具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种修饰的免疫球蛋白结合蛋白，例如，葡萄球菌(Staphyloccocus)蛋白A，所述蛋白具有改善的免疫球蛋白结合特异性；以及所述蛋白的制备方法和使用方法。
【专利说明】具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白
[0001]本申请是2009年8月11日提交的题为“具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白”的中国专利申请200910221476.7的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求以2008年8月11日递交的美国临时申请号61/188，549和2009年4月16日递交的美国临时申请号61/212，812为优先权的权益。上述临时申请在此均全文引入作为参考。
发明领域
[0004]本发明涉及修饰的免疫球蛋白结合蛋白，例如葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A，其具有改进的免疫球蛋白结合特异性，以及制备和应用该蛋白的方法。
[0005]背景
[0006]葡萄球菌蛋白A (SpA),是一种来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的42kDa的多域蛋白。SpA通过其羧端的细胞壁结合域被结合到细菌的细胞壁上，该结合域被称为X结构域。在氨基端的结构域，其包括5个免疫球蛋白结合区，被称为E、
D、A、B 和 C 区(Sjodhal，Eur J B1chem.Sep ;78 (2): 471-90 (1977) ;Uhlen 等人，J B1lChem.Feb 10 ；259 (3): 1695-702 (1984))。上述每个结构域包含大约58个氨基酸残基，且它们具有65-90%的氨基酸序列同一性。SpA的Z结构域是一个工程化了的SpA的B结构域的类似物，其在第29位上包括一个丙氨酸来替代甘氨酸残基。
[0007]基于SpA的试剂在生物【技术领域】具有广泛的应用，例如，在捕获和纯化抗体的亲和层析以及抗体的检测方法等方面。目前，基于SpA的亲和介质可能是应用最广泛的亲和介质，其用于从不同样品，包括细胞培养中进行单克隆抗体及其片段的分离。相应地，包括蛋白A配体的各种基质可以在市场上购买到，包括例如，ProSep? -vA High Capacity,ProSep? vA Ultra、ProSep? UltraPlus (Millipore)和 Protein A Sepharose?,MabSelect?, MabSelect Xtra? 以及 MabSelect S U Re? (GE Healthcare)。
[0008]发明概沭
[0009]本发明至少部分提供新的改进的SpA变体，其相对于以前所知的SpA变体表现出或者降低、或者升高的结合免疫球蛋白Fab部分的能力，同时保留其结合免疫球蛋白Fe部分的能力。
[0010]在一些实施方式中，本发明提供新的改进的SpA变体，其相对于市场上可购买到的很多基于蛋白A的Fab结合试剂表现出降低的Fab结合活性，而后者的Fab结合活性在有些时候是人们所不希望的。
[0011 ] 在一个实施方式中，根据本发明的免疫球蛋白结合域是基于SpA的一个或多个结构域(即E、D、A、B、C和Z)，其被修饰为至少替换第29位的氨基酸。对于E、D、A、B和C结构域而言，第29位的氨基酸是甘氨酸，其被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸。对于结构域Z而言，第29位的氨基酸是丙氨酸，其被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸。在一个特定的实施方式中，第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸，或者第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸。
[0012]相应地，在一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的E区，其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fe部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，E区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
[0013]在另一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的D区，其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fe部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，D区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
[0014]在另一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的A区，其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fe部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，A区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
