一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌益生菌片的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇功效的益生菌片的制备方法，适用于功能性益生乳酸菌活菌制剂等微生态制剂的生产。本发明益生菌片的配方是由副干酪乳杆菌KL1-Liu益生菌菌粉与脱脂奶粉、低聚果糖、木糖醇、蔗糖、柠檬酸、微晶纤维素、麦芽糊精等辅料组成；本发明利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029，经活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和冷冻干燥等工序制备益生菌菌粉；将经过粉碎、过筛的辅料与益生菌菌粉混合后，压制成益生菌片。本发明制作的益生菌片具有良好的贮藏稳定性，4℃冷藏活菌保质期至少1年以上，仍可发挥降低血清胆固醇的保健功效。本发明制作的益生菌片原料来源方便，工艺简单，制作周期短，操作简单，适于工业化生产。
CGMCC No.7029
2012.12.25
【专利说明】-种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌益生菌片的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇功效的益生菌片的制备方 法，适用于功能性益生乳酸菌活菌制剂（片剂型、粉剂型）等微生态制剂的生产。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu是从藏灵燕中 分离筛选得到的一种产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇作用及调节肠道菌群平衡等功 效的益生乳酸菌。
[0003] 益生菌（Probiotics)是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平衡 并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道感 染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免 疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应该代谢稳定，活性较强，通过消化道后 大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。目前用于生产益生菌类产品的优良菌种有双歧杆 菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的乳酸乳球菌乳酸亚种等。
[0004] 本发明所用副干酪乳杆菌KLl-Liu是利用选择培养技术从藏灵菇中筛选得到高 产胆盐水解酶和胞外多糖的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu。研究发 现，该菌株具有较强耐受胃肠道逆环境（胃酸和胆盐）能力，可以定殖于肠道内发挥益生作 用；动物实验研究显示，该菌株产生的胆盐水解酶能够显著降低或调节血清胆固醇水平，其 产生的胞外多糖具有显著抑制人结肠癌细胞的增殖作用；动物实验研究显示，该菌株还具 有调节肠道菌群平衡、预防便秘、抗脂质过氧化及护肝等功能。课题组系统研究揭示了该菌 株降低血清胆固醇的机理是缘于副干酪乳杆菌KLl-Liu代谢产生大量高活力的胆盐水解 酶（Bile Salt Hydrolase，BSH)。BSH是肠道中的双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的多 种乳酸细菌在生长过程中产生的代谢产物。大量实验证明，胆盐水解酶能在肝肠循环中将 结合胆盐分解，产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合 物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。同时测定该菌株全长基因组序列，为副干酪 乳杆菌KLl-Liu菌株应用奠定理论基础。
[0005] 益生菌对于人体的保健功效早已被世界所公认，益生菌产品已经成为保健食品的 首选。该产品既具有丰富的营养价值，又具有特殊的生理功能，集营养与保健于一身。益生 菌片产品是干燥制品的典型形式之一，具有可直接咀嚼或吞服、食用携带方便、溶出和吸收 速度较快等特点。
