艰难梭菌ab毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明是根据艰难梭菌特异性保守基因tcdA和tcdB设计引物，然后以待测物的基因组DNA为模板，在获得引物的引导下进行LAMP扩增，再通过反应液的颜色变化或反应液浊度变化同步定性检测待测样品中的艰难梭菌产毒株。本发明可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭菌产毒株，不需要复杂仪器，为艰难梭菌的检测及毒素分型提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位及各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
【专利说明】艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒，属于 生物【技术领域】中细菌的分子生物学检测方法【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 艰难梭菌（Clostridium difficile,Cd)为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，广泛分布于水、 土壤等自然环境及动物和人的粪便中。艰难梭菌是一种条件致病菌，本身没有侵袭性，当 人体肠道正常微环境遭到破坏时，部分产毒细菌通过分泌毒素 A、毒素 B以及二元毒素引 起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性伪膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，⑶I)。在医院获得感染性腹泻所明确的病原体中，以艰难梭菌最为 常见；在抗生素相关性腹泻病因中，艰难梭菌亦占159Γ25%。而伪膜性肠炎则几乎100%由 艰难梭菌所致。CDI具有复发率高、耐药率高、难治率高、死亡率高、医疗费用高等特点。
[0003] 艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株 主要分泌毒素 A和毒素 B，分别由tcdA和tcdB编码，而tcdA和tcdB受tcdR、tcdC、tcdE 调节。毒素 A又称肠毒素，易使回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分 泌和出血性坏死；毒素 B又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩 坏死，直接损伤肠壁细胞。毒素 B的毒力较毒素 A强10倍。一般认为毒素 A在艰难梭菌 感染的发病中起重要作用，毒素 B只起辅助作用，并不能单独导致感染。然而，近年来有研 究表明，毒素 B对于艰难梭菌感染的发生、发展至关重要，只产生毒素 A的艰难梭菌菌株是 没有毒性的（Savidge TC, Pan WH, Newman P, O'brien M, Anton PM, Pothoulakis C. Clostridium difficile toxin B is an inflammatory enterotoxin in human intestine, fesiroefliero/of 2003; 125(2) :413-420.)。在艰难梭菌感染患者的粪便中已发现毒素 A阴性、毒素 B阳性的菌株；而毒素 A阳性，毒素 B阴性的菌株尚未被发现，表明毒素 B可以 单独致病。据国外综合医院统计，A(+)B(+)占艰难梭菌的57%，A(-)B(+)占34%，A(-)B(_) 占9%。而A(-)B(+)占艰难梭菌产毒株的10%，临床症状比A(+)B(+)更严重，可出现脱水、 低血压性休克、死亡率较高，耐药性更高（Wilkins TD, Lyerly DM. Clostridium difficile testing ： after 20 years, still challenging. J Clin Microbiol. 2003;41 (2)： 531-534.)。随着全球范围内艰难梭菌感染的暴发流行增多，艰难梭菌感染快速而特异的实 验室检测对于疾病感染的控制和临床诊治显得迫切重要。而选择tcdA和tcdB作为检测艰 难梭菌的目的基因，能全面、特异的鉴定临床产毒株型艰难梭菌。
[0004] 目前，粪便中艰难梭菌实验室检测包括作为检测"金标准"的艰难梭菌毒素检测及 细胞毒素中和试验，但因培养条件及技术要求高、耗时长，难以用于临床常规检测。国内外 广泛应用的酶联免疫试验（EIA)则快速、特异，不敏感；而乳胶凝集试验（GDH)则快速、敏 感，但该方法存在交叉反应、假阳性率高，特异性差等缺点。利用普通PCR可检测艰难梭菌， 但因实验设备要求高、操作复杂、速度慢，扩增完成后，需要对产物进行电泳、显影等一些繁 琐步骤，不适合基层医院及现场快速检测的应用。因此，寻找快速、特异、敏感的艰难梭菌检 测方法是艰难梭菌感染研究领域的热点。
[0005] 随着分子诊断技术的不断进步，T. Notomi (Notomi T, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000; 28(12) :63.)发明的一种新型核酸扩增技术一环介导恒温扩增技术（LAMP),该技术针对靶 基因的6个区域设计4条特异引物，在恒温（63飞7°C)的条件下，利用高活性链置换DNA 聚合酶（BstDNA聚合酶)，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，大量合成目标DNA的同 时伴随有副产物一白色的焦磷酸镁沉淀产生，从而实现对目的基因的快速检测。该方法检 测时间短（3(T60min)，无需特殊仪器，操作简便，配合相应显色试剂还能实现肉眼判别结 果。LAMP方法目前已成功应用于细菌、病毒及寄生虫的定性和定量检测、胎儿性别鉴定和 其他方面，成为常用的临床快速检验方法之一。2005年，日本Haru Kato等（Kato，H. and T. Yokoyama, et al. (2005). Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol 43(12): 6108-12.)提出运用 LAMP 法针对 tcdB 基因 设计6条引物检测艰难梭菌，通过浊度仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳判读结果，检测结果特异、 敏感、快速，不足之处在于无法检测艰难梭菌是否携带ted A基因，不利于艰难梭菌毒素分 型，结果判读方式繁琐、需借助相关仪器，无法实现肉眼快速判读结果。刘畅等分别在2012 年(刘畅，蒋栋能，蒲晓允.快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究[J].国际检验医学杂 志.2012 (20))和 2013 年（Liu, C. and D. N. Jiang, etal. (2013). "DNAdetection of Clostridium difficile infection based on real-time resistance measurement. 〃 Genet Mol Res 12(3) : 3296-304.)提出：针对tcdA基因设计4条引物检测艰难梭菌，分 别通过实时电阻测量和显色试剂判读结果，LAMP法特异、敏感、快速，适合现场和基层推广， 不足之处在于无法检测艰难梭菌tcdB携带情况。目前缺乏针对艰难梭菌tcdA基因和tcdB 基因设计特异性引物，通过显色试剂判读结果来实现快速、简便、特异、灵敏的同步检测艰 难梭菌tcdA和tcdB。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及应用于该LAMP检 测方法的专用引物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒。
