提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1及其制备以及利用其编码的蛋白的制作方法

提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1及其制备以及利用其编码的蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明属于新基因的制备，特别是指一种提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1及其制备以及利用其编码的蛋白。以5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATG?GCTCAGTTCAAAG-3’为上游引物5ZWASS，以5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCAC?TTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’为下游引物3ZWASS，以棉花植株根中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。本发明填补了现有技术存在的在植物中未见到精氨酸琥珀酸合成酶的相关分子生物学研究报道的空白。具有基因GhASS1在重组菌中的表达提高了重组菌在盐胁迫下的生长活力，增强了菌株的耐盐能力的优点。
【专利说明】提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSI及其制备以及利用其 编码的蛋白

【技术领域】
[0001] 本发明属于新基因的制备，特别是指一种提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSI及 其制备以及利用其编码的蛋白。

【背景技术】
[0002] 尿素循环（Urea Cycle)，又称为鸟氨酸循环，是第一个被发现的环式代谢途径。在 哺乳动物中，2分子氨（1分子氨是游离的，1分子氨来自天冬氨酸）和1分子C0 2生成1分子 尿素的环式代谢途径，是氮代谢最终产物一尿素的生成过程，因此具有除去氨毒害作用。 此外，其不仅将氨和C0 2合成为尿素，而且生成一分子延胡索酸，使尿素循环与柠檬酸循环 联系起来。肝脏是哺乳动物尿素合成的主要器官，在临床实践中，尿素循环的任何一个步骤 出问题都有可能产生疾病。如果完全缺乏尿素循环中的某一个酶，婴儿在出生不久就昏迷 或死亡；如果部分缺乏，会引起智力发育迟滞、嗜睡和经常呕吐。
[0003] 尿素在植物体内是尿素循环的一种主要代谢产物，在体外又是作物生产中被广泛 使用的氮肥，但尿素循环在植物体内的生理作用还不清楚。长期以来一般认为植物体内尿 素循环的转运活性低，其意义在于合成精氨酸。个别植物也可产生尿素，在脲酶作用下分解 产生氨，用以合成其他含氮化合物，包括核酸、激素、叶绿体、血红素、胺、生物碱等。
[0004] 精氨酸琥拍酸合成酶（Argininosuccinate synthetase,简称ASS)或称精氨酸琥 珀基合成酶，是一种从瓜氨酸及天冬氨酸催化合成精氨酸琥珀酸的酶（EC6. 3. 4. 5)。它负责 尿素循环中的第3个步骤及瓜氨酸-一氧化氮循环（Citrulline-Nitric Oxide Cycle)中 的一个反应。一般认为ASS为尿素循环或瓜氨酸-一氧化氮循环的限速酶。目前在植物中 还未见到相关分子生物学研究的报道。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSI。
[0006] 本发明的目的之二在于提供提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSI的制备方法。
[0007] 本发明的目的之三在于提供利用提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSI编码的蛋 白。
[0008] 本发明的整体技术构思是：
[0009] 提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSI，其序列如下：
[0010] ATTTCAGTGA AAGAAAAAAA AAATCGCTCA GTTCAAAGCC GTTTCACTCT CTTCGTCCAT TAATCTTGCA AGTTACCGTC CCAAAAGAAA TACATTGTTA CATTCCCATA ATTTGATCTG 丁TCTAGGAAG TTATCCACH TCCATGAGTT AACTCCAAAA TCTAGTTCGC TTCATGGTAA 丁GCTATTGTA AGCAACMTG TGTGTATGAC TCTMCACCT MGMTCMG GTATTCAMX 丁GTTCTTTCC AGCMCTCAG GGACGGATCT TTCCACACTT ACMAGGGTG GAGGGCTTCG AGGCAAATTA AACAAGCTTC TTTTACCCTA CACTCCCCGC TTACATACTT CTGTTATTGT 丁CCATGGCTA AGGGAGMTT ATGGTTGTCA GGTTGTFTCC TTCACTGCCG ATGHGGCCA