耐热中性纤维素酶Cel6C及其编码基因和应用的制作方法

耐热中性纤维素酶Cel6C及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了耐热中性纤维素酶Cel6C及其编码基因和应用。本发明从特异腐质霉中分离得到耐热中性纤维素酶编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；本发明进一步提供了成熟耐热中性纤维素酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，其编码的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明还公开了含有所述编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明耐热中性纤维素酶热稳定性优良，在中性和碱性范围内具有较高酶活力，可高效降解纤维素、半纤维素、地衣多糖、羧甲基纤维素钠、大分子多糖、蛋白质或脂类等物质，能够应用于酿酒、纺织、能源工业等领域。
【专利说明】耐热中性纤维素酶Cel6C及其编码基因和应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及纤维素酶，尤其涉及从特异腐质霉（Humicola insolens)中分离的耐 热中性纤维素酶Cel6C，本发明还涉及该酶的编码基因及其应用，属于纤维素酶的分离及应 用【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 纤维素是由葡萄糖以β_1，4糖苷键连接而成的线性大分子聚合物，为目前分 布最广的天然碳水化合物，也是自然界中最丰富的可再生资源。纤维素酶是指能水解纤 维素 β_1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。它是由内 切型β -1，4-葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4,简称EG、CX酶、CMC酶）、外切型β -1，4-葡聚糖酶 (EC3. 2. I. 91，EC3. 2. 1. 176,简称 CBH、C1 酶、纤维二糖水解酶）及纤维二糖酶（EC3. 2. 1. 21， 简称CB、β-葡萄糖苷酶）3个主要成分组成的起协同作用的复合酶系（Juturu V and mi J C 2014. Renew Sust Energ Rev 33, 188-203)。
[0003] 内切型β -1，4-葡聚糖酶（EGs)以随机的形式对纤维素聚合物内部的非结晶区进 行切割，产生不同长度的寡糖和新链末端。内切型β-1，4-葡聚糖酶是一类重要的工业酶 种，可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、洗漆等众多领域（Phitsuwan P et al. 2013. Folia Microbiol 58, 163-176)。其中，高温中性内切葡聚糖酶具有作用条件温和，耐高温的特点， 对于应用领域尤为重要，可广泛用于生物质能源、纺织、食品、饲料和制药行业等众多领域。 在纺织工业中，中性纤维素酶在牛仔布生物石洗加工中具有重要的应用价值。在中性pH值 范围内，纤维素酶对织物的作用非常柔和，不会破坏织物的硬度，表面活性剂在这个PH值 范围也是最有效的，从而节约了牛仔布加工过程中的表面活性剂成本。另外，在中性纤维素 酶的作用条件下，还可以有效防止织物返染（Chen J et al. 2007. Enzyme and Microbial Technology 40,1651-1655)。在啤酒加工业中，β-葡聚糖酶能高效地将麦芽中的β-葡 聚糖水解为葡萄糖和低聚糖，摧毁细胞壁，使细胞内容物大量地释放出来，提高麦汁得率， 降低醪液粘度从而缩短糖化醪过滤时间，所获麦汁清亮，使制得的啤酒色泽浅，泡沫均匀持 久。因此，将β-葡聚糖酶用于啤酒糖化和发酵过程，可节约用粮，降低成本，提高糖化过 滤设备的效能，有利于啤酒的质量提高及稳定（宫春波，谢丽源.2002.广州食品工业科 技）。但是，啤酒糖化阶段，β -葡聚糖的溶出随着温度的升高而增多，造成低温过程溶出的 β -葡聚糖比例较低，高温过程溶出的比例较高，耐高温的内切型β -葡聚糖酶是解决这一 问题的关键。
[0004] 因此，获得新型具有中性、热稳定性好等优良特性的纤维素酶的研究仍具有重大 意义。


【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种从特异腐质霉（Humicola insolens)中分 离的耐热中性纤维素酶Cel6C，该酶热稳定性优良并在中性和碱性范围内具有较高酶活力。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0007] 本发明首先公开了从特异腐质霉（Humicola insolens)中分离的耐热中性纤维素 酶Cel6C的编码基因，其核苷酸序列为（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0008] (a)、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或
[0009] (b)、编码SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0010] (C)、与SEQ ID No. 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Ceiec的功能；或
[0011] (d)、与SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且该 多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；优选的，其与SEQ ID No. 1 所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有 耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；最优选的，其与SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的 功能；或
[0012] (e)、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代 或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有耐热中性纤维素酶Ceiec 的功能。
[0013] 本发明还公开了所述编码基因编码的耐热中性纤维素酶Cel6C，其氨基酸序列为 (a)或（b)所示：
[0014] (a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；