[0015]在另一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的B区，其中至少第2 9位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fe部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，B区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
[0016]在另一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的C区，其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fe部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，C区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
[0017]在另一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的Z区，其中至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fe部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，Z区第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
[0018]在一些实施方式中，根据本发明的一种免疫球蛋白结合蛋白包括多于一个修饰的SpA结构域或其已知的变体(例如，多于一个的E、D、A、B、C和/或Z结构域以及其任意组合)其中每个结构域包括将第29位的甘氨酸(即，对于E、D、A、B和C结构域而言)或丙氨酸(即，对于Z结构域而言)替换为另一个氨基酸，例如，除丙氨酸、甘氨酸或色氨酸以外的一个氨基酸。在一个特定的实施方式中，第29位的甘氨酸或丙氨酸被替换为除丙氨酸、甘氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸。
[0019]在一些实施方式中，一种或多种分离的E、D、A、B和C结构域的第29位的甘氨酸(G)或分离的Z结构域的第29位的丙氨酸被替换为选自下列组的氨基酸:亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)，半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、脯氨酸(P)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或其功能性变体或衍生物。
[0020]在一个特定的实施方式中，根据本发明的一种免疫球蛋白结合蛋白包括一个或多个分离的E、D、A、B、C或Z结构域，其中所述的一个或多个分离的结构域包括将第29位的甘氨酸残基(例如，对于E、D、A、B和C结构域而言)或第29位的丙氨酸(例如，对于Z结构域而言)替换为选自下列组的氨基酸:亮氨酸，赖氨酸和精氨酸或其功能性变体或衍生物。[0021 ] 在一个进一步的实施方式中，根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白进一步包括至少一部分SpA的羧基端区域(特指X结构域)。
[0022]在一些实施方式中，根据本发明的一种免疫球蛋白结合蛋白进一步包括一个天冬酰胺，例如，在第23位处，其被替换为另一个氨基酸。
[0023]在一个可选的实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括葡萄球菌蛋白A的一个或多个分离的E、D、A、B、C或Z结构域，其中一个或多个分离的结构域包括:(i)当所述结构域是E、D、A、B或C的时候，至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸外的氨基酸残基；或(ii)当所述结构域是Z的时候，至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸外的氨基酸残基，其中免疫球蛋白结合蛋白能够结合免疫球蛋白的Fe部分，且相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分增强的结合活性。
[0024]在一些实施方式中，根据本发明的一种分离的免疫球蛋白结合蛋白包括第29位的苏氨酸或色氨酸，其中免疫球蛋白结合蛋白能够结合免疫球蛋白的Fe部分，且相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分增强的结合活性。在一些实施方式中，所述Fe部分可以是Fe融合蛋白的一部分。
[0025]在此描述的能够被不同种类的免疫球蛋白结合蛋白所结合的免疫球蛋白包括一种或多种IgG、IgA和IgM0
[0026]在其它的实施方式中，提供了一种可用于分离免疫球蛋白或抗体的层析基质。在一个实施方式中，根据本发明的一种层析基质包括在此描述的一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其偶联于一种固体载体上。
[0027]在此还提供了编码不同的所述免疫球蛋白结合蛋白的核酸分子，以及包含这些核酸分子的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在其它的实施方式中，宿主细胞是真核细胞。
[0028] 另外，本发明还包括了一种多肽文库，其包括一种或多种所述的免疫球蛋白结合蛋白及其功能性变体。在另一个实施方式中，本发明提供一种核酸分子文库，其编码一种或多种本发明所涵盖的免疫球蛋白结合蛋白，或编码其功能性变体。