[0008] 本发明的技术方案如下。
[0009] -种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，包括如下步骤： (1) 引物的设计：分别对艰难梭菌tcdA与tcdB重复序列通过BLAST软件进行同源性分 析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件Primer design V4设计分别得到用于对艰难梭菌tcdA与tcdB进行LAMP检测的引物； (2) LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在步骤（1)获得引物的引导下进行LAMP 扩增；所述待测物包括人及动物的粪便或培养分离的菌株； (3) 反应结束后进行结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，反应 后根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，橙 色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度 仪检测扩增反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测样品中存在 艰难梭菌待测毒素基因，浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因。
[0010] 经上述艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法步骤（1)设计优化获得一种用于对艰难 梭菌tcdA、tcdB进行LAMP检测的专用引物如下： (1) 用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的tcdA引物为以下三组引物对混合的引物 组合，第一组引物对：引物I (F3)与引物2 (B3);第二组引物对：引物3 (FIP)与引物4 (BIP);第三组引物对：引物5 (LF)与引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT B3 ：ATTTTATCATTTCCCAACGGT FIP ：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG BIP ：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC LF ： CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA LB ：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA 所述"(^引物中三组引物对^1?和81?):(1^和1^):斤3和83)的摩尔比为8 :4:1; (2) 用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为以下三组引物对混合的引物 组合，第一组引物对：引物I (F3)与引物2 (B3);第二组引物对：引物3 (FIP)与引物4 (BIP);第三组引物对：引物5 (LF)与引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC B3 ：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC FIP ：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT BIP ：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC LF ： AATAGTTGCAATTATAGG LB ：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG 所述tcdB引物中三组引物对（FIP和BIP): (LF和LB): (F3和B3)的摩尔比为8:4:1。
[0011] 采用本发明的检测方法，以上述专用引物进行LAMP扩增反应条件可为：检测tcdA 时，扩增反应体系在58-69°C下恒温60min ;检测tcdB时，扩增反应体系在58-69°C下恒温 60min ;tcdA与tcdB同时检测时，扩增反应体系在58_69°C下恒温60min。
[0012] 优选的，所述的LAMP扩增反应条件为：检测tcdA时，扩增反应体系在61 °C下恒温 60min ;检测tcdB时，扩增反应体系在60°C下恒温60min ;tcdA与tcdB同时检测时，扩增反 应体系在60°C下恒温60min。
[0013] 本发明的检测方法中所述钙黄绿素指示剂的添加量为?μ? (终反应体系26μ1)，所 述钙黄绿素指示剂包含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM氯化锰。
[0014] 以上述专用引物进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系优选如下：待测物 的基因组DNA 2μ1、20 mM Tris.HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. l%Tween20， 0. 8 M甜菜碱、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA聚合酶、专用引物、加双蒸水至 总容量25yL;所述的专用引物及其加入量为：tcdA引物：40 pmol (FIP和BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，所述 tcdA 引物的引物对（FIP 和 BIP)、（LF 和 LB)、（F3 和 B3)中各条引物的混合比例优选为等量混合；tcdB引物：40 pmol (FIP和BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，所述 tcdB 引物的引物对（FIP 和 BIP)、（LF 和 LB)、（F3 和 B3)中各条引物的混合比例优选为等量混合。
[0015] 一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，包含有上述用于对艰难梭菌 tcdA和tcdB进行LAMP检测的专用引物。