[0006] 近年来随着现代科技水平和食品加工技术的发展，国内外相继出现了一些关于 益生菌类产品的报道，例如陕西科技大学申请的"一种益生菌片的制备方法"，专利申请 号为：CN101843337 A;陕西农产品加工技术研究院申请的"一种益生菌羊奶片及其制备方 法"，专利申请号为：CN102742659 A;王世义申请的"复合活性益生菌奶片"，专利申请号为： CN102450331A。刘秀河等人研制的益生菌AB奶片的原始活菌数能达到10 9CFU/g ;周海军和 樊兆武研制的益生菌奶片初始活菌数均只有l〇6CFU/g左右。虽然上述专利和文献有关于 利用益生菌制备片剂型食品的报道，但是关于利用分离筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶并 具有降低血清胆固醇作用的副干酪乳杆菌KLl-Liu制备益生菌片的方法尚未见国内外相 关文献报道和专利报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种利用产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇功效的副干 酪乳杆菌KLl-Liu制备益生菌片的方法。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明的益生菌片配方组成（W/W，质量分数）：副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌菌 粉0? 1 %?1. 0 % [活菌数为（1. 0?5. 0) X 10nCFU/g]，脱脂奶粉15 %?20 %，低聚果糖 10%?15%，木糖醇4%?6%，蔗糖4%?6%，柠檬酸0? 2%?5%，硬脂酸镁0? 5 %? 3. 5%，微晶纤维素与麦芽糊精的比例为1 : 5。
[0010] 所述方法中，副干酿乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu分离筛选自 吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇（又称开菲尔粒），并已于2012年12月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC N〇.7029(菌 株KLl-Liu)。在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei) KLl-Liu菌株的菌落大小2?3mm，菌落有较高黏性，表面粗糙 如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明；个体形态呈杆状，长短不等，短链状 排列，G+无芽孢杆菌。
[0011] 所述方法中，副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌菌粉为副干酪乳杆菌KLl-Liu活菌体 与复合冻干保护剂的混合物。
[0012] 所述方法中，副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌菌粉的制备步骤如下 ：
[0013] (1)采用立式高速冷冻离心机将经过扩大培养与高密度发酵的副干酪乳杆菌 KLl-Liu发酵液于4°C条件下，6000r/min离心10?20min，弃上清液，收集得到菌泥。
[0014] (2)在灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量，加入12. 5%?19. 5%麦芽 糊精+10. 5%?3. 5%脱脂奶粉，与收集的菌泥混合均匀后，得到浓缩发酵剂。
[0015] 上述方法中，冻干保护剂组合配方为（W/V，质量体积比浓度）：12. 5%?19. 5%麦 芽糊精+10. 5%?3. 5%脱脂奶粉（伊利牌高蛋白高钙脱脂奶粉）。
[0016] (3)将浓缩发酵剂于-40°C预冻10h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂；利用美国 6L LABC0NC0真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于-55°C、真空度0. 14mBar的条件下，冻干48h 至完全干燥状态，得到副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌菌粉。
[0017] 所述方法中，副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌片的制备步骤如下：
[0018] (1)采用中药粉碎机分别将木糖醇、蔗糖、柠檬酸等辅料进行破碎，过100目筛子 备用。
[0019] 上述方法中，100目筛子由鸿玎筛网有限公司提供；中药粉碎机由江南欧川电机 厂提供，型号为Hc-280。
[0020] (2)采用三维多向运动混合机将益生菌片配方中的各成分，在转速为10?20r/ min，电机功率为0. 5KW条件下混合均匀，制成益生菌片粗粉。
[0021] 上述方法中，三维多向运动混合机由上海天凡制药机械厂提供，型号为HD20。
[0022] (3)采用单冲式压片机将益生菌片粗粉在最大压力为18KN，压片直径为15? 20mm，每片重lg，硬度4?8N条件下，压制成产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌 片。
[0023] 上述方法中，单冲式压片机由上海天凡制药机械厂提供，型号为DP50。