[0015] (b)、将SEQ ID No. 2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C功能的蛋白变体。
[0016] 本发明进一步公开了从特异腐质霉（Humicola insolens)中分离的耐热中性纤维 素酶Cel6C的编码基因，其核苷酸序列为（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0017] (a)、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或
[0018] (b)、编码SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或
[0019] (c)、与SEQ ID No. 3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Ceiec的功能；或
[0020] (d)、与SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且该 多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；优选的，其与SEQ ID No. 3 所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有 耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；最优选的，其与SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的 功能；或
[0021] (e)、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代 或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有耐热中性纤维素酶Ceiec 的功能。
[0022] 所述编码基因编码的耐热中性纤维素酶Cel6C，其氨基酸序列为（a)或（b)所示：
[0023] (a)、SEQ ID No. 4 所示的氨基酸；
[0024] (b)、将SEQ ID No. 4所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C功能的蛋白变体。
[0025] 本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本 领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备耐热中性纤维素酶Cel6C的氨基酸序列变体或 片段，其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨 基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。本发明所述的耐热中性纤维素酶Cel6C及 其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。"变体"意指基本相似的序列，对于多核 苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和 替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列 的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷 酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法（例如DNA改组）。
[0026] 本发明通过PCR的方法分离克隆了耐热中性纤维素酶Cel6C的编码基因，DNA全序 列分析结果表明，含有信号肽序列的耐热中性纤维素酶基因的cDNA序列全长1149bp，编码 382个氨基酸和一个终止密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示，其所编码的氨基酸序 列为SEQ ID No. 4所示；其N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列，其氨基酸序列为SEQ ID No. 6所不，信号肽的编码序列为SEQ ID No. 5所不。不含有信号肽的成熟的耐热中性纤 维素酶Cel6C，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示，其编码的核苷酸序列为SEQ ID No. 1所 示。因此,成熟的耐热中性纤维素酶Cel6C的理论分子量为40. OkDa。
[0027] 将耐热中性纤维素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）及推导出的氨基酸 序列（SEQ ID No. 2所不）在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Chaetomium atrobrunneum 的 glycoside hydrolase family 6protein 氨基酸序列一致性为 83%。说 明本发明分离的耐热中性纤维素酶Cel6C是一种新的纤维素酶。
[0028] 本发明还公开了含有所述耐热中性纤维素酶Cel6C的编码基因的重组表达载体， 所述重组表达载体优选为pPIC_cel6C。
[0029] 将本发明的耐热中性纤维素酶Cel6C编码基因插入到表达载体合适的限制性酶 切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选 的实施方案，优选为将本发明的耐热中性纤维素酶编码基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I 和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到 重组酵母表达质粒pPIC_cel6C。
[0030] 另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3所示的多核苷酸进行 优化以增强在重组宿主细胞或重组菌株中的表达效率。例如，可采用目标宿主细胞的偏爱 密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标宿主细胞中的表达效率。
[0031] 本发明还公开了含有所述重组表达载体的重组宿主细胞或重组菌株。
[0032] 其中，所述重组宿主细胞可为原核细胞或真核细胞；优选的，所述重组宿主细胞为 毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞中的任意一种，最优选为毕赤酵母细胞； [0033] 所述重组菌株选自糖酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖糖酵母属或甲基营养型酵母 菌株中的任意一种；其中，所述甲基营养型酵母菌株优选为毕赤氏酵母属菌株。
