编码双峰驼己糖激酶-Ⅱ的核苷酸序列、所编码己糖激酶-Ⅱ及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了编码双峰驼己糖激酶-Ⅱ的核苷酸序列、所编码己糖激酶-Ⅱ及其应用，涉及基因工程【技术领域】，本发明的主要技术方案为：一种编码双峰驼己糖激酶-Ⅱ的核苷酸序列，所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO:1第21-1861位。或者，所述核苷酸序列为在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO:1第21-1861位的核苷酸序列杂交且编码双峰驼己糖激酶-Ⅱ；或者，所述核苷酸序列与序列表中SEQ ID NO:1第21-1861位的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码双峰驼己糖激酶-Ⅱ。另一方面，本发明实施例还提供一种双峰驼己糖激酶-Ⅱ，由如上所述核苷酸序列编码。
【专利说明】编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序列、所编码己糖激 酶-II及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序 列、所编码己糖激酶-II，以及己糖激酶-II的应用。
【背景技术】
[0002] 己糖激酶（HeX〇kinaSe，HK)是调控细胞糖酵解的关键酶，能将葡萄糖转化为6-磷 酸葡萄糖，为肿瘤细胞提供能量以及物质合成所必需的重要碳源，从而促进恶性肿瘤的生 长和增殖。在HK的4种同工酶中，己糖激酶-II (HK- II )在肿瘤细胞中高表达，在多种常 见恶性肿瘤组织内呈高表达状态并且活性增强。HK- II主要存在于骨骼肌和脂肪组织中， 在胰岛素介导的葡萄糖磷酸化过程中起着重要的作用。
[0003] Giacchetti S等（2000)研究发现HK-II属胰岛素敏感型，正常情况下，仅在心脏、 骨髂肌和脂肪组织中微量表达。Geschwind JH等（2002)研究发现，HK-II除具有催化糖酵 解活性的作用，还有拮抗细胞凋亡的功能。HK-II蛋白分子与VDAC、Bcl-2家族成员等构建 线粒体PTP，调控线粒体膜通透性，拮抗线粒体途径的细胞凋亡发生。因此，HK-II是恶性肿 瘤细胞生存和防御机制之一。
[0004] Mathupala SP等（2009)研究表明肿瘤细胞高表达HK-II受多因素调控，在基因水 平上，肿瘤细胞HK-II基因拷贝数增多。通过Southern blot及荧光原位杂交分析，发现大 鼠肝癌细胞比正常肝细胞的HK-II基因扩增了至少5倍。Pedersen PL等（2002)研究发现 在转录水平上，HK-II基因启动子可被葡萄糖、低氧条件、双丁酰环磷腺苷、佛波酯、突变的 P53以及胰岛素等信号激活，使HK-II基因转录显著提高。Ahn KJ，Hwang HS等（2009)研 究发现，高表达且与线粒体连接型的HK-II促进了肿瘤高糖酵解，准备了充足的能量和前 体物质供细胞合成代谢，为肿瘤生存和增殖提供了十分有利的条件。
[0005] Ves ergaard H等（1995)还研究了 2型糖尿病个体中骨骼肌HK-II酶的活性下降 以及HK-II基因表达下降，因而推测2型糖尿病患者存在HK-II基因的遗传缺陷。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明实施例提供一种编码双峰驼双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序 列，即提供双峰驼中双峰驼己糖激酶-II基因的CDNA序列，以及由该序列编码的双峰驼己 糖激酶-II。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
[0008] -方面，本发明实施例提供了一种编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序列，
[0009] 所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO: 1第21-1861位。
[0010] 或者，所述核苷酸序列为在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO: 1第21-1861位 的核苷酸序列杂交且编码双峰驼己糖激酶-II。
[0011] 或者，所述核苷酸序列与序列表中SEQ ID NO: 1第21-1861位的核苷酸序列具有 90%以上同源性且编码双峰驼己糖激酶-Π 。
[0012] 另一方面，本发明实施例还提供一种双峰驼己糖激酶-II，由如上所述核苷酸序 列编码。
[0013] 优选的双峰驼己糖激酶-II由序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸组成；可将葡 萄糖转化为6-磷酸葡萄糖。
[0014] 或者，双峰驼己糖激酶-II为序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经过一个 或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖功 能的衍生蛋白质。
[0015] 另一方面，本发明实施例还提供一种重组表达载体，包含如上所述核苷酸序列，或 编码如上所述蛋白质。
[0016] 另一方面，本发明实施例还提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如 上所述的重组表达载体。
[0017] 另一方面，本发明实施例还提供一种如上双峰驼己糖激酶-II在将葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖中的应用。
[0018] 另一方面，本发明实施例还提供一种获取编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序列 的方法，该方法中：
[0019] PCR的正向引物为：
[0020] SEQ ID N0:3:5' -ACTGCCACGGTACCTTAAAC-3' ；反向引物为：
[0021] SEQ ID N0:4:5,-GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3，。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0023] 骆驼同其他动物相比有强健的骨骼肌和特殊的驼峰的脂类代谢，使骆驼在恶劣的 沙漠环境中具有持久的耐力，可以适应沙漠中食物的匮乏及水源的奇缺，HK- II是主要存在 于骨骼肌和脂肪组织中，在胰岛素介导的葡萄糖磷酸化过程中起着重要作用的酶。本发明 内容为今后研究双峰驼HK- II提供基础资料。
[0024] 本发明研究双峰驼的HK-II序列及进化树可以直观的表现出双峰驼HK-II序列与 其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼及其他物种的糖酵解研究提供实验数据， 对研究双峰驼及其他物种以及人类的恶性肿瘤的生长和增殖提供一定的理论依据并对胰 岛素介导的葡萄糖磷酸化过程的研究起到了很重要的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1中双峰驼己糖激酶-II基因 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0026] 图2a、2b、2c为构建系统发生树所用己糖激酶-II氨基酸同源性比较；
