一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法，包括配方和制备工艺。本发明采用蛋白胨、酵母粉、维生素和无机盐构成配方，配以相应的制备工艺的技术方案，克服了现有技术存在水解程度差异大、品质一致性差、毒素难以纯化、产毒量不稳定的问题与不足，使破伤风类毒素的培养基，达到了减小水解差异、提高品质一致性、毒素易于纯化、稳定提高产毒量的目的。
【专利说明】一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物培养基的制备方法，具体是指用于培养破伤风菌种获取破伤风类毒素的一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法。
【背景技术】
[0002]破伤风类毒素是配制破伤风疫苗的重要制剂，破伤风类毒素是在培养基中接种破伤风菌种，从培养获取的破伤风杆菌中提取的；因此，培养基的优劣便成为能否获取优质、高效、稳定、纯化一致的破伤风类毒素的关键；用于接种破伤风菌种、培养破伤风杆菌、获取破伤风类毒素的培养基，本文简称培养基。现有技术采用酶或酸对牛肉、酪素、黄豆等动植物蛋白质进行水解来制备培养基；实际生产中，由于现有培养基的各个批次的水解程度难以保持一致，水解过深使现有培养基的产毒量下降，水解度过浅使现有培养基所产毒素中含有过量的杂质蛋白，毒素难以纯化；而毒素中过量的杂质蛋白会导致最终的类毒素制品对人体引发不良反应；因此，现有技术存在水解程度差异大、品质一致性差、毒素难以纯化、产毒量不稳定的问题与不足。
【发明内容】
[0003]针对上述现有技术存在的问题与不足，本发明采用蛋白胨、酵母粉、维生素和无机盐构成配方，配以相应的制备工艺的技术方案，提供一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法，旨在使破伤风类毒素的培养基达到减小水解差异、提高品质一致性、毒素易于纯化、稳定提尚广毒量的目的。
[0004]本发明的目的是这样实现的:一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法，包括配方和制备工艺，其中:所述的配方，包括新培养基配方、I号生长因子配方和II号生长因子配方；
[0005]所述新培养基配方简称基配方，所述基配方为:
[0006]原料1:蛋白胨酵母粉，药用级，14.62毫克；
[0007]原料2:胰蛋白胨，药用级，5.64毫克；
[0008]原料3:酵母粉，10克；
[0009]原料4:三水合乙酸钠(CH3COONa.3H20)，分析纯，5克；
[0010]原料5:磷酸二氢钾(KH2PO4)，分析纯，I克；
[0011]原料6:磷酸氢二钠(Na2HPO4),药用级，0.4克；
[0012]原料7:甘油，药用级，60毫升；
[0013]原料8:葡萄糖，分析纯，2.5克；
[0014]原料9:1号生长因子，5晕升；
[0015]原料10:11号生长因子，2晕升；
[0016]原料11:六水合三氯化铁(FeCl3.6H20)，分析纯，0.03克；
[0017]原料12:注射用水，770毫升；
[0018]脱色剂:活性炭，药用级，2克；
[0019]中和剂:NaOH溶液，20%，按需量，毫升；
[0020]稀释剂:注射用水，(至100ml的)余量，晕升；
[0021]配方中各物质的用量为1000毫升单位容积培养基的用量；
[0022]所述I号生长因子配方简称I配方，所述I配方为:
[0023]原料A:盐酸硫胺，生化试剂，0.3g ；
[0024]原料B:核黄素，生化试剂，0.3g ；
[0025]原料C:盐酸吡哆辛，生化试剂，0.3g ；
[0026]原料D:泛酸钙，生化试剂，1.2g ；
[0027]原料E:维生素H，生化试剂，4mg
[0028]原料F:无水乙醇，分析纯，250ml ；
[0029]稀释剂G:注射用水，余量，晕升；
[0030]I配方中各物质的用量为1000毫升单位容积的I号生长因子的用量；
[0031]所述II号生长因子配方简称II配方，所述II配方为:
[0032]原料a:烟酸，生化试剂，0.25g ；
[0033]原料b:L-胱氨酸，生化试剂，75g ；
[0034]原料c:尿嘧啶，生化试剂，2.5g ；
[0035]原料d:稀盐酸，药用级，150ml ;
[0036]原料e:七水合硫酸镁(MgSO4.7H20)，分析纯，50g ；
[0037]原料f:七水合硫酸锌(ZnSO4.7H20)，分析纯，1g ；
[0038]稀释剂h:注射用水，余量，晕升；
[0039]II配方中各物质的用量为1000毫升单位容积的II号生长因子的用量；
[0040]所述的制备工艺，包括I号生长因子制备、II号生长因子制备、新培养基制备；其中，
[0041]所述I号生长因子制备为，将所述I配方中原料B置于烧杯内，加入稀释剂G浸没混匀，之后，加入原料F搅拌溶解，之后，加入原料A、原料C、原料D和原料E搅拌溶解，之后，加入稀释剂G使总量至1000ml，搅拌混合均匀；获得I号生长因子，待用；
