酵罐中装入50L发酵培养基，发酵罐灭菌冷却后，将步骤2)中得到的摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的1.5%进行接种，发酵控制条件为:温度为37°C，转速为400rpm，时间为20h，起始pH值为7.8，通风量为1:0.5，得到枯草芽孢杆菌菌液。
[0057]所述发酵培养基，其有效成分包括:葡萄糖、土豆汁、干酪素、维生素B1、硫酸锰和脯氨酸。
[0058]所述发酵培养基的制备包括以下步骤:取葡萄糖1.6g、土豆汁1.58g、干酪素
0.34g、维生素B1 0.0Olg、硫酸锰0.002g和脯氨酸0.2g，加入纯化水至IOOmL,将PH调节至
7.2 ~7.4，115°C灭菌 30min。
[0059]4)发酵罐发酵
将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌菌液以5%的体积比接种于发酵罐中，所述发酵罐的体积为2m3，在37°C、180rpm条件下持续48h，起始PH值为7.8，通风量为1:0.6，末期升温15。。，维持 2h。
[0060]药敏试验:取实施例中I中得到的发酵液进行离心，取上清液作为试验组1，取实施例2中得到的发酵液进行离心，取上清液作为试验组2，取实施例3中得到的发酵液进行离心，取上清液作为试验组3，取实施例4中得到的发酵液进行离心，取上清液作为试验组4，在YH)培养基中接种枯草芽孢杆菌进行发酵，所得发酵液进行离心，取上清液作为对照组。[0061]药敏试验检测培养基，其有效成分包括:蛋白胨、酵母膏、氯化钠、葡萄糖和琼脂。
[0062]所述药敏试验检测培养基的制备包括以下步骤:取蛋白胨lg、酵母膏0.5g、氯化钠lg、葡萄糖0.5g和琼脂1.5g，蒸馏水定容至IOOmL，充分溶解，115°C高压灭菌30min。
[0063]试验方法:将高压灭菌后的药敏试验检测培养基置于50~55°C的水浴锅保温； 在超净工作台内，取IOOmL无菌的药敏试验检测培养基，加入IOOuL检测菌菌液，所述
检测菌为大肠杆菌，摇匀，得到含菌检测培养基；
吸取混合均匀的含菌检测培养基10mL，在90mm培养皿底内均匀摊布，放置在超净工作台上使其凝固。
[0064]待含菌检测培养基凝固后用灭菌的打孔器打孔，所述打孔器的孔径为2.7mm,在培养皿底部上均匀的打七个上样孔，将上样孔内的含菌检测培养基挑出。
[0065]用记号笔在培养皿底部为七个上样孔做好标记，所述上样孔包括一个阴性对照上样孔、一个阳性抗生素对照上样孔和五个待测样品上样孔，所述阴性对照上样孔内放置无菌水，所述阳性抗生素对照上样孔内放置阳性抗生素，所述待测样品上样孔内分别放置试验组1、试验组2、试验组3、试验组4和对照组的待测样品，用微量移液器分别吸取5uL待测样品加入各自对应的上样孔中，并将培养皿置于37°C培养箱中培养16~18 h。
[0066]培养结果显示按本发明所提供的发酵工艺所得的发酵液和抗菌肽成品制剂均具有较好的抑菌作用。用游标卡尺测定抑菌圈直径，计算抑菌效价。结果如图1所示，可见本发明的4个实施例中的发 酵液均有较高的抑菌效价，与对照组相比，其效价分别提高了47%、45%、50%和 49%。
[0067]其中，采用实施例3所述的发酵工艺制备的发酵液具有较高的抑菌效价，其采用的YPD培养基的有效成分包括酵母膏、蛋白胨和葡萄糖，成分简单且菌株种子液培养效果好，其采用的发酵培养基的有效成分包括葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰，且蛋白胨和葡萄糖的含量较低，成本低廉、粘度低，发酵效果好且有利于后续提取，采用三次Yro平板划线法进行菌株活化，经试验验证可保证菌株种子处于最适状态，产生较多抗菌肽，种子罐培养过程中首先采用摇瓶培养法在37°c恒温振荡培养20h、转速为200rpm的条件下，得到摇瓶发酵液，然后在发酵罐中装入体积占发酵罐容积50%的发酵培养基，将摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的1.5%进行接种，发酵控制条件为:温度为37°C，转速为400rpm，时间为20h，起始pH值为7.8，通风量为1: 0.5，得到枯草芽孢杆菌菌液，将枯草芽孢杆菌菌液以5%的体积比接种于发酵罐中，在37°C、180rpm条件下持续48h，起始PH值为7.8，通风量为1: 0.6，末期升温15°C，维持2h，得到抗菌肽发酵液，所述接种量及控制条件为经大量试验验证得出的最优值，获得的抗菌肽发酵液的效价与对照组相比可提高50%,发酵效果好，且步骤简便易操作，发酵时间短。
[0068]实施例4中采用的YPD培养基的有效成分包括麦麸汁、玉米粉、酵母膏和葡萄糖，其中麦麸汁和玉米粉在制备过程中需经过煮沸糊化，原料价格低廉，同样可保证较好的菌株种子液培养效果，其采用的发酵培养基的有效成分包括葡萄糖、土豆汁、干酪素、维生素B1、硫酸锰和脯氨酸，成分简单、原料价格低廉，且具有较好的发酵效果，采用与实施例3相同的工艺步骤、接种量和控制条件，同样可获得效价较高的抗菌肽发酵液，本实施例中获得的抗菌肽发酵液的效价与对照组相比可提高49%。
[0069]本发明所提供的发酵工艺，在保证菌体代谢产物有极高抑菌效价的基础上，缩短了发酵时间， 降低了发酵成本。
【权利要求】
1.一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述发酵工艺包括如下依次进行的步骤:菌株活化、种子罐培养和发酵罐发酵。