[0027] 图3为不同物种己糖激酶-II氨基酸序列系统进化树。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0029] 以下实施例中，所用百分比浓度如未特定指明，均为体积百分比浓度。
[0030] 实施例1 :双峰驼HK- II基因 cDNA序列的克隆
[0031] 1、组织分离（Isolation)
[0032] 从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中 冷冻后于_70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
[0033] 2、总 RNA 的分离（Total RNA isolation)
[0034] (1)提取RNA的准备工作
[0035] 玻璃制品用0. IM的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍， 180°C烘烤4小时。
[0036] 匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. 1%的DEPC(焦碳酸二乙 酯）水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5 %的SDS (十二烷基硫酸钠） 处理。
[0037] Tip头、EP管用0. 1 %的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
[0038] 双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加 0. ImlDEPC液，室温放置过夜， 高压灭菌30分钟DEPC失活。
[0039] (2)组织总RNA提取
[0040] 取 IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有 Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟，吸取上清液，15-30°C温育5分钟， 加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2-3分钟，4°C 12000g离心15 分钟。吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10 分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加 lml75v/v%乙醇洗涤RNA，4°C 7500g离 心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水（RNase free)中分装，-70°C保存。
[0041] (3)组织总RNA的鉴定
[0042] 通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如 下：电泳槽用RNA清洗液（IOOmM NaOH，ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反 复冲洗数次后倒入I X TBE待用，琼脂糖凝胶用I X TBE配制。在IOul上样缓冲液（2 X TBE， 13%菲可，0. 1%溴酚兰，7M尿素）中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放 入冰水中2 - 3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。
[0043] 3.全长 cDNA 的克隆（Cloning of Full-length cDNA)
[0044] (1)引物设计及合成
[0045] 根据 GenBanK 发表的人（Accession No:CAA86476. 2)、鼠 （Accession Νο:ΑΑΗ54472· 1)、牛（Accession Ν〇:ΧΡ_002691235· 1)等物种的 HK- II基因 mRNA 序列 ORF 侧翼同源序列，设计如下引物用于PCR扩增，以获得双峰驼HK- II基因 cDNA序列。引物用 Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序 列分别为SEQ ID NO: 3 (正向）和SEQ ID NO:4 (反向），序列信息如下：
[0046] SEQ ID N0:3(正向）：5, -ACTGCCACGGTACCTTAAAC-3,；
[0047] SEQ ID N0:4(反向）：5, -GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3，。
[0048] (2) RT-PCR 扩增
[0049] 按大连宝生物反转录试剂盒（BcaBEST RNA PCR Kit Ver. I. 1)要求进行反转录。 反转录反应液组成：l〇ul 2XBca 1st Buffer，4ul 25Mm MgS04，lul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample，I. 5ul Rnase Free dH20,总体系为 20ul。反转录反应条件：65°C I 分钟，30°C 5 分钟（15分钟-30分钟内匀速升温），65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件： 97 °C变性5分钟；95 °C 30秒一55 °C 30秒一72 °C 1分钟，如此进行30次循环；72 °C延伸10 分钟，4 °C保存。
[0050] (3)克隆和测序
[0051] PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过 程如下：尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入I. 5mlEP管中。按每IOOmg琼脂糖加入 300ulSl液的比例加 Sl液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg离心 1分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒。倒掉管中液体， 在吸附柱中加入500ul Wl液，静置1分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体。离心1分 钟，将吸附柱放入一个干净的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置1分钟后， IOOOOg离心1分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
[0052] 回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程 如下：在 EP 管中制备下列连接反应液：pMD 18-T Vector(50ng/ul)0.5ul，DNA 20-40ng， Solution 15ul，加 dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟（过夜也可以），产物 用于转化感受态细胞。