[0029]在此还提供一种应用所述免疫球蛋白结合蛋白的方法。在一些实施方式中，提供了一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤:(a)提供包括一种或多种免疫球蛋白的样品；(b)使样品接触层析基质，该层析基质包括一种所述的免疫球蛋白结合蛋白，接触的条件使得所述的一种或多种免疫球蛋白与基质结合；以及通过在合适的PH下进行洗脱，回收所述的一种或多种结合的免疫球蛋白。
[0030]在此描述的各种实施方式中，将一种或多种结合的免疫球蛋白进行洗脱的合适的PH是酸性pH。
[0031]附图简沭
[0032]图1描述了 SpA的野生型(wt) IgG结合域的核酸序列，如SEQ ID NOs: 1-5所示。SEQ ID NO:1表示wt E区的核酸序列；SEQ ID勵:2表示被D区的核酸序列；SEQ ID NO: 3表示wt A区的核酸序列；SEQ ID NO: 4表示wt B区的核酸序列；以及SEQ ID勵:5表示被C区的核酸序列。
[0033]图2描述了 SpA的Z区的核酸序列，如SEQ ID NO:6所示。
[0034]图3描述了 SpA(E、D、A、B和C)的野生型(wt) IgG结合区的氨基酸序列比对，其包括第29位的甘氨酸。SEQ ID N0:7表示wt E区的氨基酸序列；SEQ ID N0:8表示wt D区的氨基酸序列；SEQ ID NO: 9表示wt A区的氨基酸序列；SEQ ID NO: 10表示wt B区的氨基酸序列；SEQ ID N0:11表不wt C区的氣基酸序列。
[0035]图4描述了 Z区的氨基酸序列，如SEQ ID NO: 12所示。
[0036]图5描述了质粒pJ56:8620的示意图，其中“His6”如SEQ ID N0:22所示。
[0037]图6描述了三个SpA的B区突变体的核酸序列，其中第29位的甘氨酸被替换为亮氨酸、赖氨酸或精氨酸。SEQ ID NO: 13表示SpA突变体G29L的核酸序列；SEQ ID NO: 14表示SpA突变体G29K的核酸序列；以及SEQ IDNO: 15表示SpA突变体G29R的核酸序列。
[0038]图7描述了三个SpA的B区突变体的氨基酸序列，其中第29位的甘氨酸被替换为亮氨酸、赖氨酸或精氨酸。SEQ ID NO: 16表示SpA的B区突变体G29L的氨基酸序列；SEQID NO: 17表示SpA的B区突变体G29K的氨基酸序列；以及SEQ ID NO: 18表示SpA的B区突变体G29R的氨基酸序列。
[0039]图8描述了一个示例性的蛋白质印迹(Western Blot)实验,其中在大肠杆菌(E.Coli)BL21 (DE3)细胞中表达自载体PETlla:8620的蛋白A通过鸡IgY抗-蛋白A抗体进行检测。
[0040]图9描述了一个代表性的实验结果，其评价了免疫球蛋白的Fe和F(ab)2部分与单独的镍树脂(阴性对照)的结合，或与MabSelect SuRe?层析介质(阳性对照)的结合，继而进行SDS-PAGE分析，如图所示。E表示层析后的洗脱物或结合的部分，S表示层析后的上清液或未结合的部分。自左至右:第I道表示分子量标准;第2-5道表示F(ab)2(第2(E)、3⑶道)或Fe(第4(E)、5⑶道)与镍树脂的结合；第6_9道表示F (ab) 2 (第6 (S)、7(E)道)或Fe(第8(S)、9(E)道)与MabSelect SuRe?的结合；第10和11道表示单独的F(ab) 2和Fe。F(ab) 2作为二聚体在SDS-PAGE上大约为18和20kDa，Fc在SDS-PAGE上大约为22kDa。如第2(E)和4(E)道分别所示，F(ab)2和Fe都表现出与镍树脂(阴性对照)弱到无的结合活性。同样，如第7(E)道所示，F(ab)2表现出能与MabSelect SuRe?结合，而Fe则表现出与MabSelect SuRe? (阳性对照)的显著结合。
[0041]图10描述了一个代表性的实验结果，其评价了免疫球蛋白的F(ab)2和Fe部分结合带有组氨酸标签的野生型SpA(WtSpA),或结合带有组氨酸标签的B-结构域变体,该变体包括第29位上用丙氨酸取代甘氨酸(G29A)，其中使用镍亲和层析，继而进行SDS-PAGE分析，如图所示。F表示蛋白A加样；FT表示蛋白A流出物；S表示Fe或Fab结合步骤后的上清液(未结合的部分)；E表示洗脱部分(结合的部分)。自左至右:第I道表示分子量标准；第2道表示评价wt SpA与F(ab)2或Fe结合的实验中的F组分；第3_5道描述了在FT(第3道)、S(第4道)和E(第5道)组分中wt SpA与F (ab)2的结合；第6-8道描述了在FT(第6道)、S(第7道)和E(第8道)组分中wt SpA与Fe的结合；第9道表示评价G29A与F(ab)2*Fc结合的实验中的F组分；第10-12道表示在FT (第10道)、S(第11道)和E(第12道)组分中G29A与F(ab)2的结合?’第13-15道表示在FT(第13道)、S(第14道)和E(第15道)组分中G29A与Fe的结合。
[0042]图11描述了一个代表性的实验结果，其评价了免疫球蛋白的F(ab)2和Fe部分结合带有组氨酸标签的B-结构域变体，该变体包括第29位上用亮氨酸取代甘氨酸(G29L)，其中使用镍亲和层析，继而进行SDS-PAGE分析，如图所示。F表示蛋白A加样；FT表示蛋白A流出物；S表示Fe或Fab结合步骤后的上清液(未结合的部分)；E表示洗脱部分(结合的部分)。自左至右:第I道表示分子量标准;第2道表示F组分；第3-5道描述了在FT (第3道)、S(第4道)和E(第5道)组分中F (ab) 2与G29L的结合；第6-8道表示在FT (第6道)、S(第7道)和E(第8道)组分中Fe与G29L的结合。
