水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记及其专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记及其专用引物，属于分子生物学领域。获得水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记的引物对，其正向引物为：GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反向引物为：AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。用该引物对在含Pi1的C101LAC序列中扩增出来的核苷酸序列即为本发明水稻抗稻瘟病基因Pi1的特异性分子标记。通过本发明的特异性分子标记及引物对能特异检测水稻样品中是否含有抗稻瘟病基因Pi1，100％准确跟踪遗传分离群体中的抗稻瘟病基因Pi1存在与否。
【专利说明】水稻抗稻瘟病基因 PiI的特异性分子标记及其专用引物
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种水稻抗稻瘟病基因 Pil的特异性分子标记 及其专用引物。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。 稻癌病是由子囊菌（Magnaporthe grisea (Hebert) Barr)引起的广泛发生在世界各稻区的 重要病害之一，严重威胁着世界的粮食安全。目前主要通过化学防治和种植抗性品种来控 制稻瘟病。化学防治在一定程度上能减轻病害、减少产量损失，但对环境造成污染，因而通 过选育抗病品种来预防稻瘟病是最佳选择，但由于其病菌小种遗传的复杂性和致病性的多 样性，抗病新品种在推广3-5年后丧失抗性。目前，抗稻瘟病分子标记辅助育种主要利用与 抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，大大提高了育种效率，但往往也存在分 子标记与抗病基因不连锁导致辅助选择失败的情况。而利用抗病基因序列建立与稻瘟病抗 病基因完全共分离的基因标签，则能让辅助选择理论上达到100%的准确性。
[0003] 抗稻瘟病基因 Pil是较为广谱的抗性基因，但目前尚未有基因内特异性标记开发 应用的报道。
[0004] 目前，跟踪抗稻瘟病基因 Pil的分子标记一般用紧密连锁的SSR标记RM224或 MGR4766,距离Pil均有一定的距离，选择效率无法达到100% ;也无法直接用来检测水稻样 品中是否含有Pil基因。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，开发一种水稻抗稻瘟病基因 Pil 的特异性分子标记。本发明的目的还在于提供扩增该特异性分子标记的专用引物（引物 对）。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种获得水稻抗稻瘟病基因 Pil的特异性分子标记的引物对，其正向引物为： GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反向引物为：AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。
[0008] 所述的水稻抗稻瘟病基因 Pil的特异性分子标记为用上述引物对在含Pil的 C101LAC序列中扩增出来的核苷酸序列。
[0009] 所述的引物对及分子标记可用于检测水稻样品是否含有抗稻瘟病基因 ΡΠ 。
[0010] 通过本发明的特异性分子标记及专用引物能特异检测水稻样品中是否含有抗稻 瘟病基因 Pil，100%准确跟踪遗传分离群体中的抗稻瘟病基因 Pil存在与否。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1是用引物对M-Pil检测72个水稻品系的电泳图（部分），1为Marker2000,从 上到下的条带依次为2000、1000、750、500、250、100bp ;条带2为水稻品系中编号为1含抗 稻瘟病基因 Pil的单基因系IRBL1-CL，其余品种名见表1。
[0012] 图2是用引物对M-Pil检测LTH/IRBL1-CL的F2代单株的电泳图，1为 Marker2000,从上到下的条带依次为2000、1000、750、500、250、100bp ;有条带的单株对稻 瘟病叶瘟表现为抗（R)，无带的单株对稻瘟病叶瘟表现为感病（S)。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均 为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0014] 实施例1
[0015] 根据抗稻瘟病基因 Pil与其等位基因 Pikm，日本晴上的感病基因序列比对，设计 出了能特异跟踪Pi 1的引物对，命名为M_Pi 1，其中，正向引物：GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG，反 向引物：AGTCCCCGCTCAATTTTTCT。
[0016] 用引物对1?丨1在含Pil的C101LAC序列中可扩增出460bp的片段，该片段即为 本发明水稻抗稻瘟病基因 Pil的特异性分子标记。
[0017] 实施例2特异性检验
[0018] 1.材料与方法
[0019] I. 1水稻材料：水稻品系共72份（表1)。
[0020] 1. 2水稻基因组DNA提取
[0021] 分别取种植于南宁的72份水稻叶片，通过CTAB法（Murray M G, ThompsonW F. Rapid isolation ofhigh molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research, 1980, 8 (19) : 4321-4326.)提取水稻基因组 DNA。
[0022] 1.3PCR 扩增
[0023] PCR 反应体系为 20μ L 的体系：2. 0μ L 10XBuffer，2. 0μ L dNTPs，正、反向引物 各 I. 0 μ L (4mol/L)，0· 2 μ L Taq DNA 聚合酶，2. 0 μ L 模板 DNA，13. 8 μ L ddH20。PCR 反应程 序 94°C 5min，然后 35 个循环 94°C 30s、58°C 30s、72°C45s，最后 72°C延伸 lOmin。扩增产 物在I. 2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照。
[0024] 2.结果与分析
[0025] 在72个水稻品系中，只有含抗稻瘟病基因 Pil的抗稻瘟病单基因系IRBLl-CL有 460bp的扩增产物，其余71个水稻品系均没有（图1)，从而说明用引物对M-PilPCR扩增得 到的序列为抗稻瘟病基因 Pil的特异性分子标记。
[0026] 表172个水稻品系及M-Pil检测的基因型
[0027]
[0028]
【权利要求】
1. 一种获得水稻抗稻瘟病基因Pil的特异性分子标记的引物对，其特征在于：正向引 物为：GTGCTGCTGTGGCTAGITTG，反向引物为：AGTCCCCGCTCAAITITTCT。
2. -种水稻抗稻瘟病基因Pil的特异性分子标记，其特征在于：所述的分子标记为用 权利要求1所述的引物对在含Pil的C101LAC序列中扩增出来的核苷酸序列。
3. 权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的分子标记在检测水稻样品是否含有抗 稻瘟病基因Pil中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104388425SQ201410667204
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】高利军, 邓国富, 陈小林, 周萌, 颜群, 周维永, 戴高兴, 梁海福, 陈仁天, 李瑞芳, 陈韦韦, 马茜茜 申请人:广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所