[0053] 质粒的转化。从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。IOOul感受态细 胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加 400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取IOOul铺于LB平板上，平板含0. 1 % (V/V)的 氨节青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10-15小时。
[0054] 转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸 取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模 板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker-起进行琼脂糖凝胶电泳（结 果如附图1所示），鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在 平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1% (V/V)的 青霉素钠（l〇〇mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
[0055] 质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转 化培养的菌液加入I. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不 够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温 和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸 附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中 加入500ulWl，静置1分钟，离心15秒，倒掉液体。离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的 I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置1分钟后，离心1分钟，EP管中液体即 为回收的质粒。
[0056] 质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切 法鉴定。本研究具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-T Vector图，选择内切酶Bam H I和 Hin dill，保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam H I lul，Hin dIIIlul，10XK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电 泳检测。
[0057] 重组质粒的测序。取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
[0058] 实施例2 :双峰驼HK- II基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
[0059] 1、双峰驼HK- II的序列信息与生物信息学分析
[0060] 本发明新的双峰驼HK- II⑶S的长度为288Ibp，详细序列见SEQ ID NO: 1。根据全 长CDS推导出双峰驼嗅觉感受器的氨基酸序列，共945个氨基酸残基，详见SEQ ID N0:2,在 线预测（ http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)结果显不，其分子量为 105586.58 道尔顿，等电点（Pl)为5. 50。
[0061] 2、HK- II基因编码序列系统发生树构建
[0062] 在GenBank上搜索并获得人、鼠等八种物种的八条HK- II基因的编码蛋白序列，力口 上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树（见附 图3)。结果显示：双峰驼HK- II基因同牛的亲缘关系最近。
[0063] 双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的糖激酶-II基因编码氨基酸序列 同源性比较结果见附图2a、2b、2c。各物种HK- II的氨基酸序列相似性见表1，各物种HK- II 氨基酸的个数及分子量见表2,各物种HK- II氨基酸的比例（％)见表3。
[0064] 表1 :各物种HK- II的氨基酸序列相似性
【权利要求】
1. 一种编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是序列 表中 SEQ ID NO: 1 第 21-1861 位。
2. -种编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列在高严 谨条件下与权利要求1所述的核苷酸序列杂交且编码双峰驼己糖激酶-II。
3. -种编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列与权利 要求1所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码双峰驼己糖激酶-II。
4. 一种双峰驼己糖激酶-II，由权利要求1-3任一项所述核苷酸序列编码。
5. 根据权利要求4所述的双峰驼己糖激酶-II，其特征在于，由序列表中SEQ ID N0:2 所示的氨基酸组成；可将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖。
6. -种双峰驼己糖激酶-II，其特征在于，为序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将葡萄糖转化为6-磷酸 葡萄糖功能的衍生蛋白质。
7. -种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述核苷酸序列，或编码 权利要求4-6任一项所述蛋白质。
8. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的重组表达载体。
9. 一种权利要求4-6任一项所述双峰驼己糖激酶-II在将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄 糖中的应用。
10. 获取编码双峰驼己糖激酶-II的核苷酸序列的方法，其特征在于： PCR的正向引物为： SEQ ID N0:3:5' -ACTGCCACGGTACCTTAAAC-3' ；反向引物为： SEQ ID N0:4:5' -GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'。
【文档编号】C12N15/10GK104388445SQ201410410751
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】陈钢粮, 吉日木图 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司