利用微藻发酵生产生物柴油的方法
【专利摘要】本发明属于能源【技术领域】，具体是涉及一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：(1)微藻培养；(2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵；菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻20-30g/L，柠檬酸钠3-5g/L，邻甲苯胺1.5-2.5g/L，氯化钠10-15g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁3-5g/L；(3)将发酵产物进行油脂的提取；(4)将上述油脂进行酶催化反应；本发明的利用微藻发酵生产生物柴油，产油速度快，生产成本低。
【专利说明】利用微藻发酵生产生物柴油的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于能源【技术领域】，具体是涉及一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法。
【背景技术】
[0002] 生物柴油是一种清洁的可再生能源，也称之为"再生燃油"或"生物质燃料"，是优 质的石油柴油代用品，通常所指的生物柴油是以大豆、油菜籽、棉籽等油料作物，油棕、黄连 木等油料林木果实以及动物油脂、废餐饮油等为原料，在催化剂（碱或酸）的作用下与甲醇 进行脂交换反应生成的脂肪酸甲酯。
[0003] 随着环境保护和石化资源枯竭间题的日益突出，生物柴油已经成为新能源研制和 开发的热点，引起了世界各国政府的高度重视。世界各国纷纷根据本国国情选择合适的油 脂原料生产生物柴油。欧洲和北美地区耕地资源丰富，农业高度发达。因此欧洲各国，都采 用菜籽油生产生物柴油，美国主要是利用高产转基因大豆油为原料。东南亚国家适于种植 油棕，棕榈油成为当地发展生物柴油的重要原料。世界可再生能源大国巴西，主要利用蓖麻 籽油进行生产生物柴油。
[0004] 最近两年我国生物柴油的产能快速扩张，许多企业盲目上马生物柴油项目，并且 不断扩大生产规模，已经开始出现严重后果。主要表现在：大型生物柴油企业无法保证原料 供应，开工率严重不足；在国际市场原油价格高位回落，生物柴油生产原料价格上涨，尤其 是食用植物油价格大幅上涨以后，使用食用植物油生产生物柴油的企业普遍亏损。因此，依 托农业油脂为原料生产生物柴油并不现实。
[0005] 中国发明专利申请号为201310040334. 7的专利申请公开了一种利用城市生活污 水培养微藻生产生物柴油的方法及系统，包括如下步骤：
[0006] 降解有机废水并培养微藻：微藻通过光合作用及包括氮磷的营养物质合成藻体自 身细胞物质并释放出氧气，加入的菌株群利用水中氧气对有机污染物进行降解，为微藻生 长提供应用物质，以维持微藻的生长繁殖；
[0007] 收集微藻：采用滤膜收集微藻，实现藻水分离；
[0008] 生成生物柴油：对收集的微藻采用超声波破碎微波辅助法提取油脂，在碱性条件 下加入甲醇或者乙醇作为催化剂将油脂转化为脂肪酸甲酯，再向反应体系中加入乙醚和盐 溶液混合后分层，分离出乙醚相候再进行真空蒸馏获得生物柴油。
[0009] 上述发明利用超声波破碎油脂，利用甲醇或乙醇作为催化剂转化油脂，虽然所使 用的原料的价格都比较低，但是整个反应的效率并不高，因为利用甲醇和乙醇转化油脂的 效率并不高。
[0010] 中国专利申请号为201310600827. 1，申请公布号为CN103642579A的专利申请公 开了一种用微藻制备生物柴油的方法，包括如下步骤：
[0011] ⑴微藻培养：以微藻为原料将其培养至对数生长期，以〇. 2-0. 4的接种密度接种 至新鲜培养基，培养温度为20-30°C，培养光照条件为3000-40001X，收集微藻细胞，离心浓 缩，进行冷冻干燥，然后将藻粉充分研磨备用；
[0012] (2)微藻油脂的提取：称取一定量藻粉，加入氯仿甲醇水混合液进行提取， 氯仿：甲醇：水的体积比为1 : 2 : 0. 8-3.0,其中藻粉加入量与氯仿甲醇水的比例 为Ig : lOOmL，混匀静置3-5h，收集上清液，加入氯仿水，使氯仿：甲醇：水的比例为 I : 1 : 0.9,收集下层氯仿层，并于60°C蒸去氯仿，得微藻油脂；
[0013] (3)微藻生物柴油制备的酶催化反应：将步骤（2)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶， 脂肪酶添加量为步骤2中微藻油脂重量的20-30%，30-40°〇反应48-6011，得生物柴油。
[0014] 上述微藻油脂首先采用氯仿甲醇水混合液进行提取，然后蒸去氯仿，得微藻油脂； 最后利用甲醇和脂肪酶对上述得到的微藻油脂进行催化反应，得到生物柴油，酶的催化效 率虽然高，但是由于酶的反应受到多种物质的影响，对反应条件较为苛刻，不能达到最大反 应速度和反应效率，生产成本较高，不能达到市场化的要求。
【发明内容】
[0015] 本发明的主要目的在于提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法。本发明的利 用微藻发酵生产生物柴油，产油速度快，生产成本低。
[0016] 本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
[0017] 本发明的目的是提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
[0018] (1)微藻培养；
[0019] (2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为， 微藻20-30g/L，柠檬酸钠3-5g/L，邻甲苯胺I. 5-2. 5g/L，氯化钠10-15g/L，磷酸二氢钾 0. 5-lg/L，硫酸镁 3-5g/L;
[0020] (3)将发酵产物进行油脂的提取；
[0021] (4)将上述油脂进行酶催化反应。
[0022] 所述微藻优选为小球微藻或绿色巴夫藻。
[0023] 所述微藻的接种密度为0. 4-0. 5,所述微藻的培养温度为28°C，所述微藻的培养 光照为3500lx。
[0024] 所述发酵温度为30_32°C，所述发酵时间为2-3天。
[0025] 所述发酵的接种量为5-10%。