[0034] 将所述多核苷酸或多肽引入重组宿主细胞的合适方法包括：电转化法、原生质体 法、化学转化法等，这些操作方法通常为本领域所了解。
[0035] 本发明还公开了一种制备所述耐热中性纤维素酶Cel6C的方法，包括以下步骤：
[0036] (1)用含有所述耐热中性纤维素酶Cel6C编码基因的重组表达载体转化宿主细 胞，获得重组菌株；
[0037] (2)培养重组菌株，诱导耐热中性纤维素酶Cel6C表达；
[0038] (3)回收并纯化所表达的耐热中性纤维素酶Cel6C。
[0039] 本发明构建获得含有成熟耐热中性纤维素酶编码基因的重组质粒pPIC_cel6C并 转化毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌株GS115/cel6C。耐热中性纤维素酶Cel6C在毕 赤酵母中得到了分泌表达，表达量为37. 5U/mL。耐热中性纤维素酶Cel6C的比活为378U/ mg 〇
[0040] 耐热中性纤维素酶Cel6C的最适pH和pH稳定性的测定结果表明，耐热中性纤维 素酶Cel6C的最适pH为6. 5,在pH5. 0?9. 0有60%以上的相对酶活性。耐热中性纤维素 酶Cel6C在pH 5. 0-11. 0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80%左 右，这说明此酶在中性和碱性范围内具有较好的PH稳定性。耐热中性纤维素酶Cel6C的最 适温度及热稳定性测定结果表明，耐热中性纤维素酶Cel6C的最适温度为70°C，有良好的 热稳定性，在60°C下温育lh，酶活力仍保留90%以上。
[0041] 经测定，以大麦葡聚糖为底物时耐热中性纤维素酶Cel6C的Km值为I. 285mg/mL， 最大反应速度Vmax为752 μ mol/min · mg。
[0042] 不同金属离子化学试剂对耐热中性纤维素酶Cel6C酶活的影响测定结果表明，大 多数离子和化学试剂在浓度为ImM或者IOmM时耐热中性纤维素酶Cel6C的活力没有明显 变化。但是Mn 2+、CTAB强烈抑制其活力；SDS可部分抑制其活性；Cu2+、Fe3+、Pb 2+在ImM时对 耐热中性纤维素酶Cel6C的酶活力影响不明显，而在浓度为IOmM时可部分抑制其活力。
[0043] 本发明分离的耐热中性纤维素酶Cel6C除可作用于葡聚糖外，对于地衣多糖，羧 甲基纤维素钠也有一定的降解作用。其对地衣多糖的降解能力相对于大麦葡聚糖的为 60. 5%，其对羧甲基纤维素钠的降解能力相对于大麦葡聚糖的为13.6%。
[0044] 添加耐热中性纤维素酶Cel6C对大麦麦芽汁黏度和过滤速度的影响测定结果表 明，添加100U的耐热中性纤维素酶Cel6C酶液处理，其与对照比较，过滤速度提高19. 5%， 黏度降低7. 69%。
[0045] 本发明所述耐热中性纤维素酶Cel6C具有良好的热稳定性，在中性和碱性范围内 依然保持较高酶活，能够降解纤维素、半纤维素、地衣多糖、羧甲基纤维素钠、大分子多糖、 蛋白质或脂类等物质；耐热中性纤维素酶Cel6C或其编码基因可应用于酿酒、纺织、能源工 业，纤维物质转化为可发酵糖的过程。
[0046] 例如在纺织工业中，本发明耐热中性纤维素酶Cel6C可用来处理棉、麻、粘胶等纤 维素织物，切断毛茸、使织物表而光洁、色泽鲜艳，可提高抗起球性，也可进行柔软整理，风 格特殊化整理等。
[0047] 在啤酒加工业中，耐热中性纤维素酶Cel6C能高效地将麦芽中的β-葡聚糖水解 为葡萄糖和低聚糖，摧毁细胞壁，使细胞内容物大量地释放出来，提高麦汁得率，降低醪液 粘度从而缩短糖化醪过滤时间，所获麦汁清亮，使制得的啤酒色泽浅，泡沫均匀持久。
[0048] 在饲料工业，制备低纤维饲料时，本发明耐热中性纤维素酶Cel6C能转化粗饲料 如麦秸、残木、麦糠、稻草、玉米芯等，把其中一部分粗纤维素转化为单体糖、小分子蛋白、低 脂肪等，降低饲料中粗纤维含量，把大分子降解为更易消化的小分子物质。
[0049] 在造纸业方面，用本发明耐热中性纤维素酶Cel6C处理热纸浆，进行毛边处理，可 提商纸的品质。
[0050] 本发明耐热中性纤维素酶Cel6C其他很多方面的应用还有很多，不再一一列举。
[0051] 本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
[0052] 本发明的耐热中性纤维素酶Cel6C的最适pH为6. 5,在pH5. 0?9. 0有60%以上 的相对酶活性；在pH 5. 0-11. 0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在 80%左右，说明此酶在中性和碱性范围内具有较好的pH稳定性。耐热中性纤维素酶Cel6C 的最适温度为70°C，有良好的热稳定性，在60°C下温育lh，酶活力仍保留90%以上。本发 明的耐热中性纤维素酶Cel6C能够降解纤维素、半纤维素、地衣多糖、羧甲基纤维素钠、大 分子多糖、蛋白质或脂类等物质，可应用于酿酒、纺织或能源工业等。
[0053] 本发明所渉及到的术语定义
[0054] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0055] 术语"多核苷酸"或"核苷酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷 酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生 的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其 包括PNA(肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除 非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简 并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个 以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简 并密码子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))。