AGGCATAAAA GAATTGCATG GTTTCCAAGC AAAGGCCAAG GCAAGCGGGG CTTGCCAGTT AGTAGTTAAG GACTTAAAGG AGGAATTTGT GAAAGACTAT ATATTTCCAT GCTTGCGAGC TGGTGCCATT TACGAGAGGA AATACTTCTT GGGAACCTCA ATGGCCAGGC CTGTTATTGC AAAGGCCATG GTGGATATTG CTAGACACGT TGGGGCTGAT GCCGTTTCTC ATGGATGCAC AGGGAAAGGA AATGATCAGG TTCGCTTTGA GCTCACCTTC TTTGCTCTAA GTCCGGAATT AAACGTTGTG GCTCCTTGGA CACAATGCGA TATTACAGGG AGAGAACATG CTATTGAATA 丁GCTAAGAAG CATAATGTGC CTGTTCCAGT GACAAAGAM TCMTATACA GCAGAGACAG GAACTTATGG CACTTGAGCC ACGAGCGAGA TATCTTGGAG GATCCAGCAA ATGAACCGAA GGAAGATATG TACATGATGA GTGTTCACCC GAAAGATGCT CCTGATAAAC CTCAATACGT GAAAATCGGA ATTGAATCAG GCATCCCTGT TTCACTTGAT GCAAAAACTT ATTTGCCGGC 丁GAACTTCTT GC丁ACACTCA ATGMATTGG TGGGMACAT GGGATTGGTC GTATTGACAT GGTTGAAAAT CGGCTCGTTG CTATGAAGAG TCGTGCGGTC TACGAAACTC CGGCTGGTAC CATCCTATTC AACGCCGTTC GTGAGCTGGA ATCTCTAACC CTTGACCGCG AAACCATTCA AGTTAAAGAT TCACTTGCCC TCAACTATGC GGAGTTAGTT TATGCAGGAA GGTGGTTCGA CCCACTTCGT GAATCCATGG ATGCATTTAT GGAGAAGATA ACTGAAACCA CCACTGGTTC CGTGACTTTG AAGCTATACA AAGGATCAGT TTCCGTAACT GGCCGGACCA GTGCTTATAG CTTGTACAGA GAGGATATCT CCTCCTTTGA GAGTGGAGAC ATATATAATC AAGCCGATGC TGCCGGATTT ATTCGGCTCT ATGGTCTTCC AATGAGGGTT AGGGCAATGC TTAACAAAGG TATCTAAGTC CTTTCTATTT TGTTTTTCAT TGTCTGGAAT TTCAAGGCTA Λ?ΤΤΛΤΛΤΛΤ TATCAATGCA CTAGTTTTCA TTCC"
[0011]
[0012] 提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备包括如下步骤：
[0013] 以 5 ' -ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3 ' 为上游引物 5ZWASS，以 5 ' -T TGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3 ' 为下游引物 3ZWASS，以棉花植株根 中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。
[0014] 利用提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl编码的蛋白，其序列如下：
[0015] MET Ala Gin Phe Lys Ala Val Set Leu Ser Ser Ser lie Asn Leu Ala Ser Tyr Gly Pro Lys Arg Asn Thr Leu Leu His Ser Asp Asn Leu lie Cys Ser Arg Lys Leu Ser Thr Phe iis Giu Leu Ser Gly Lys Ser Ser Ser Leu His Gly Asn Ala lie Val Ser Asn Asn Val Cys MET Thr Leu Thr Pro Lys Asn Gin Gly Tie Gin Ala Val Leu Ser Ser Asn Ser Gly Thr Asp Val Ser Thr Val Thr Lys Gly Gly Gly Leu Arg Gly Lys Leu Asn Lys Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Val lie Val Pro Trp Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Cys Ghi Val Val Cys Phe Thr Ala Asp Val Gly Gin Gly lie Lys Glu Leu Asp Gly Leu Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ser