[0043]图12描述了一个代表性的实验结果，其评价了免疫球蛋白的F(ab)2和Fe部分结合带有组氨酸标签的B-结构域变体,该变体包括第29位上用赖氨酸取代甘氨酸(G29K)以及第29位上用精氨酸取代甘氨酸 (G29R)，其中使用镍亲和层析，继而进行SDS-PAGE分析，如图所示。F表示蛋白A加样；FT表示蛋白A流出物；S表示Fe或Fab结合步骤后的上清液(未结合的部分)；E表示洗脱部分(结合的部分)。自左至右:第I道表示分子量标准；第2道表示表示评价G29K与F(ab)2或Fe结合的实验中的F组分；第3_5道表示在FT (第3道)、S(第4道)和E(第5道)组分中F(ab)2与6291(的结合；第6_8道表示在FT (第6道)、S(第7道)和E(第8道)组分中Fe与G29K的结合；第9道表示G29R与F(ab)2*Fe结合实验中的F组分；第10-12道表示在FT(第10道)、S(第11道)和E(第12道)组分中G29R与F(ab)2的结合；第13-15道表示在FT (第13道)、S (第14道)和E (第15道)组分中G29R与Fe的结合。
[0044]图13A-13E描述了一个代表性的实验结果，其中使用表面等离子共振分析进一步评价了本发明的SpA变体与免疫球蛋白的Fe部分的结合。这些附图描述了浓度范围45nM-185pM的Fe与对照组野生型蛋白A(图13A)和G29A(图13B)，以及与构建体G29K(图13C)、G29R(图 13D)和 G29L(图 13E)的结合。
[0045]图14A-14E描述了一个代表性的实验结果，其中使用表面等离子共振分析进一步评价了本发明的SpA变体与免疫球蛋白的F(ab)2部分的结合。这些附图描述了浓度范围45nM-185pM的F(ab)2与各种蛋白A构建体的结合。对于野生型蛋白A观察到强的结合(图14A)，对于G29A对照观察到弱的结合(图14B)。对于G29K(图14C)、G29R(图14D)和G29L(图14E)没有检测到结合。
[0046]图15A-15B描述了用于SpA层析树脂的Fe和Fab脉冲实验的代表性实验结果。在图15A中，Fe的未结合部分出现于7个柱体积(CV)，结合的Fe洗脱出现于23CV。在图15B中，F(ab)2的未结合部分出现于7CV，结合的Fe洗脱出现于23-25CV之间。
[0047]发明详沭
[0048]至少在某种程度上，本发明提供SpA变体，其结合免疫球蛋白的Fab部分的亲和性低于野生型SpA和之前所述的SpA变体，而保留与免疫球蛋白的Fe部分结合的能力。在一些实施方式中，在此所述的SpA变体结合免疫球蛋白的Fab部分的亲和力高于第29位上具有丙氨酸的SpA。
[0049]1.定义
[0050]为了使当前公开的内容更容易理解，对一些术语进行了首次定义。额外的定义贯穿于详细描述中。
[0051 ] 在此所使用的，术语“免疫球蛋白结合蛋白”指一种“SpA”或“金黄色葡萄球菌蛋白A”的氨基酸序列变体，包括一个或多个修饰的SpA结构域(例如，一种或多种修饰的E、D、A、B、C或Z结构域)，其相对于野生型SpA(wt SpA)或已知的变体SpA结构域(例如,Z结构域)，表现出降低的结合免疫球蛋白Fab部分或Ig分子的结合活性。在一些实施方式中，本发明的免疫球蛋白结合蛋白包括一个或多个修饰的E、D、A、B、C或Z结构域，其中每个结构域包括对第29位的氨基酸进行替换。对于E、D、A、B或C结构域而言，第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸；对于结构域Z而言，第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸。在一些实施方式中，第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸，第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸。在一些实施方式中，变体的氨基酸序列可以不同于作为其衍生来源的亲代氨基酸序列，其中在亲代氨基酸序列的任何位置进行替换、删除和/或插入一种或多种氨基酸，且包括至少在第29位进行氨基酸残基的替换。在一些实施方式中，氨基酸序列变体相对于亲代序列(即wt SpA结构域或Z结构域)具有至少大约70%,或至少大约80%,或至少大约85 %，或至少大约90 %，或至少大约95 %，或至少大约96 %，或至少大约97 %，或至少大约98%的同一性，其中所述变体结合免疫球蛋白的Fe部分，然而，其相对于在第29位包括甘氨酸或丙氨酸的SpA氨基酸序列，表现出与免疫球蛋白的Fab部分的降低的结合活性。
[0052]在一个可选的实施方式中，第29位的甘氨酸或丙氨酸被苏氨酸或色氨酸所取代，其中免疫球蛋白结合蛋白能够结合免疫球蛋白的Fe部分，且相对于在第29位包括丙氨酸的SpA氨基酸序列，表现出对免疫球蛋白的Fab部分增强的结合活性。
[0053]术语“序列同一性”表示对于两个核苷酸或两个氨基酸序列，当使用缺省空位权重通过例如GAP或BESTFIT等程序进行最优化对齐的时候，具有至少70%序列同一性，或至少80%序列同一性，或至少85%序列同一性，或至少90%序列同一性，或至少95%或以上的序列同一性。对于序列对比，一般采用一个序列作为参考序列(例如，亲代序列)，将待测序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将待测和参考序列输入计算机，如果需要的话指定相应的亚序列，然后指定序列算法程序参数。接下来序列比对算法根据指定的程序参数计算得出待测序列(们)相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0054]用于比较的最佳序列比对可以通过例如Smith和Waterman的局部同源性算法得出，Adv.App1.Math.2:482 (1981)，或由Needleman和Wunsch的同源性比对算法得出，J.Mol.B1l.48:443 (1970)，或由 Pearson 和 Lipman 的相似性查找方法得出，Proc.Natl.Acad Sc1.USA 85:2444 (1988),或由这些算法的计算机化运行得出(威斯康星遗传软件包(the Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA,遗传计算机小组(Genetics Computer Group), 575Science Dr.