[0024] 所述方法中，益生菌片中的主要菌种为藏灵菇源副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌。 该菌粉具有良好的降低血清胆固醇功效，并有整肠作用，可在肠道内建立一个有利于健康 长寿的微生态平衡系统，促进消化吸收，并有改善便秘作用，可以预防消费者的心血管疾 病、胃肠道疾病等病症。
[0025] 上述得到的一种产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇功效的副干酪乳杆菌 KLl-Liu制备益生菌片的方法及其产品，以及专用生产菌株属于本发明保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 产胆盐水解酶副干酪乳杆菌益生菌片制备工艺流程图说明如下：
[0027] (1)副干酪乳杆菌KLl-Liu菌株益生菌：分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的 藏灵菇。（2)菌株活化、扩大培养与高密度发酵：将活化好的副干酪乳杆菌KLl-Liu菌株经 改良MRS培养基扩大培养与高密度发酵，得到较高活菌数的发酵液。（3)离心浓缩与添加 保护剂：将KLl-Liu菌株发酵液于4°C条件下，6000r/min离心10?20min，弃上清液，收集 得到菌泥；在灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量，加入12. 5%?19. 5%麦芽糊 精+10. 5%?3. 5%脱脂奶粉，与收集的菌泥混合均匀后，得到浓缩发酵剂。（4)预冻与真 空冷冻干燥：将浓缩发酵剂于-40°C预冻10h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂；利用美国 6L LABC0NC0真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于-55°C、真空度0. 14mBar的条件下，冻干48h 至完全干燥状态，得到副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌菌粉。（5)添加辅料：脱脂奶粉15%? 20%，低聚果糖10%?15%，木糖醇4%?6%，蔗糖4%?6%，柠檬酸0.2%?5%，硬脂酸 镁0.5%?3. 5%，微晶纤维素与麦芽糊精的比例为1 : 5。（6)辅料破碎与过筛：采用中药 粉碎机将颗粒大于100目的辅料如蔗糖、柠檬酸、木糖醇等辅料进行破碎，并采用100目的 筛子过筛。（7)益生菌片粗粉的制备：采用三维多向运动混合机将益生菌菌粉与辅料混合 均匀制成益生菌片的粗粉，混合使用转速为10?20r/min。（8)益生菌片的制备：压片采用 单冲式压片机的最大压力为18KN，压片直径为15?20mm，每片重lg，硬度4?8N。（9)益 生菌片包装与贮藏：将益生菌片分装于密封袋或塑料瓶中，压膜封口或压盖封口后，于4°C 冰箱贮藏，产品活菌保质期为一年。
[0028] 本发明制作的益生菌片原料来源方便，工艺简单，制作周期短，操作简单，对设备 要求较低，成品益生菌片活菌数量明显高于同类产品，适于工业化生产。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。
[0030] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量体积比浓度（W/V)。
[0032] 实施例1、产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌片的制备方法
[0033] (1)副干酪乳杆菌KLl-Liu菌株的活化、扩大培养与高密度发酵
[0034] 将活化好的副干酪乳杆菌KLl-Liu菌株经改良MRS培养基扩大培养与高密度发 酵，得到活菌数为（1. 〇?5. 0) X 101(lCFU/mL的发酵液。
[0035] (2)副干酪乳杆菌KL1-Liu菌株的离心浓缩与冷冻干燥
[0036] 将发酵液于4°C条件下，6000r/min离心10?20min，弃上清液，收集得到菌泥；在 灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量，加入12. 5%?19. 5%麦芽糊精+10. 5%? 3. 5%脱脂奶粉，与收集的菌泥混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将浓缩发酵剂于-40°C预冻 l〇h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂；利用美国6LLABC0NC0真空冷冻干燥机将预冻发 酵剂于_55°C、真空度0. 14mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到副干酪乳杆菌 KLl-Liu益生菌菌粉。
[0037] (3)益生菌菌粉中副干酪乳杆菌KLl-Liu活菌数量的检测