Gly Ala Cys Gin Leu Val Val Lys Asp Leu Lys Glu Glu Phe Val Lys Asp Tyr He Phe Pro Cys Leu Arg Ala Gly Ala lie Tyr Glu Arg Lys Tyr Leu Leu Gly Thr Ser MET Ala Arg Pro Val Tie Ala Lys Ala MET Val Asp lie Ala Arg Glu Val Cly Ala Asp Ala Val Ser His Cly Cys Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gin Val Arg Phe Glu Leu Thr Phe Phe Ala Leu Ser Pro Glu Leu Asn Val Val Ala Pro Trp Arg Glu Trp Asp lie Thr Gly Arg Glu Asp Ala Ile Glu Tyr Ala Lys Lys Hi s Asn Val Pro Va1 Pro Val 丁hr Lys Lys Ser lie Tyr Ser Arg Asp Arg Asn Leu Trp Hi s Leu Ser His Glu Gly Asp Tie Leu Glu Asp Pro Ala Asn Glu Pro Lys Glu Asp MET Tyr MET MET Ser Val Asp Pro Lys Asp Ala Pro Asp Lys Pro Gin Tyr Val Lys Tie Gly Tie Glu Ser Gly Tie Pro Val Ser Leu Asp Cly Lys Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Leu Leu Ala Thr Leu Asn Clu He Cly Gly Lys His Gly He Gly Arg lie Asp MET Val Glu Asn Arg
[0016] Leu Vai Gly MET Lys Ser Arg Gly Val Tyr Glu Thr Pro Gly Gly Thr He Leu Phe Asn Ala Va1 Arg Glu Leu Glu Ser Leu Thr Leu Asp Arg Glu Thr lie Gin Va1 Lys Asp Ser Leu Ala Leu Lys Tyr Ala Glu Leu Val Tyr Ala Gly Arg Trp Fhe Asp Pro Leu Arg Glu Ser MET Asp Ala Phe MET Glu Lys He Thr Chi Thr Thr Thr Gly Ser Val Thr Leu Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Val Ser Val Thr Gly Arg Thr Ser Ala Tyr Ser Leu Tyr Arg Glu Asp lie Ser Ser Phe Glu Ser Gly Asp lie Tyr Asn Gin Ala Asp Ala Ala Gly Phe lie Arg Leu Tvr Gly Leu Pro MET Arg Val Arg Ala MET Leu Asn Lys Gly MET。
[0017] 本发明的具体技术内容还有：
[0018] 提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备，其工艺步骤如下：
[0019] A、PCR反应模板的制备；
[0020] B、引物的制备；
[0021] C、基因 GhASSl全序列的扩增和克隆。
[0022] 所述的步骤A是选取新鲜棉花的根，在液氮中研磨成粉末状，置于预先冻存在冰 上无 RNase的离心管中，提取棉花的根组织中的RNA，提取的RNA经1 %琼脂糖甲醛变性胶 电泳检测，反转录合成cDNA用于PCR反应的模板。
[0023] 所述的RNA提取采用Takara公司生产的总RNA提取试剂盒。
[0024] 所述的反转录包括如下工艺步骤：
[0025] a、向 RNase-free 离心管中加入 2μ gRNA，浓度为 0· 5μ g/μ 1 的 Oligo (1Τ182μ 1， DEPC-H207. 75 μ 1，在温度70°C的条件下反应5分钟后，迅速冰浴；
[0026] b、向步骤a的溶液中加入以下反应液后制成混合液
[0027] 5 x缓冲液 5 μ 1 浓度为10mM的dNTP L 3μ 1 浓度为40 μ / μ 1 的RNase Ribonucleuse inhibitor 1 μ I MMLV反转录畴 Ιμ?
[0028] 将上述混合液在转速为2000转/分钟的转速下离心30秒后，42°C的条件下于PCR 仪中反应1小时；
[0029] c、混合液在72°C的条件下反应10分钟灭活反转录酶，混合液的体积为20μ 1，将 反转录产物于-7〇°C冻存。
