编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列、双峰驼嗅觉感受器及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列、双峰驼嗅觉感受器及其应用，涉及基因工程【技术领域】。本发明的主要技术方案为：一种编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列，所述核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO:1第21-1861位。或者，所述核苷酸序列在高严谨条件下与SEQ?ID?NO:1第21-1861位核苷酸序列杂交且编码双峰驼嗅觉感受器。或者，所述核苷酸序列与SEQ?ID?NO:1第21-1861位核苷酸序列具有90％以上同源性且编码双峰驼嗅觉感受器。一种双峰驼嗅觉感受器，由如上所述核苷酸序列编码。优选的的双峰驼嗅觉感受器由序列表中SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸组成。
【专利说明】编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列、双峰驼嗅觉感受器 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序 列、所编码的双峰驼嗅觉感受器及其应用。
【背景技术】
[0002] 脊椎动物的嗅觉感受器（olfactory receptor)通常位于鼻腔内由支持细胞、嗅细 胞和基细胞组成的嗅上皮中。在嗅上皮中，嗅觉细胞的轴突形成嗅神经。嗅束膨大呈球状， 位于每侧脑半球额叶的下面，嗅神经进入嗅球，嗅球和端脑是嗅觉中枢。
[0003] 被称作"沙漠之舟"的骆驼在缺水的沙漠中，骆驼的身体构造及习性跟沙漠生活有 密切的关系，除了骆驼的身体很高、脖子长，在沙漠里看得很远可以找到水源外，另外一个 很重要的原因在于骆驼的嗅觉相当灵敏，如顺风骆驼可嗅到数公里甚至几十公里以外的气 味，判断出很远地方的水源。沙漠里的旅行队往往靠骆驼的嗅觉去找水。
[0004] 由于人能够识别和记忆约1万种不同的气味，所以嗅觉一直被人们研究。2004年 诺贝尔生理学或医学奖得主RichardAxel和Linda B. Buck在他们发表的基础性论文中阐 明了嗅觉系统的工作原理。研究表明他们发现了含约1，〇〇〇个不同基因的一个气味受体基 因大家族（占我们基因总数的3% )，这些基因构成了相同数量的嗅觉受体类型，而这些受 体位于嗅觉受体细胞内。每一种嗅觉受体细胞只拥有一种类型的气味受体，每一种受体能 探测到有限数量的气味物质。嗅觉受体对某几种气味是高度特异性的。尽管气味受体只有 约1000种，但它们可以产生大量组合，从而形成大量的气味识别模式，这也是人类和动物 能够辨别和记忆不同气味的基础。嗅觉系统工作时，嗅觉受体细胞会发出神经纤维信息到 嗅小球，那里大约有2000多个确定的微区嗅小球，嗅小球的数量大约是嗅觉受体细胞类型 数量的两倍之多。嗅小球可以携带同种受体的受体细胞聚集其神经纤维进入相同的嗅小 球，即来自具有相同受体的细胞的信息会聚到同一嗅小球。随后嗅小球激活僧帽细胞的神 经细胞。每种僧帽细胞只能由一个嗅小球激活，信息流的"特异性"也就因而保留。僧帽细 胞然后将信号传输到大脑其他地方。结果，来自多种气味受体的信息整合成每种气味所具 有的"特征性的模式"，使得我们可以自由地感受到识别的气味。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明实施例提供编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列，即提供双峰 驼嗅觉感受器基因的cDNA序列，以及由该序列编码的双峰驼嗅觉感受器。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
[0007] -方面，本发明实施例提供了一种编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列，其特征 在于，所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO: 1第21-1861位。
[0008] 或者，所述核苷酸序列在高严谨条件下与SEQ ID NO: 1第21-1861位核苷酸序列 杂交且编码双峰驼嗅觉感受器。
[0009] 或者，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 1第21-1861位核苷酸序列具有90%以上同 源性且编码双峰驼嗅觉感受器。
[0010] 另一方面，本发明实施例还提供一种双峰驼嗅觉感受器，由如上所述核苷酸序列 编码。
[0011] 优选的的双峰驼嗅觉感受器由序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸组成。
[0012] 或者双峰驼嗅觉感受器为序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经过一个或几 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得的衍生蛋白质。
[0013] 另一方面，本发明实施例还提供一种重组表达载体，其特征在于，包含如上所述核 苷酸序列，或编码如上所述蛋白质。
[0014] 另一方面，本发明实施例还提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如 上所述的重组表达载体。
[0015] 另一方面，本发明实施例还提供一种获取编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列的 方法，其特征在于 ：
[0016] PCR的正向引物为：
[0017] SEQ ID N0:3:5' -ATGGAGCCAGAACCTGGGGCCAA-3' ；反向引物为：
[0018] SEQ ID N0:4:5,-CATTGGCCCCAGGTTCTGGCTCC-3，。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0020] 由于骆驼同其他动物相比有较强的嗅觉能力，可以在顺风的情况下嗅到数公里甚 至几十公里以外的气味，判断出很远地方的水源。适应沙漠中缺水的环境，这与骆驼的嗅 觉感受器有很重要的关系，所以骆驼嗅觉感受器的研究有非常重要的意义。本发明参考了 其他八种动物的嗅觉感受器的基因序列，克隆并测序得到了双峰驼嗅觉感受器基因的cDNA 序列，并对八种物种嗅觉感受器基因的CDS序列进行同源性比较并制作出进化树，为今后 研究双峰驼嗅觉感受器提供基础资料。
[0021] 本发明中的双峰驼的嗅觉感受器序列及进化树可以直观的表现出双峰驼嗅觉感 受器与其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼嗅觉细胞中嗅觉受体类型提供实验 数据，同时对研究双峰驼及其他物种以及人类气味的特异性及气味识别的研究提供一定的 理论依据，可以促进生理学及仿生学的发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为实施例1中双峰驼嗅觉感受器基因 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0023] 图2为构建系统发生树所用嗅觉感受器氨基酸同源性比较；