[0056] 术语"严谨杂交条件"意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常， 在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高 (例如超过本底至少2倍）。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同， 较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针 100%互补的祀序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ^Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)〇 更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点（Tm) 约5-10°C。Tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指 定离子强度、PH和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50% 的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在PH 7. 0到8. 3下盐浓度低于约I. OM钠离 子浓度，通常为约〇· 01到I. OM钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但 不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30°C，而对于长探针（包括（但不限于）大于50 个核苷酸）而言为至少约60°C。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对 于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。 例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培养；或5XSSC， 1% SDS，在65°C下培养，在0. 2XSSC中洗涤和在65°C下于0. 1% SDS中洗涤。所述洗涤可 进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
[0057] 术语"重组宿主细胞株"或"宿主细胞"意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管 使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组 中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
[0058] 术语"启动子"意指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转录 起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。
[0059] 术语"可操作的连接"意指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的 元件可为邻接或非邻接的。
[0060] 术语"转化"意指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
[0061] 术语"表达"意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
[0062] 术语"比活力（性）"是酶纯度的量度，意指单位重量的蛋白质中所具有酶的活力 单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示；一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。

【专利附图】

【附图说明】
[0063] 图1为重组毕赤酵母菌株GSl 15/cel6C发酵湿重及酶活测定；
[0064] 图2为SDS-PAGE检测纯化的耐热中性纤维素酶Cel6C ;其中，M为蛋白Marker ; Cel6C为耐热中性纤维素酶Cel6C ;
[0065] 图3为耐热中性纤维素酶Cel6C的最适pH ;
[0066] 图4为耐热中性纤维素酶Cel6C的pH稳定性；
[0067] 图5为耐热中性纤维素酶Cel6C的最适温度；
[0068] 图6为耐热中性纤维素酶Cel6C的热稳定性。

【具体实施方式】
[0069] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0070] 1、试验材料和试剂
[0071] 1.1菌株及载体
[0072] 特异腐质霉（Humicola insolens Y1CGMCC 4573)从中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心分发，其保藏号为：CGMCC No. 4573。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株 GS115 购自于 Invitrogen 公司。
[0073] 1. 2酶类及其它生化试剂
[0074] 内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自NEB公司。大麦葡聚糖购自Sigma公司， 其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0075] I. 3培养基
[0076] (I)Humicola insolens产孢培养基为马铃薯培养基：IOOOmL 200g 土豆煮汁，IOg 葡萄糖，25g琼脂，ρΗ5· 0。
[0077] (2)Humicola insolens纤维素酶诱导培养基：30g/L麦麸、30g/L玉米芯粉、5g/ L (NH4) S04、lg/L ΚΗ2Ρ04、0· 5g/L MgSO4 · 7Η20、0· Olg/L FeSO4 · 7Η20、0· 2g/L CaCl2。
[0078] (3)大肠杆菌培养基1^:1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%似(：1，？!17.0。
[0079] (4)毕赤酵母发酵培养基：
[0080] PTM 微量盐：0· 6 % CuSO4,0· 008 % NaI2,0· 3 % MnSO4,0· 02 % Na2MoO4,0· 002 % Η3Β03,0· 05% CoC12,2% ZnCl2,6. 5% FeS04,0. 5%硫酸（v/v)。
[0081] 酵母发酵基础盐培养基（FBSM) :0· 5% KH2PO4, 5% NH4H2PO4,1. 485% MgSO4,1. 82% K2SO4,0· 093% CaSO4,0· 15% K0H，0. 00011% Biotin，0· 44% PTM 微量盐，2%葡萄糖。
[0082] 酵母发酵基础盐诱导培养基（FBM) :0· 5% KH2PO4, 5 % NH4H2PO4,1. 485% MgSO4, 1. 82% K2SO4,0· 093% CaSO4,0· 15% Κ0Η，0· 00011 % Biotin，0· 44% PTM微量盐，0· 5% 甲醇。
[0083] Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（0· lmol/L ρΗ5· 2) :0· 2mol/L 磷酸氢二钠 536ml，0· Imol/ L柠檬酸464ml，混匀后调pH至5. 2。