[0030] 所述的步骤B是以名称为NM-118616的拟南芥ASS cDNA序列为探针，在NCBI数 据库中寻找棉花EST序列，获得注册号分别为DR461332, ES847521，H0104400的3条棉花 EST序列信息，对获得的3条EST序列信息进行电子拼接，获得含有完整开放阅读框的较长 的cDNA序列，以步骤A中获得的反转录合成cDNA为PCR反应的模板，设计两条PCR引物对 获得的cDNA序列扩增，上、下游扩增引物中分别引入Κρη I和BamH I识别序列，上游引物为 5ZWASS:5' -ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3' ；下游引物为 3ZWASS:5' -TTGCG GACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3 '。
[0031] 所述的步骤C是利用步骤A中获得的cDNA作模板，使用步骤B中获得的上、下游 引物进行PCR扩增；
[0032] 20 μ 1PCR反应体系如下：
[0033] ddH20 14. 5ul 1 0 χ Taq plus Buffer 2υI 浓度5μηι的Ji游引物 lul 浓度5μηι的下游引物 Ud cDNA 模板 hil Taq phis 酶 G. 5ul
[0034] 反应程序为：95°C预变性5分钟；95°C变性1分钟，50°C复性30秒，72°C延伸2分 钟，循环30次；72°C继续延伸10分钟，PCR扩增产物经浓度为1. 0%的琼脂糖凝胶电泳分 离后，采用Takara公司胶回收试剂盒回收目的基因，回收产物与反应体系连接，将连接产 物转化大肠杆菌后筛选阳性克隆提取质粒DNA，进行测序分析；
[0035] 20 μ 1连接体系有如下体积的组分组成：
[0036] 1? X 1i gase Buffer 2 μ 1 浓度为 5 0ng/ul ft pGEM-T 1 μ 1 回收产物 1 5 μ 1 Τ4-_Α 1 igase 2 μ 1
[0037] 将连接体系混合均匀后，16°C过夜。
[0038] 申请人:对本发明获得的基因进行了如下试验。
[0039] 1、基因 GhASS 1 cDNA 的克隆
[0040] 1-1、依据电子拼接所得到的序列信息，设计引物进行RT-PCR扩增。扩增产物通过 1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小为1500bp的片段，该片段大小与预期一致（图 1)。
[0041] 1-2、将得到的RT-PCR产物回收并与pGEM-T载体连接，连接产物转化入DH5,提取 转化子的质粒DNA，分别用Spe I单酶切，和用Sph I、Spe I双酶切，0.8%琼脂糖电泳检 测。如图，Spe I单酶切产生1条含pGEM+GhASSl片段的长为4500bp的大片段，而用Sph I、 Spe I双酶切则产生1条pGEM骨干载体片段和1条GhASSl基因，片段大小约为3000bp和 1500bp，电泳（图2)结果与预期相符，说明外源基因与T载体成功连接。北京三博远志生 物技术有限公司测序。
[0042] 2、基因 GhASSlcDNA序列分析
[0043] 2-1、将RT-PCR扩增产物测序结果与电子拼接所得相应序列进行比对，二者的同 源性达99. 1%，证明目标基因在棉花中真实存在，因此确定其cDNA序列如图3。
[0044] 2-2、该cDNA序列长1584bp，5'非翻译区（5, -UTR)包含22bp，从第23bp至第 1507bp为其开放阅读框（0RF)，共有1485bp，自第1508bp后为其3'端非翻译区（3'-UTR)。 0RF区翻译的蛋白多肽序列如图4。
[0045] 2-3、该多肽由494个氨基酸组成，推断产物的分子量（MW)为54kD，等电点 (pi) 5. 03。序列中不存在跨膜螺旋和信号肽，可能定位于细胞质中。利用NPSA中的MLRC 方法预测棉花GhASSl二级结构，结果显示无规则卷曲所占比例最大，为53. 09 % ;而α -螺 旋和β -折叠所占比例分别为31. 67%和15. 24%。利用网站Expasy中Swiss Model程序 进行同源建模，推测GhASSl蛋白的三维结构，结果（图5)显示该蛋白可能含有较多的无规 卷曲，α螺旋比β折叠多，与二级结构预测结果一致。
[0046] 3、基因 GhASSl编码产物的同源对比与系统进化分析
[0047] 3-1、将所得基因 GhASSl编码的氨基酸序列与落叶松蕈（Agaricus bisporus) (Genbank 注册号为 CAI12846)和人类（Homo sapiens) (Genbank 注册号为 P00966)进行 序列比对，结果如图6,显示在GhASSl中有与ASS同源蛋白的高度保守序列，其中富含甘 氨酸的 A 模序（[A/S] - [F/Y] -S-G-G- [LV] -D-T- [S/T])为 Mg2+-ATP 酶共有序列，B 模序 (G-x-T-x-K-G-N-D-x (2) -R-F)为天冬氨酸结合位点，C 模序（S-x-D-x-N-x (6) -E)和 D 模序 (E-[N/D]-R-x(4)-K-x(4)-Y-E)通过形成β发卡结构参与与胍氨酸的结合。
[0048] 3-2、序列相似性分析显示，GhASSl与拟南芥、水稻等植物同源蛋白的相似性在 80%以上，与人等哺乳动物、酿酒酵母等真菌中同源蛋白的相似性在40-50%，与大肠杆菌 同源蛋白的相似性在20-30%。系统进化分析显示（图7)，GhASSl的系统进化与参比各物 种的进化地位基本一致。