[0026] 所述发酵的pH值为5-6。
[0027] 所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC NO. M 2010119,所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO :M 209007。
[0028] 所述发酵培养基的配方为，微藻25-30g/L，柠檬酸钠4-5g/L，邻甲苯胺I. 5-2. Og/ L，氯化钠10_12g/L，磷酸二氢钾0. 5-lg/L，硫酸镁3-4g/L。
[0029] 所述步骤⑶中，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是，将发酵产物用氯仿和甲醇 进行提取，发酵产物：氯仿：甲醇的体积比为1-2 : 1 : 1-2,混匀静置2-3h，收集上清液， 加入氯仿和甲醇，使上清液：氯仿：甲醇的比例为1-2 : 2 : 1-2,收集下层氯仿层，并于 60 °C蒸去氯仿，得油脂。
[0030] 所述步骤⑷中，将上述油脂进行酶催化反应的步骤是，将步骤（3)中所得油脂加 入甲醇和脂肪酶，脂肪酶添加量为油脂重量的20-30%，35-40°C反应40-50h，得生物柴油， 所述甲醇和脂肪酶的重量配比为1-2 : 1。其中脂肪酶为假丝酵母脂肪酶、铜铝假单胞菌脂 肪酶或曲霉脂肪酶中的任意一种或多种的混合物。
[0031] 本发明的有益效果在于：本发明的通过对粉碎的微藻进行混合发酵，混合发酵菌 采用哈茨木霉菌和根霉菌，哈茨木霉菌和根霉菌将微藻作为氮源和碳源，使组成微藻的部 分得以分解为油脂，微藻内的油脂从上述破碎的微藻细胞流出微藻细胞外，从而使培养后 的微藻不需要进行粉碎操作，只需要进行收集，将大大的节省制备的时间和成本。本发明 不仅可以通过一步法得到微藻内通过微藻生长积累的油脂，而且可以将微藻细胞分解成油 月旨，使微藻得以最大程度的利用，极大的提高生物柴油的产率和生产效率，极大的降低了生 物柴油的生产成本。
[0032] 本发明的微藻选用小球微藻或绿色巴夫藻，可以使微藻内积累油脂的速度更快， 积累量更多。
[0033] 本发明的所述微藻的接种密度为0. 4-0. 5,所述微藻的培养温度为28°C，所述微 藻的培养光照为35001X，可以最大程度的积累油脂和使微藻生长速度最快。
[0034] 本发明的所述发酵温度为30-32?，所述发酵时间为2-3天，所述发酵的接种量为 5-10 %，所述发酵的pH值为5-6,采用所述的发酵条件可以使哈茨木霉菌和根霉菌最大程 度的生长，并且是微藻细胞得以发酵生成油脂。
【具体实施方式】
[0035] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。
[0036] 实施例1
[0037] 本发明提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
[0038] (1)小球微藻培养；所述微藻的接种密度为0. 4,所述微藻的培养温度为28°C，所 述微藻的培养光照为35001x ;
[0039] (2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为， 微藻25g/L，柠檬酸钠4g/L，邻甲苯胺2. Og/L，氯化钠10g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，硫酸镁 4g/L ;所述发酵温度为30-32?，所述发酵时间为2-3天；所述发酵的接种量为5%，所述 发酵的pH值为5-6 ;所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为 CCTCC NO. M 2010119,所述根霉菌为根霉 Rhizopus，保藏编号为 CCTCC NO :M 209007。
[0040] (3)将发酵产物进行油脂的提取；步骤是，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是， 将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物：氯仿：甲醇的体积比为2 : 1 : 1，混匀静 置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液：氯仿：甲醇的比例为I : 1 : 1，收集下 层氯仿层，并于60°C蒸去氯仿，得油脂。
[0041] (4)将上述油脂进行酶催化反应，步骤是，将步骤（3)中所得油脂加入甲醇和脂肪 酶，脂肪酶添加量为油脂重量的20%，35-40°C反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪 酶的重量配比为1 : 1。其中，脂肪酶为假丝酵母脂肪酶。
[0042] 实施例2
[0043] 本发明提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
[0044] (1)小球微藻培养；所述微藻的接种密度为0. 5,所述微藻的培养温度为28°C，所 述微藻的培养光照为35001x ;
[0045] (2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为， 微藻30g/L，柠檬酸钠5g/L，邻甲苯胺I. 5g/L，氯化钠12g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁3g/ L ;所述发酵温度为30-32°C，所述发酵时间为2-3天；所述发酵的接种量为10%，所述发酵 的pH值为5-6 ;所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC Ν0.Μ 2010119,所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO :M 209007。
[0046] (3)将发酵产物进行油脂的提取；步骤是，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是， 将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物：氯仿：甲醇的体积比为I : 1 : 2,混匀静 置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液：氯仿：甲醇的比例为1 : 2 : 1，收集下 层氯仿层，并于60°C蒸去氯仿，得油脂。