[0084] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0085] 实施例1特异腐质霉（Humicola insolens)纤维素酶编码基因 cel6C cDNA的克 隆
[0086] 提取特异腐质霉在纤维素酶诱导培养基上生长2d时的菌体的总RNA，将其反转录 得到 cDNA 后，以此为模板，利用特异性引物 cel6CF(5'-GGGAATTCGCTCCCAGCCCCAAGAGC-3'） 和 cel6CR(5' -GCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCAGAACTTGAAGATGG-3'），经 PCR 扩增得 到去除天然信号肽的耐热中性纤维素酶基因 cel6C的cDNA片段，并克隆至pEASY-Blunt载 体，测序验证。
[0087] DNA全序列分析结果表明，含有信号肽序列的耐热中性纤维素酶基因的cDNA序列 全长1149bp，编码382个氨基酸和一个终止密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示，其 所编码的氨基酸序列为SEQ ID No. 4所示；其N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列，其 氨基酸序列为SEQ ID No. 6所示，信号肽的编码序列为SEQ ID No. 5所示。不含有信号肽 的成熟的耐热中性纤维素酶Cel6C，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示，其编码的核苷酸序 列为SEQ ID No. 1所示。因此，成熟的耐热中性纤维素酶Cel6C的理论分子量为40. OkDa。
[0088] 将耐热中性纤维素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）及推导出的氨基酸 序列（SEQ ID No. 2所不）在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Chaetomium atrobrunneum 的 glycoside hydrolase family 6protein 氨基酸序列一致性为 83%。说 明耐热中性纤维素酶Cel6C是一种新的纤维素酶。
[0089] 实施例2耐热中性纤维素酶Cel6C的制备
[0090] 将实施例1克隆的不含有信号肽序列的耐热中性纤维素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上，使之位于α -因子信号肽下游，构建重 组表达质粒pPIC_cel6C。
[0091] 将表达载体PPIC9进行双酶切（EcoR I+Not I)，同时将连接有不含信号肽序列的 耐热中性纤维素酶基因的cDNA序列的克隆载体双酶切（EcoR I+Not I)，切出目的片段与表 达载体PPIC9连接，获得重组质粒pPIC-cel6C并转化毕赤酵母GSl 15,获得重组毕赤酵母菌 株 GS115/cel6C。
[0092] 取含有重组质粒的GSl 15菌株，先经FBSM培养基培养使其快速生长48h后，再经 FB頂培养基诱导培养108h。发酵过程中取样测定菌体湿重及纤维素酶的活力，结果见图1。 耐热中性纤维素酶Cel6C的表达量为37. 5U/mL。发酵上清用0. 1 μ m滤膜过滤杂质，然后用 赛托利斯IOkD滤膜浓缩，浓缩液直接过Akta的His-Trap柱，收集酶活峰。SDS-PAGE结果 表明，耐热中性纤维素酶Cel6C在毕赤酵母中得到了分泌表达（图2)。
[0093] 采用DNS法进行耐热中性纤维素酶Cel6C的活性分析：在pH6. 0,60°C条件下， ImL的反应体系包括100 μ L适当的稀释酶液（实施例2制备的耐热中性纤维素酶Cel6C)， 900 μ L大麦葡聚糖底物（1 % )，反应lOmin，加入I. 5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却 后540nm测定OD值。1个酶活单位（U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1 μ mol还原 糖的酶量。实验结果表明，耐热中性纤维素酶Cel6C的比活为378U/mg。
[0094] 实施例3耐热中性纤维素酶Cel6C的性质测定
[0095] 以实施例2纯化的耐热中性纤维素酶Cel6C为研究对象，对该酶的相关性质进行 测定。
[0096] 1、耐热中性纤维素酶Cel6C的最适pH和pH稳定性的测定
[0097] 将实施例2纯化的耐热中性纤维素酶Cel6C在不同的pH下进行酶促反应以测定 其最适pH。底物大麦葡聚糖，在不同pH的0. 2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中70°C下 进行纤维素酶活力测定。结果（图3)表明，耐热中性纤维素酶Cel6C的最适pH为6.5,在 pH5. 0?9. 0有60%以上的相对酶活性。纤维素酶于上述各种不同pH的缓冲液中37°C处 理60min，再在pH6. 5缓冲液体系中70°C下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果（图4) 表明，耐热中性纤维素酶Cel6C在pH 5. 0-11. 0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min 后剩余酶活性在80%左右，这说明此酶在中性和碱性范围内具有较好的pH稳定性。
[0098] 2、耐热中性纤维素酶Cel6C的最适温度及热稳定性测定
[0099] 纤维素酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH6. 5)缓冲液体系 及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为纤维素酶在不同温度（60°C、65°C和70°C )下 处理不同时间，再在70°C下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图5)表明，耐热 中性纤维素酶Cel6C的最适温度为70°C。酶的热稳定性实验结果表明（图6)，耐热中性纤 维素酶Cel6C有良好的热稳定性，在60°C下温育lh，酶活力仍保留90%以上。
[0100] 3、耐热中性纤维素酶Cel6C的Kni值的测定
[0101]用不同浓度的葡聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（PH6. 5)缓冲液体系 中，70°C下测定酶活性，计算出其Km值。
[0102] 经测定，以大麦葡聚糖为底物时的Km值为1.285mg/mL，最大反应速度V max为 752 μ mol/min · mg〇