[0049] 美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Info rmation， NCBI)推测开放阅读框架的 0RF Finder,网址为：（http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/ gorf. html)。蛋白质基本性质分析数据库ExPASy在线服务器，分析GhASSl蛋白的分子量、 等电点、疏水性等。蛋白质跨膜预测服务器HMMT0P(http://www. enzim. hu/hmmtop/index. html)，蛋白质信号肤预测工具 Signal Ρ4· OSever (http: //www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/)，蛋白质亚细胞定位预测工具 PS0RT Predition(http://psort. hqc. jp/form. html)，蛋白质 Domain 分析工具 SMART (http: //smart, embl-heidelberg. de)，蛋白质二级 结构的预测工具 NPSA_MLRC(http://npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pi ? page = /NPSA/npsa_htm. html),并通过Pymol软件对GhASSl蛋白的三维结构进行显示。 用 ClustalW(http: //www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)进行在线的同源序列比对， 用DNAMAN软件进行系统发生树分析。
[0050] 4、GhASSl原核表达与体外催化特征分析
[0051] 4-l、pCold-GhASSl原核表达载体的构建
[0052] 用Xbal和ΚρηΙ双酶切GhASSl测序载体，因在GhASSlORF序列内部的1118bp处存 在1个ΚρηΙ的识别序列，且0RF序列上游设计添加了 1个ΚρηΙ的识别序列，因此ΚρηΙ和 Xbal双酶切GhASSl测序载体时需严格控制反应条件，使该反应处于不完全酶切状态，此时 电泳回收与GhASSlORF序列大小相符的酶切片段，与同样酶切反应获得的pCold TF片段连 接，经转化和转化子筛选，获得pCold-GhASSl重组质粒。同样，用Xbal和ΚρηΙ双酶切检测 获得的pCold-GhASSl重组质粒，反应完全后，采用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物， 可观察到清晰的3个条带（图8)，其中最大的片段与pCold TF载体大小一致，另2条带大 小分别约为1200bp和300bp，两带大小之和与GhASSlORF大小一致，说明GhASSlORF已成功 构建入pColdTF。将此载体送送北京三博远志生物技术有限公司测序，测序结果与预期相 符。
[0053] 4-2、基因 GhASSl在大肠杆菌中的表达
[0054] 经IPTG诱导后，含有pCold TF空载体的对照菌在54KDa处表达较高水平的标签蛋 白带，重组菌中因为GhASSl在pCold-TF质粒中的插入，产生特异的1条融合蛋白条带，大 小约为标签蛋白与目标蛋白分子量之和，本研究中约为l〇8KDa。电泳结果如图9所示，说明 在含pCold-GhASSl质粒的Rosetta工程菌株中，GhASSl重组蛋白得到了有效表达。
[0055] 4-3、棉花精氨酸琥珀酸合成酶GhASSl体外催化特征分析
[0056] 精氨酸琥珀酸合成酶催化天冬氨酸和瓜氨酸合成精氨酸琥珀酸，同时消耗一份子 的ATP，使其生成焦磷酸和AMP，在焦磷酸酶的作用下，焦磷酸水解成磷酸，在酸性条件下， 磷酸与钥酸结合生成磷钥酸，磷钥酸与硫胺反应产生硫胺荧，并发出很强的荧光。依据荧光 强度，可间接测定ASS活性。通过测定反应液中总蛋白含量计算酶比活力。
[0057] 取菌体15°C诱导24h后的菌液裂解液作为催化粗酶液，以天冬氨酸，瓜氨酸和ATP 为底物，进行体外酶催化特性的研究，以每分钟产生1 μ molPO,的酶量为一个酶活力单 位（U/L)，得到粗提取液的酶活性和比活力（图10A，图10B)。由图10A及图10B可知，含 pCold-GhASSl质粒的重组菌表达蛋白GhASSl的酶活性和比活力都远远高于含pCold-TF质 粒的对照菌。说明GhASSl成功的转移到了大肠杆菌Rosetta菌株中，并可表达有活性的蛋 白。
[0058] GhASSl酶活测定采用如下方法：
[0059] ASS催化瓜氨酸与天冬氨酸缩合成精氨酸代琥珀酸，消耗一分子ATP，生成AMP和 焦磷酸，焦磷酸在焦磷酸酶的作用下水解成磷酸，磷酸与钥酸在酸性条件下结合生成磷钥 酸，其与非荧光的硫胺反应产生高荧光性的硫胺荧，荧光激发波长375nm，测定波长440nm。 利用这一原理通过检测其荧光强度，来测定GhASSl的酶活性。
[0060] 基质缓冲液：50mm〇l/LTris-HCl缓冲液（pH = 7. 7)，去离子水配制。
[0061] 基质液：10mL基质缓冲液内含0. 005mmol天冬氨酸，0. 004mmol瓜氨酸， 0. 01mmolATP，0. 025mmolMgC12,10U焦磷酸酶，临用前去离子水配制。