[0038] 称取25g益生菌菌粉放入含有225mL灭菌生理盐水中，采用拍击式匀质器以8 000?10 000r/min的速度处理lmin，充分振荡后，制成KT1的均匀稀释液；再以9mL灭菌 生理盐水做10倍递增稀释至l〇_ n ;取1〇_9?l〇_n的稀释液各lmL置于无菌平皿中，倒入溶 化并冷却至46°C的改良MRS培养基约15mL，迅速轻轻旋动平皿，使培养基与菌液充分混匀， 每个稀释度3次重复。同时将改良MRS培养基注入加有lmL无菌生理盐水的灭菌平皿内作 空白对照。待培养基凝固后，翻转平板，置（36±1)°C温箱中培养（48±2)h，待菌落长出后 即可计数。其平板菌落计数结果显示，每lg益生菌菌粉中副干酪乳杆菌KLl-Liu的活菌数 量为（1. 0 ?5. 0) X10nCFU。
[0039] (4)辅料破碎与过筛
[0040] 采用中药粉碎机分别将木糖醇、蔗糖、柠檬酸等辅料进行破碎，过100目筛子备 用。目的是使益生菌菌粉与辅料更易混合均匀，压片时颗粒均匀容易成型。
[0041] (5)益生菌片粗粉的制备
[0042] 将微晶纤维素与麦芽糊精的比例为1 : 5,脱脂奶粉15%?20%，低聚果糖 10 %?15 %，木糖醇4 %?6 %，蔗糖4 %?6 %，柠檬酸0? 2 %?5 %，硬脂酸镁0? 5 %? 3. 5%等辅料与添加量为0. 1%?1.0%的副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌菌粉[活菌数为 (1. 0?5. 0) X 10nCFU/g]，采用转速为10?20r/min，电机功率为0. 5KW的三维多向运动 混合机充分混合均匀，制成益生菌片粗粉。
[0043] (6)益生菌片的制备
[0044] 采用单冲式压片机将混合均匀的益生菌片粗粉压制成益生菌片，单冲式压片机最 大压片压力为18KN，压片直径为15?20mm，每片重lg，硬度4?8N。
[0045] (7)益生菌片的感官评价
[0046] 评定小组由专业评价人员构成（即由受过专业感官评价培训的人员组成），共有 15人，采用描述性的检测方法分别对样品的质地、口感、风味、外观、色泽、进行细致的描述， 评分标准被分为三档：好、中、差三个档次，以感官评价的结果作为益生菌片配方正交试验 的评定标准。益生菌片的感官评定标准及评价指标见表1。
[0047]表1副干酪乳杆菌益生菌片的感官评定标准[0048]
【权利要求】
1. 副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KL l_Liu CGMCC No. 7029。
2. 一种利用产胆盐水解酶副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu CGMCC No. 7029菌株制备益生菌片的方法，其特征在于：（1)益生菌片配方组成：包括副干酪乳杆 菌KLl-Liu益生菌菌粉0. 1 %?1. 0 %，脱脂奶粉15 %?20 %，低聚果糖10 %?15 %，木糖 醇4%?6%，蔗糖4%?6%，柠檬酸0.2%?5%，硬脂酸镁0.5%?3. 5%，微晶纤维素与 麦芽糊精的比例为1 : 5;(2)KL1-Liu益生菌菌粉的制备：将经过扩大培养与高密度发酵 的副干酪乳杆菌KLl-Liu发酵液于4°C条件下，6000r/min离心10?20min，弃上清液，收 集得到菌泥；在灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量，加入12. 5%?19. 5%麦芽 糊精+10. 5%?3. 5%脱脂奶粉，与收集的菌泥混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将浓缩发酵 剂于-40°C预冻10h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂；利用美国6L LABC0NC0真空冷冻干 燥机将预冻发酵剂于_55°C、真空度0. 14mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到副 干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌菌粉；(3)益生菌片的制备：采用中药粉碎机分别将木糖醇、蔗 糖、柠檬酸等辅料进行破碎，过100目筛子备用；采用三维多向运动混合机将益生菌片配方 中的各成分，在转速为10?20r/min，电机功率为0. 5KW条件下混合均匀，制成益生菌片粗 粉；采用单冲式压片机将益生菌片粗粉在最大压力为18KN，压片直径为15?20mm，每片重 lg，硬度4?8N条件下，压制成产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KLl-Liu益生菌片。
【文档编号】A23L1/30GK104328076SQ201410640001
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】刘慧 , 张红星, 熊利霞, 张晶, 高秀芝, 金君华, 谢远红 申请人:北京农学院