，Madison,威斯康星)，或由目测方法得出(大致参见 Ausubel 等,Current Protocols in Molecular B1logy)。适用于测定序列同一性和序列相似性的一个算法的例子是BLAST算法，其记载于Altschul等，J.Mol.B1l.215:403(1990)。进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(Nat1nalCenter for B1technology Informat1n)为公众所获得(通过登录国家健康研究所(Nat1nal Institutes of Health)NCBI网络服务器进入)。一般的,可以使用缺省程序参数进行序列比对，虽然也可以使用设定的参数。对于氨基酸序列，BLAST程序使用缺省的字长(W)为 3，期望值(E)为 10，以及 BL0SUM62 分数矩阵(参见 Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915 (1989))。
[0055]在一个实施方式中，根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白是基于分离的WtSpA的结构域(即，E、D、A、B或C)，其包括至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。在另一个实施方式中，根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白是基于SpA的Z结构域，其包括至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基。在另一个实施方式中，第29位的甘氨酸残基(即，对于E、D、A、B和C结构域而言)被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸外的氨基酸残基，或第29位的丙氨酸残基(即，对于Z结构域而言)被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基，其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。
[0056]在一些实施方式中，根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白包括至少两个或以上，或至少三个或以上，或至少四个或以上，或至少五个或以上所述的E、D、A、B、C和Z结构域，其中所述的每个两个或以上，或三个或以上，或四个或以上，或五个或以上的结构域包括至少第29位的甘氨酸(例如，对结构域E、D、A、B和C而言)或丙氨酸(对Z结构域而言)被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，且其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。
[0057]在一些实施方式中，根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白包括相同结构域的多聚体(例如，两个或以上的E区；两个或以上的D区；两个或以上的A区；两个或以上的B区；两个或以上的C区；以及两个或以上的Z区)，其中任何一个单体包括至少第29位的甘氨酸或丙氨酸被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。
[0058]替代第29位甘氨酸或丙氨酸的合适的氨基酸包括任何标准的天然产生的氨基酸，但不包括甘氨酸、丙氨酸和色氨酸，且在特定的实施方式中，不包括甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸。在一些实施方式中，所述天然产生的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和亮氨酸之一。在其它的实施方式中，所述天然产生的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸和酪氨酸之一。本领域所熟知的非天然产生的氨基酸和氨基酸衍生物同样可以被用于替代第29位的甘氨酸或丙氨酸。
[0059]示例性的SpA结构域修饰如表1所示。本发明所包括的免疫球蛋白结合蛋白可以包括任何下列组合:一个或以上，两个或以上，三个或以上，四个或以上，五个或以上，或六个或以上的结构域(E、D、A、B、C和Z)，其中每个结构域包括对第29位的修饰，且其中第29位的甘氨酸或丙氨酸被替换为除甘氨酸、丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基，且在一些实施方式中，被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸残基。本发明还涵盖了包括两个或以上相同种类的结构域(例如，两个或以上E区；两个或以上D区；两个或以上A区；两个或以上B区；两个或以上C区；以及两个或以上Z区)的免疫球蛋白结合蛋白，其中每个区包括对第29位的修饰，其中第29位的氨基酸残基被替换为除甘氨酸、丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基，且在一些实施方式中，被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸残基。
[0060]表1
[0061]
【权利要求】