[0062] 荧光混合液：1% H2S04, lmmol/L钥酸铵，0. 2mmol/L盐酸硫胺，按2 :1 :1比例去离 子水配制。
[0063] 标准液：0· lmmol/L硼砂，去离子水配制。
[0064] 裂解缓冲液：50mMTris-HCl 缓冲液（pH = 8. 0)，2mMEDTA，0· 5 % TritonX-100， lmg/mL溶菌酶，去离子水配制。
[0065] (1)菌体 15°C诱导 24h 后，各取 1. 4mL 至 1. 5mL 的 EP 管中，4000rpm 低温（4°C ) 离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸干培养基。
[0066] (2)各加入100 μ L裂解液，移液枪轻轻吹打使菌液悬浮。
[0067] (3) - 20°C和室温反复冻融3-5次。
[0068] (4)4°C、4000rpm离心lOmin，所得上清即为粗酶液。
[0069] (5) 37°C保温lOmin，各加入2mL荧光混合液，其中测定对照管加 10 μ L待测酶液， 37°C保温5min后，各管加入100mmol/L硼砂，混勻，测定突光度。
[0070] 表1荧光测定酶活力
[0071]

【权利要求】
1. 提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl，其特征在于其序列如下： ATTTCAGTGA AAGAAAAAAA AAATGCCTCA GTTCAAAGCC GTTTCACTCT CTTCGTCCAT TAATCTTCCA AGTTACCGTC CCAAAAGAAA TACATTGTTA CATTCCGATA ATTTGATCTG TTCTAGGAAG TTATCCACTT TCCATCAGTT AAGTGGAAAA TCTAGTTCGC TTCATGGTAA TGCTATTCTA AGCAACAATG TGTGTATGAC TCTAACACCT AAGAATCAAG GTATTCAAGC TGTTCTTTCC AGCAACTCAG GGACGGATGT TTCCACAGTT ACAAAGGGTG GAGGGCTTCG AGGCAAATTA AACAAGGTTG TTTTAGCCTA CAGTGGCGGC TTAGATACTT CTGTTATTGT TCCATGGCTA AGGGAGAATT ATGGTTGTGA GGTTGTTTGC TTCACTGCCG ATGTTGCCCA AGGCATAAAA GAATTGGATG GTTTGGAAGC AAAGGCCAAG GCAAGCGGGG CTTGCCAGTT AGTAGTTAAG GACTTAAAGG AGGAATTTGT GAAAGACTAT ATATTTCCAT GCTTGCCAGC TGGTGCCATT TACGAGAGGA AATACTTGTT GGGAACCTCA ATGGCCAGGC CTGTTATTGC AAAGGCCATC GTGGATATTG CTAGAGACGT TCGCGCTGAT CCCGTTTCTC ATGGATGCAC AGCGAAAGGA AATGATCACG TTCGCTTTGA GCTCACCTTC TTTGCTCTAA GTCCGCAATT AAACGTTGTC GCTCCTTGCA CAGAATGCGA TATTACAGCG AGAGAAGATC CTATTCAATA TGCTAAGAAG CATAATGTGC CTGTTCCAGT GACAAACAAA TCAATATACA CttGACACAG GAACTTATGG CACTTGAGCC ACGAGGGAGA TATCTTCGAG GATCCAGCAA ATGAACCGAA GGAAGATATG TACATGATGA GTGTTGACCC GAAAGATGCT CCTGATAAAC CTCAATACGT GAAAATCGGA ATTGAATCAG CCATCCCTGT TTCACTTGAT GGAAAAACTT ATTTGCCGGC TGAACTTCTT GCTACACTCA ATGAAATTGG TGGCAAACAT CGCATTGCTC GTATTGACAT GGTTGAAAAT CGGCTCGTTG CTATCAACAG TCGTGGCGTC TACGAAACTC CCGCTGCTAC CATCCTATTC AACGCCGTTC CTGACCTCGA ATCTCTAACC CTTGACCCCC AAACCATTCA AGTTAAAGAT TCACTTGCCC TCAACTATGC GGACTTAGTT TATGCAGCAA GCTCGTTCGA CCCACTTCGT GAATCCATCG ATGCATTTAT GGACAACATA ACTGAAACCA CCACTGCTTC CGTGACTTTG AAGCTATACA AAGGATCAGT TTCCGTAACT GGCCGGACCA GTGCTTATAG CTTGTACAGA GAGGATATCT CCTCCTTTGA GAGTGGAGAC ATATATAATC AAGCCGATGC TGCCGGATTT ATTCGGCTCT ATGGTCTTCC AATGAGGGTT AGGGCAATGC TTAACAAAGG TATGTAAGTG CTTTCTATTT TGTTTTTCAT TGTCTGGAAT TTCAAGGCTA ACTTATATAT TATCAATGGA GTAGTTTTCA TTCC"