2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述种子罐培养包括一级种子罐培养； 所述一级种子罐培养包括以下步骤:将YPD培养基装入摇瓶中，灭菌，然后接入菌株活化步骤中得到的活化后的枯草芽孢杆菌单菌落，于35~37°C恒温振荡培养16~20 h，转速为160~200 rpm，得到摇瓶发酵液。
3.如权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述种子罐培养还包括二级种子罐培养； 所述二级种子罐培养包括以下步骤:在发酵罐中装入发酵培养基，发酵培养基的加入量占发酵罐总体积的50%，发酵罐灭菌冷却后，将一级种子罐培养步骤中得到的摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的0.5%~1.5%进行接种，得到枯草芽孢杆菌菌液。
4.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述二级种子罐培养步骤中接种的发酵控制条件为:温度为35~37°C，转速为300~400 rpm,时间为16~20 h，接种前起始pH值为7.8，通风量为1:0.5。
5.如权利要求1-4其中之一所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述发酵罐发酵包括以下步骤:将种子罐培养步骤中得到的枯草芽孢杆菌菌液以3%~8%的体积比接种于发酵罐中，在35~37°C、120~180 rpm条件下持续24~48 h，接种前起始pH值为7.8，通风量 为1:0.6，末期升温10~15 °C，维持2 h。
6.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述菌株活化采用三次YPD平板划线法； 第一次YPD平板划线包括以下步骤:取枯草芽孢杆菌冻干粉加入YPD培养基中，待完全溶解后在YPD平板上进行第一次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24 h ； 第二次YPD平板划线包括以下步骤:第一次YPD平板划线培养后挑取单菌落在另一Yro平板上进行第二次划线，整个过程保持无菌，划线后的Yro平板置于37°C温箱中培养24h ； 第三次YPD平板划线包括以下步骤:第二次YPD平板划线培养后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第三次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37°C温箱中培养24h0
7.如权利要求2或6所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述YPD培养基，其有效成分包括:酵母膏、蛋白胨和葡萄糖； 所述YPD培养基采用以下步骤制备: (1)取酵母膏10份和蛋白胨20份溶于900份纯化水中，121°C灭菌20min； (2)取葡萄糖20份溶于100份纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌后混入步骤(1)所得的溶液中，得到YPD培养基。
8.如权利要求2或6所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述YPD培养基，其有效成分包括:麦麸汁、玉米粉、酵母膏和葡萄糖； 所述YPD培养基采用以下步骤制备:(1)取麦麸汁IOg和玉米粉IOg加入纯化水300mL，煮沸后糊化I~2h，补足挥发的水分； (2)取酵母膏IOg溶于600mL纯化水中，121°C灭菌20min； (3)取葡萄糖20g溶于IOOmL纯化水中，经0.22 μ m滤器过滤除菌； (4)将步骤(1)、步骤(2)和步骤(3 )中所得的溶液混合均匀，得到YPD培养基。
9.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述发酵培养基，其有效成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰； 所述发酵培养基采用以下步骤制备:取葡萄糖1.6份、蛋白胨1.45份、磷酸氢二钾0.2份、氯化钠0.08份、无水氯化钙0.05份和硫酸锰0.002份，加入纯化水至100份，将pH值调节至7.2~7.4,115°C灭菌30 min。
10.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，其特征在于:所述发酵培养基，其有效成分包括:葡萄糖、土豆汁、干酪素、维生素B1、硫酸锰和脯氨酸； 所述发酵培养基的制备包括以下步骤:取葡萄糖1.6g、土豆汁1.58g、干酪素0.34g、维生素B1 0.0Olg、硫酸锰0.002g和脯氨酸0.2g，加入纯化水至IOOmL,将pH值调节至7.2~.7.4,115°C灭菌 30mi n。
【文档编号】C12P21/06GK103966297SQ201410235210
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】郭海岩, 刘刚, 王茂超, 王兴业, 张淑兰, 王亮, 郭莎莎, 王雅静, 王红军 申请人:山东仙普爱瑞科技股份有限公司