[0103] 4、不同金属离子化学试剂对耐热中性纤维素酶Cel6C酶活的影响测定
[0104] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为ImM或者1〇禮。在70°C、pH6. 5条件下测定酶活性。
[0105] 结果表明（表I)，大多数离子和化学试剂在浓度为ImM或者IOmM时耐热中性纤 维素酶Cel6C的活力没有明显变化。但是Mn 2+XTAB强烈抑制其活力；SDS可部分抑制其活 性；Cu2+、Fe3+、Pb 2+在ImM时对耐热中性纤维素酶Cel6C的酶活力影响不明显，而在浓度为 IOmM时可部分抑制其活力。
[0106] 表1不同金属离子化学试剂对耐热中性纤维素酶Cel6C酶活的影响

【权利要求】
1. 从特异腐质霉（Humicola insolens)中分离的耐热中性纤维素酶Cel6C的编码基 因，其特征在于，其核苷酸序列为（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、编码SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、与SEQ ID No. 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷 酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；或 (d) 、与SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且该多核 苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；优选的，其与SEQ ID No. 1所示 的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热 中性纤维素酶Cel6C的功能；最优选的，其与SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98%或 以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功 能；或 (e) 、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插 入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功 能。
2. 权利要求1所述编码基因编码的耐热中性纤维素酶Cel6C，其特征在于，其氨基酸序 列为（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸； (b) 、将SEQ ID No. 2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C功能的蛋白变体。
3. 从特异腐质霉（Humicola insolens)中分离的耐热中性纤维素酶Cel6C的编码基 因，其特征在于，其核苷酸序列为（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或 (b) 、编码SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、与SEQ ID No. 3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷 酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；或 (d) 、与SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且该多核 苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功能；优选的，其与SEQ ID No. 3所示 的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热 中性纤维素酶Cel6C的功能；最优选的，其与SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有98%或 以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功 能；或 (e) 、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插 入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C的功 能。
4. 权利要求3所述编码基因编码的耐热中性纤维素酶Cel6C，其特征在于，其氨基酸序 列为（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 4所示的氨基酸； (b) 、将SEQ ID No. 4所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有耐热中性纤维素酶Cel6C功能的蛋白变体。
5. 含有权利要求1或3所述编码基因的重组表达载体。
6. 按照权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体优选为 pPIC-cel6C。
7. 含有权利要求5或6所述的重组表达载体的重组宿主细胞或重组菌株。
8. 按照权利要求7所述的重组宿主细胞或重组菌株，其特征在于：所述重组宿主细胞 为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞中的任意一种，优选为毕赤酵母细胞； 所述重组菌株选自糖酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖糖酵母属或甲基营养型酵母菌株 中的任意一种；其中，所述甲基营养型酵母菌株优选为毕赤氏酵母属菌株。
9. 一种制备权利要求2或4所述耐热中性纤维素酶Cel6C的方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 、用权利要求5或6所述的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株； (2) 、培养重组菌株，诱导耐热中性纤维素酶Cel6C表达； (3) 、回收并纯化所表达的耐热中性纤维素酶Cel6C。
10. 权利要求1或3所述耐热中性纤维素酶Cel6C的编码基因或者权利要求2或4所 述耐热中性纤维素酶Cel6C在降解纤维素、半纤维素、地衣多糖、羧甲基纤维素钠、大分子 多糖、蛋白质或脂类物质中的应用。
【文档编号】C12N9/42GK104293812SQ201410528596
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】张伟, 徐欣欣, 李金阳, 刘波, 张宇宏 申请人:中国农业科学院生物技术研究所