2. 根据权利要求1所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备，其特征在于所述 的制备方法包括如下步骤： 以 5' -ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3' 为上游引物 5ZWASS，以 5' -TTGC GGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3' 为下游引物 3ZWASS，以棉花植株根中 的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。
3. 根据权利要求2所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备，其特征在于其工 艺步骤如下： A、 PCR反应模板的制备； B、 引物的制备； C、 基因 GhASSl全序列的扩增和克隆。
4. 根据权利要求3所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备，其特征在于所述 的步骤A是选取新鲜棉花的根，在液氮中研磨成粉末状，置于预先冻存在冰上无 RNase的离 心管中，提取棉花的根组织中的RNA，提取的RNA经1 %琼脂糖甲醛变性胶电泳检测，反转录 合成cDNA用于PCR反应的模板。
5. 根据权利要求4所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备，其特征在于所述 的RNA提取采用Takara公司生产的总RNA提取试剂盒。
6. 根据权利要求4或5中任一项所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhA SS1的制备， 其特征在于所述的反转录包括如下工艺步骤： a、 向 RNase-free 离心管中加入 2 μ gRNA，浓度为 0· 5 μ g/ μ 1 的 Oligo dT182 μ 1， DEPC-H207. 75 μ 1，在温度70°C的条件下反应5分钟后，迅速冰浴； b、 向步骤a的溶液中加入以下反应液后制成混合液 5 X缓冲液 5 μ 1 浓度为 10mM的dNTP 1, 3μ 1 浓度为40 μ / μ 1 的RNase Ribonucleuse inhibitor 1 μ 1 MMLV反转录酶 1 μ 1 将上述混合液在转速为2000转/分钟的转速下离心30秒后，42°C的条件下于PCR仪中反 应1小时； c、 混合液在72°C的条件下反应10分钟灭活反转录酶，混合液的体积为20 μ 1，将反转 录产物于_70°C冻存。
7. 根据权利要求4所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备，其特征在于所述 的步骤B是以名称为NM-118616的拟南芥ASScDNA序列为探针，在NCBI数据库中寻找棉花 EST序列，获得注册号分别为DR461332, ES847521，H0104400的3条棉花EST序列信息，对 获得的3条EST序列信息进行电子拼接，获得含有完整开放阅读框的较长的cDNA序列，以 步骤A中获得的反转录合成cDNA为PCR反应的模板，设计两条PCR引物对获得的cDNA序 列扩增，上、下游扩增引物中分别引入Κρη I和BamH I识别序列，上游引物为5ZWASS:5'-AC CATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3' ；下游引物为 3ZWASS:5' -TTGCGGACTCTAGAGGAT CCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3 '。
8. 根据权利要求3所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因 GhASSl的制备，其特征在于所 述的步骤C是利用步骤A中获得的cDNA作模板，使用步骤B中获得的上、下游引物进行PCR 扩增； 20 μ 1PCR反应体系如下： ddH20 14.5ul 10x Taq plus Buffer 2ul 浓度5μηι的上游引物 lul 浓度5μηι的下游引物 lul c+DM 模板 lul Taq plus 酶 0. Sul 反应程序为：95°C预变性5分钟；95°C变性1分钟，50°C复性30秒，72°C延伸2分钟，循 环30次；72°C继续延伸10分钟，PCR扩增产物经浓度为1. 0%的琼脂糖凝胶电泳分离后， 采用Takara公司胶回收试剂盒回收目的基因，回收产物与反应体系连接，将连接产物转化 大肠杆菌后筛选阳性克隆提取质粒DNA，进行测序分析； 20 μ 1连接体系有如下体积的组分组成： 10 X 1igase Buffer 2 μ 1 浓度为 50ng/ul 的 pGBM-T 1 μ 1 回收产物 15 μ 1 T.;-DNA H gase 2 μ 1 将连接体系混合均匀后，16 °C过夜。