[0016] 所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含艰难梭菌的基因组 DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如：双蒸水)。
[0017] 优选的，所述试剂盒中包括：20 mM Tris · HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04,0. 1% Tween20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合 酶、tcdA引物、tcdB引物、钙黄绿素指示剂、艰难梭菌的基因组DNA和双蒸水；tcdA引物为： 40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，tcdB 引物为：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)。
[0018] 本发明相对于现有技术的有益效果如下：采取以上设计，本发明具有以下优点： (1) 高特异性：6条引物对艰难梭菌靶序列的8个特异区域的识别保证了 LAMP扩增的 高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增； (2) 高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍； (3) 结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色原理：钙黄绿素是金属离子指 示剂，能指示反应液中Mg2+的变化，反应前在扩增加入钙黄绿素显色剂，反应后反应液颜色 变绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性)，橙色表示待测样品中不存在艰 难梭菌待测毒素基因（阴性)），或者直接用浊度仪判断结果（LAMP反应的过程中会产生焦磷 酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)，反应液浊 度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性)，浊度无变化表示待测样品中不 存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）； (4) 操作简单：只要将检测样品(靶核酸）和检测试剂一起放入60-65°C恒温水浴锅或 金属浴中60分钟后就可以判断结果； (5) 快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0. 5mg/mL ; (6) 同步：可同步检测tcdA和tcdB，快速检测艰难梭菌产毒株。
[0019] 本发明可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭 菌产毒株，不需要复杂仪器，为艰难梭菌的检测及毒素分型提供了新的技术平台，可用于基 层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大 的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为实施2艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。
[0021] 图2为实施2艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。
[0022] 图3为实施例3艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
[0023] 图4为实施例3艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
[0024] 图5为实施例3艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。
[0025] 图6为实施例3艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。
[0026] 图7为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
[0027] 图8为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
[0028] 图9为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果。
[0029] 图10为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结 果。
[0030] 图11为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。
[0031] 图12为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并 不限制本发明的范围。
[0033] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0034] 实施例1通过以下步骤实施本发明： 1、用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物设计 (1) 用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的引物设计：从美国基因数据库检索获得艰难 梭菌tcdA重复序列（GenBank : X92982. 1)通过BLAST软件进行同源性分析得知是艰难梭 菌特异保守序列(序列表中SEQ ID NO :1)，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一 组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体各条引物序列如表1。
[0035] 表1用于对艰难梭菌进行LAMP检测的tcdA引物
【权利要求】
1. 一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 引物的设计：分别对艰难梭菌tcdA与tcdB重复序列通过BLAST软件进行同源性分 析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件Primer design V4设计分别得到用于对艰难梭菌tcdA与tcdB进行LAMP检测的引物； (2) LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在获得引物的引导下进行LAMP扩增；所 述待测物为人及动物的粪便或培养分离的菌株； (3) 反应结束后进行结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，反应 后，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，橙 色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度 仪检测扩增反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测样品中存在 艰难梭菌待测毒素基因，浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因。