[0024] 图3为不同物种嗅觉感受器氨基酸序列系统进化树。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0026] 以下实施例中，所用百分比浓度如未特定指明，均为体积百分比浓度。
[0027] 实施例1 :双峰驼嗅觉感受器基因 cDNA序列的克隆
[0028] 1、组织分离（Isolation)
[0029] 从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中 冷冻后于_70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
[0030] 2.总 RNA 的分离（Total RNA isolation)
[0031] (1)提取RNA的准备工作
[0032] 玻璃制品用0. 1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍， 180°C烘烤4小时。
[0033] 匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. 1%的DEPC(焦碳酸二乙 酯）水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5 %的SDS (十二烷基硫酸钠） 处理。
[0034] Tip头、EP管用0. 1 %的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
[0035] 双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0. lmlDEPC液，室温放置过夜， 高压灭菌30分钟DEPC失活。
[0036] (2)组织总RNA提取
[0037] 取 100mg在液氮中冻存的组织样放入有 lml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟，吸取上清液，15-30°C温育5分钟， 加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2-3分钟，4°C 12000g离心15 分钟。吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10 分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加 lml 75v/v%乙醇洗涤RNA，4°C 7500g离 心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水（RNase free)中分装，-70°C保存。
[0038] (3)组织总RNA的鉴定
[0039] 通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如 下：电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH，ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反 复冲洗数次后倒入1 X TBE待用，琼脂糖凝胶用1 X TBE配制。在10ul上样缓冲液（2 X TBE， 13%菲可，0. 1%溴酚兰，7M尿素）中加入lul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放 入冰水中2 - 3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。
[0040] 3.全长 cDNA 的克隆（Cloning of Full-length cDNA)
[0041] ⑴引物设计及合成
[0042] 根据 GenBanK 发表的人（Accession No:AAF37318. 1)、鼠 （Accession N〇:AAL61049. 1)、牛（Accession N〇:XP_002695781. 1)等物种的嗅觉感受器基因 mRNA序列 0RF侧翼同源序列，设计如下引物用于PCR扩增，以获得双峰驼嗅觉感受器基因 cDNA序列。 引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核 苷酸序列分别为SEQ ID N0:3(正向）和SEQ ID N0:4(反向），序列信息如下：
[0043] SEQ ID N0:3(正向）：5, -ATGGAGCCAGAACCTGGGGCCAA-3'
[0044] SEQ ID N0:4(反向）：5, -CATTGGCCCCAGGTTCTGGCTCC-3'
[0045] (2) RT-PCR 扩增
[0046] 按大连宝生物反转录试剂盒（BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1. 1)要求进行反转录。 反转录反应液组成：l〇ul 2XBca 1st Buffer，4ul 25Mm MgS04，lul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer,lul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH20,总体系为 20 ul。反转录反应条件：65°C1 分钟，30°C5 分钟（15分钟-30分钟内匀速升温），65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件： 97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C 1分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10 分钟，4 °C保存。
[0047] (3)克隆和测序
[0048] PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过 程如下：尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1. 5mlEP管中。按每100mg琼脂糖加入 300ulSl液的比例加 S1液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，lOOOOg离心 1分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液，10000g离心15秒。倒掉管中液体， 在吸附柱中加入500ul W1液，静置1分钟后，10000g离心15秒，倒掉管中液体。离心1分 钟，将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置1分钟后， 10000g离心1分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
[0049] 回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程 如下：在 EP 管中制备下列连接反应液：pMD 18-T Vector(50ng/ul)0.5ul，DNA 20-40ng， Solution 15ul，加 dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟（过夜也可以），产物 用于转化感受态细胞。