9.利用如权利要求1所述的基因 GhASSl编码的蛋白，其特征序列如下： MET Ala Gin Phe Lys Ala ￥a1 Ser Leu Ser Ser Ser lie Asn Leu Ala Ser Tyr Gly Fro Lys Arg Asn Thr Leu Leu His Ser Asp Asn Leu Tie Cys Ser Arg Lys Leu Ser Thr Phe His G1u Leu Ser Gly Lys Ser Ser Ser Leu His Gly Asn Ala lie Va1 Ser Asn Asn Va1 Cys MET Thr Leu Thr Pro Lys Asn (；!n Oly lie Gin Ala Val Leu Ser Ser Asn Ser Gly Thr Asp Va! Ser Thr Va1 Thr Lys Gly Gly Gly Leu Arg G1y Lys Leu Asn Lys Va1 Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Va1 lie Val Pro Trp Leu Arg Glu Asn Tyr Giy Cys Glu Val Val Cys Phe Thr Ala Asp Val Gly Gin Gly He Lys Glu Leu Asp Gly Leu Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ser Gly Ala Cys Gin Leu Val Val Lys Asp Leu Lys Glu Glu Phe Va1 Lys Asp Tyr lie Phe Pro Cys Leu Arg Ala Gly Ala lie Tyr Glu Arg Lys Tyr Leu Leu Gly Thr Ser MET Ala Arg Pro Val lie Ala Lys Ala MET Val Asp lie Ala Arg Glu Val Gly Ala Asp Ala Val Ser His Gly Cys Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gin Val Arg Phe Glu Leu Thr Phe Phe Ala Leu Ser Pro Glu Leu Asn YaI Val Ala Pro Trp Arg Glu Trp Asp lie Thr Gly Arg Glu Asp Ala He Giu Tyr Ala Lys Lys His Asn Val Pro Val Pro Va1 Thr Lys Lys Ser lie Tyr Ser Arg Asp Arg Asn Leu Trp His Leu Ser His Glu Gly Asp lie Leu Glu Asp Pro Ala Asn Glu Pro Lys Glu Asp MET Tyr MET MET Ser Val Asp Pro Lys Asp Ala Pro Asp Lys Pro Gin Tyr Val Lys lie Glv lie Glu Ser Gly lie Fro Val Ser Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Leu Leu Ala Thr Leu Asn G!u He Gly Gly Lys His Gly lie Gly Arg lie Asp MET ￥a! Glu Asn Arg Leu Yal Gly MET Lys Ser Arg Gly ￥al Tyr Glu Thr Pro Gly Gly Thr lie Leu Phe Asn Ala Val Arg Glu Leu Clu Ser Leu Thr Leu Asp Arg Glu Thr lie CIn Val Lys Asp Ser Leu Ala Leu Lvs Tyr Ala Glu Leu Val Tyr Ata Cly Arg Trp Phe Asp Pro Leu Arg Glu Ser MET Asp Ala Phe MET Glu Lys lie Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ser Val Thr Leu Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Val Ser Val Thr Gly Arg Thr Ser Ala Tvr Ser Leu Tyr Arg Glu Asp lie Ser Ser Phe Glu Ser Gly Asp lie Tyr Asn Gin Ala Asp Aia Ala Giy Phe Tie Arg Leu Tvr Gly l,eu Pro MET Arg Val Arg Ala MF,T !xu Asn Lys Gly * Μψ% X 0
【文档编号】C12N15/10GK104059928SQ201410238026
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】孙艳香, 王慧飞, 冯雪, 贾永红, 张一名 申请人:廊坊师范学院