[0047] (4)将上述油脂进行酶催化反应，步骤是，将步骤（3)中所得油脂加入甲醇和脂肪 酶，脂肪酶添加量为油脂重量的30%，35-40°C反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪 酶的重量配比为2 : 1。其中，脂肪酶为铜铝假单胞菌脂肪酶。
[0048] 实施例3
[0049] 本发明提供一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，包括如下步骤：
[0050] (1)小球微藻培养；所述微藻的接种密度为0. 45,所述微藻的培养温度为28°C，所 述微藻的培养光照为35001x。
[0051] (2)将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为， 微藻25g/L，柠檬酸钠4g/L，邻甲苯胺2g/L，氯化钠14g/L，磷酸二氢钾0. 8g/L，硫酸镁4g/ L ;所述发酵温度为30-32°C，所述发酵时间为2-3天；所述发酵的接种量为8%，所述发酵 的pH值为5-6 ;所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC Ν0.Μ 2010119,所述根霉菌为根霉Rhizopus，保藏编号为CCTCC NO :M 209007。
[0052] (3)将发酵产物进行油脂的提取；步骤是，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是， 将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产物：氯仿：甲醇的体积比为2 : 1 : 2,混匀静 置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇，使上清液：氯仿：甲醇的比例为2 : 2 : 1，收集下 层氯仿层，并于60°C蒸去氯仿，得油脂。
[0053] (4)将上述油脂进行酶催化反应，步骤是，将步骤（3)中所得油脂加入甲醇和脂肪 酶，脂肪酶添加量为油脂重量的25%，30-35°C反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪 酶的重量配比为2 : 1。其中，脂肪酶为曲霉脂肪酶。
[0054] 实施例4
[0055] 对实施例1-3制备的生物柴油按照GB/T20828-2007标准进行了测试，以中国专利 申请号为：201310600827. 1的专利申请的实施例1-3制备的生物柴油作为对比例1-3做对 比分析，结果如表1所示。
[0056] 表1实施例1-3制备的生物柴油成品指标测试结果
[0057]
[0058]
【权利要求】
1. 一种利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，包括如下步骤： (1) 微藻培养； (2) 将上述培养的微藻进行发酵，发酵菌为哈茨木霉菌和根霉菌，发酵培养基为，微藻 20-30g/L，柠檬酸钠3-5g/L，邻甲苯胺1. 5-2. 5g/L，氯化钠10-15g/L，磷酸二氢钾0. 5-lg/ L，硫酸镁3-5g/L ; (3) 将发酵产物进行油脂的提取； (4) 将上述油脂进行酶催化反应。
2. 如权利要求1所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述微藻为小 球微藻或绿色巴夫藻。
3. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述微藻的 接种密度为0. 4-0. 5,所述微藻的培养温度为28°C，所述微藻的培养光照为35001x。
4. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵温 度为30-32°C，所述发酵时间为2-3天。
5. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵的 接种量为5-10%。
6. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵的 pH值为5-6。
7. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述哈茨木 霉菌为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏编号为CCTCC NO:M 2010119,所述根霉菌 为根霉 Rhizopus，保藏编号为 CCTCC NO :M 209007。
8. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述发酵培 养基的配方为，微藻25-30g/L，柠檬酸钠4-5g/L，邻甲苯胺1. 5-2. Og/L，氯化钠10-12g/L， 磷酸二氢钾〇. 5-lg/L，硫酸镁3-4g/L。
9. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述步骤 (3) 中，将发酵产物进行油脂的提取，步骤是，将发酵产物用氯仿和甲醇进行提取，发酵产 物：氯仿：甲醇的体积比为1-2 : 1 : 1-2,混匀静置2-3h，收集上清液，加入氯仿和甲醇， 使上清液：氯仿：甲醇的比例为1-2 : 2 : 1-2,收集下层氯仿层，并于60°C蒸去氯仿，得 油脂。
10. 如权利要求1或2所述的利用微藻发酵生产生物柴油的方法，其特征是，所述步骤 (4) 中，将上述油脂进行酶催化反应的步骤是，将步骤（3)中所得油脂加入甲醇和脂肪酶， 脂肪酶添加量为油脂重量的20-30 %，35-40°C反应40-50h，得生物柴油，所述甲醇和脂肪 酶的重量配比为1-2 : 1。
【文档编号】C12P7/64GK104498544SQ201410491854
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨钟华 申请人:瑞安市普罗生物科技有限公司