2. 根据权利要求1所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：经所述步 骤（1)设计优化获得用于对艰难梭菌tcdA和tcdB进行LAMP检测的专用引物如下： (1) 用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的tcdA引物为以下三组引物对混合的引物 组合，第一组引物对：引物1 (F3)与引物2 (B3);第二组引物对：引物3 (FIP)与引物4 (BIP);第三组引物对：引物5 (LF)与引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT B3 ：ATTTTATCATTTCCCAACGGT FIP ：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG BIP ：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC LF ： CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA LB ：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA 所述tcdA引物中三组引物对（FIP和BIP): (LF和LB): (F3和B3)的摩尔比为8:4:1 ; (2) 用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为以下三组引物对混合的引物 组合，第一组引物对：引物1 (F3)与引物2 (B3);第二组引物对：引物3 (FIP)与引物4 (BIP);第三组引物对：引物5 (LF)与引物6 (LB);所述各引物序列如下： F3 ：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC B3 ：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC FIP ：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT BIP ：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC LF ： AATAGTTGCAATTATAGG LB ：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG 所述tcdB引物中三组引物对（FIP和BIP): (LF和LB): (F3和B3)的摩尔比为8:4:1。
3. 根据权利要求1或2所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：以所 述步骤（1)获得的引物按步骤（2)进行LAMP扩增的反应条件为：检测tcdA时，在58-69°C 恒温60min ;检测tcdB时，在58-69 °C恒温60min ; tcdA与tcdB同时检测时，在58-69 °C恒 温 60min。
4. 根据权利要求3所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP 扩增的反应条件为：检测tcdA时，在61°C恒温60min ;检测tcdB时，在60°C恒温60min ; tcdA与tcdB同时检测时，在60 °C恒温60min。
5. 根据权利要求1所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述钙黄绿 素指示剂的添加量为1W，所述钙黄绿素指示剂包含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM氯化锰。
6. 根据权利要求2所述的艰难梭菌AB毒素LAMP检测方法，其特征在于：以所述的专 用引物进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系如下：待测物的基因组DNA 2沿、20 mM Tris.HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04、0. l%Tween20,0.8 M 甜菜碱、8 mM MgS04、 1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA聚合酶、专用引物、加双蒸水至总容量25iiL;所述专用引 物及其加入量为：tcdA 引物：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LB 和 LF)，5 pmol (F3 and B3);检测 tcdB 时，tcdB 引物：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LB 和 LF)，5 pmol (F3 and B3)。
7. -种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征在于：包括权利要求2 所述的用于对艰难梭菌tcdA和tcdB进行LAMP检测的专用引物。
8. 根据权利要求7所述的同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含艰难梭菌的基因组DNA， 所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系。
9. 根据权利要求7所述的同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征 在于：所述试剂盒中包括：20 mM Tris.HCl (pH 8.8)、10 mM KC1、10 mM (NH4)2S04,0.1% Tween20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgS04、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、tcdA 引物、 tcdB引物、钙黄绿素指示剂、艰难梭菌的基因组DNA和双蒸水；tcdA引物为：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)，tcdB 引物为：40 pmol (FIP 和 BIP)、20 pmol (LF 和 LB)、5 pmol (F3 和 B3)。
10. 根据权利要求7~9中任一项所述的同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂 盒，其特征在于：所述试剂盒可同步定性检测艰难梭菌tcdA和tcdB。
【文档编号】C12Q1/68GK104328204SQ201410667259
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】陈烨, 林敏怡, 王浦, 谭嘉圣, 张婷, 袁静, 刘威 申请人:南方医科大学南方医院