[0050] 质粒的转化。从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。100ul感受态细 胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加 400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取100ul铺于LB平板上，平板含0. 1 % (V/V)的 氨节青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10-15小时。
[0051] 转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸 取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模 板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker-起进行琼脂糖凝胶电泳（结 果如附图1所示），鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在 平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1% (V/V)的 青霉素钠（l〇〇mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
[0052] 质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转 化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不 够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温 和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸 附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中 加入500ulWl，静置1分钟，离心15秒，倒掉液体。离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的 1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置1分钟后，离心1分钟，EP管中液体即 为回收的质粒。
[0053] 质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切 法鉴定。本研究具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-T Vector图，选择内切酶Bam Η I和 Hin dill，保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam Η I lul，Hin dIIIlul，10XK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电 泳检测。
[0054] 重组质粒的测序。取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
[0055] 双峰驼嗅觉感受器基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
[0056] 1、双峰驼嗅觉感受器的序列信息与生物信息学分析
[0057] 本发明新的双峰驼嗅觉感受器⑶S的长度为873bp，详细序列见SEQ ID N0:1，其 中27-29位为起始密码子ATG，900-902位为终止密码子TGA，27-902位为编码蛋白质区域 (CDS)。根据全长CDS推导出双峰驼嗅觉感受器的氨基酸序列，共291个氨基酸残基，详见 SEQ ID N0:2,在线预测（ http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)结果显不，其分子 量为31738. 41道尔顿，等电点（pi)为8. 36。
[0058] 2、嗅觉感受器基因编码序列系统发生树构建
[0059] 在GenBank上搜索并获得人、鼠等八种物种的八条嗅觉感受器基因的编码蛋白序 列，加上本发明获得的SEQ ID N0. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树 (见附图3)。结果显示：双峰驼嗅觉感受器基因同鼠、马、狗、大熊猫的进化距离相对最近， 且与鸭嘴兽的进化距离最远。
[0060] 双峰能和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的嗅觉感受器基因编码氣基酸序列 同源性比较结果见附图2。不同物种嗅觉感受器氨基酸序列相似性见表1，各物种嗅觉感受 器氨基酸的个数及分子量见表2,各物种嗅觉感受器氨基酸的比例（％)见表3。
[0061] 表1 :不同物种嗅觉感受器氨基酸序列相似性
[0062]
【权利要求】
1. 一种编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是序列表 中 SEQ ID NO: 1 第 21-1861 位。
2. -种编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列在高严谨 条件下与权利要求1所述的核苷酸序列杂交且编码双峰驼嗅觉感受器。
3. -种编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列与权利要 求1所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码双峰驼嗅觉感受器。
4. 一种双峰驼嗅觉感受器，由权利要求1-3任一项所述核苷酸序列编码。
5. 根据权利要求4所述的双峰驼嗅觉感受器，其特征在于，由序列表中SEQ ID N0:2所 示的氨基酸组成。
6. -种双峰驼嗅觉感受器，其特征在于，为序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得的衍生蛋白质。
7. -种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述核苷酸序列，或编码 权利要求4-6任一项所述蛋白质。
8. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的重组表达载体。
9. 获取编码双峰驼嗅觉感受器的核苷酸序列的方法，其特征在于： PCR的正向引物为： SEQ ID N0:3:5' -ATGGAGCCAGAACCTGGGGCCAA-3' ； 反向引物为： SEQ ID N0:4:5' -CATTGGCCCCAGGTTCTGGCTCC-3'。
【文档编号】C12N15/10GK104152458SQ201410410611
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司