1.一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，包含一个或多个分离的葡萄球菌(Staphyloccocus)蛋白A的E、D、A、B、C或Z结构域,所述一种或多种分离的结构域中包括:(i)当所述结构域为E、D、A、B或C结构域时，至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸外的氨基酸残基；或(ii)当结构域为Z结构域时，至少第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸或色氨酸外的氨基酸，其中免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白的Fe部分结合，而相对于第29位处包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白Fab部分的降低的结合。
2.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白，其中除丙氨酸、甘氨酸或色氨酸外的氨基酸选自由下列氨基酸组成的组:亮氨酸，赖氨酸和精氨酸。
3.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白，其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸残基，或至少第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸。
4.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白，其中至少第29位的甘氨酸残基或第29位的丙氨酸被替换为选自由下列氨基酸组成的组的氨基酸:赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、缬氨酸和酪氨酸。
5.权利要求1中的分离的免疫球蛋白结合蛋白，进一步包含葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A的羧基端结构域的至少一部分。
6.一种层析基质，包含偶联于固体载体的权利要求1所述的分离的免疫球蛋白结合蛋白。
7.一种多肽文库，包含权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白。
8.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白，进一步包含在一个或多个分离的结构域中用其它氨基酸残基对天冬酰胺的替换。
9.权利要求8中的免疫球蛋白结合蛋白，其中天冬酰胺在第23位。
10.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白，其中所述的免疫球蛋白是IgG或其片段。
11.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白。
12.—种宿主细胞，其包含权利要求11所述的核酸分子。
13.一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤: (a)提供包含一种或多种免疫球蛋白的样品； (b)在使得所述的一种或多种免疫球蛋白与权利要求6的基质结合的条件下使样品接触所述基质；和 (C)通过在适宜的条件下进行洗脱，回收所述的一种或多种结合的免疫球蛋白。
14.一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，包含一个或多个分离的葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B、C或Z结构域，其中一个或多个分离的结构域包括:(i)当所述结构域是E、D、A、B或C结构域时，至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸以外的氨基酸残基；或(ii)当所述结构域是Z结构域的时候，至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸外的氨基酸残基，其中免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白的Fe部分结合，且相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fab部分增加的结合。
15.权利要求14中的分离的免疫球蛋白结合蛋白，其中至少第29位的甘氨酸或第29位的丙氨酸被替换为苏氨酸或色氨酸。
16.一种层析基质，包括偶联于固体载体的权利要求14所述的分离的免疫球蛋白结合蛋白。
17.一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法，该方法包括以下步骤: (a)提供包括一种或多种免疫球蛋白的样品； (b)在使得所述的一种或多种免疫球蛋白与权利要求16的基质结合的条件下使样品接触所述基质；和 (C)通过在适宜的条件下进行洗脱，回收所述一种或多种结合的免疫球蛋白。
18.权利要求14中的免疫球蛋白结合蛋白，其中所述免疫球蛋白选自由IgG、IgA或IgM、或它们的片段所组成的组。
19.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白，其中所述免疫球蛋白的Fe部分是Fe融合蛋白的一部分。
【文档编号】C12N1/21GK104163866SQ201410389062
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2009年8月11日 优先权日:2008年8月11日
【发明者】S·斯佩克特 申请人:Emd密理博公司