[0042]所述II号生长因子制备为，将所述II配方中的原料a、原料b和原料c置于烧杯内，加入稀释剂h浸没混匀，之后，加入原料d搅拌溶解，之后，加入原料e和原料f混合搅拌溶解，之后，加入稀释剂h使总量至1000ml，搅拌混合均匀；获得II号生长因子，待用；
[0043]所述新培养基制备为:
[0044]步骤一、将所述基配方中的原料1、原料2、原料3、原料4、原料5和原料6加入反应釜内，边搅拌边加热至50?60°C，使之充分溶解，获得初溶料；
[0045]步骤二、用烧杯从反应釜内取样20ml测定所述初溶料的pH值，用基配方中的中和剂将反应釜内初溶料的PH值调节至7.4±0.2，获得中和料；
[0046]步骤三、将基配方中的原料7投入反应釜内与所述中和料加热搅拌混合，加热温度至100°c，使之沸腾，沸腾持续时间3?5分钟，停止加热，获得含油料；
[0047]步骤四、将基配方中的所述原料8和原料12置于烧杯中搅拌溶解后投入反应釜内与所述含油料搅拌混合，搅拌混合用时I?2分钟，获得含糖料；
[0048]步骤五、将所述含糖料冷却至60°C从反应釜内取出，经板框滤器(NA12滤板)过滤后再次置于反应釜中，获得滤液；
[0049]步骤六、将基配方中的所述原料9、原料10、原料11和原料12投入反应釜中与所述滤液搅拌混合，在加热升温至60°C的温度下搅拌2分钟，获得浓液，停止加热，之后，用基配方中的所述稀释剂对所述浓液进行搅拌稀释，使总量至100ml ;静置冷却至室温，获得稀料；
[0050]步骤七、用烧杯从反应釜内取样20ml测定所述稀料的pH值，用基配方中的中和剂将反应釜内稀料的PH值调节至7.2±0.2，获得中和稀料；之后，将基配方中的脱色剂投入反应釜中对中和稀料进行搅拌脱色，搅拌脱色用时2分钟，获得脱色料；
[0051]步骤八、将所述脱色料移至贮存罐中，将贮存罐移至高压蒸汽灭菌釜内对所述脱色料进行连罐连盖的湿热灭菌，湿热灭菌时贮存罐的罐盖开启，湿热灭菌温度为112°C，湿热灭菌用时30分钟，之后，开启高压蒸汽灭菌釜，乘热封闭贮存罐的罐盖，之后，取出贮存罐，此时贮存罐内的物质即为破伤风类毒素新型培养基的成品。
[0052]有益效果
[0053]实验证明，本发明制备的破伤风类毒素新型培养基用于培养制备破伤风类毒素，接种培养用时67小时，破伤风杆菌产毒量为80Lf/ml，精制后毒素纯度大于2600Lf/ml，类毒素纯度大于2000Lf/ml ;产毒量大且稳定，毒素品质一致性好，且易于高度纯化。
[0054]上述，本发明采用蛋白胨、酵母粉、维生素和无机盐构成配方，配以相应的制备工艺的技术方案，克服了现有技术存在水解程度差异大、品质一致性差、毒素难以纯化、产毒量不稳定的问题与不足，所提供的一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法，使破伤风类毒素的培养基，达到了减小水解差异、提高品质一致性、毒素易于纯化、稳定提高产毒量的目的。
实施例说明
[0055]以下通过具体实施例对本发明的一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法作进一步详细说明，所属领域的技术人员可以参照实施例的配方及工艺方法制得破伤风类毒素新型培养基制品，但不应理解为对本发明的任何限制。
【具体实施方式】
[0056]
[0057]实施例
[0058]品名:破伤风类毒素新型培养基
[0059]配方:包括新培养基配方简称基配方、I号生长因子配方简称I配方和II号生长因子配方简称II配方；其中，
[0060]基配方为:
[0061]原料1:蛋白胨酵母粉，药用级，14.62毫克；
[0062]原料2:胰蛋白胨，药用级，5.64毫克；
[0063]原料3:酵母粉，10克；
[0064]原料4:三水合乙酸钠(CH3COONa.3H20)，分析纯，5克；
[0065]原料5:磷酸二氢钾(KH2PO4)，分析纯，I克；
[0066]原料6:磷酸氢二钠(Na2HPO4)，药用级，0.4克；
[0067]原料7:甘油，药用级，60毫升；
[0068]原料8:葡萄糖，分析纯，2.5克；
[0069]原料9:1号生长因子，5晕升；
[0070]原料10:11号生长因子，2晕升；
[0071]原料11:六水合三氯化铁(FeCl3.6H20)，分析纯，0.03克；
[0072]原料12:注射用水，770毫升；
[0073]脱色剂:活性炭，药用级，2克；
[0074]中和剂:NaOH溶液，20%,按需量，毫升；
[0075]稀释剂:注射用水，(至100ml的)余量，毫升；
[0076]配方中各物质的用量为1000毫升单位容积培养基的用量；
[0077]I配方为:
[0078]原料A:盐酸硫胺，生化试剂，0.3g ；
[0079]原料B:核黄素，生化试剂，0.3g ；
[0080]原料C:盐酸吡哆辛，生化试剂，0.3g ；
[0081]原料D:泛酸钙，生化试剂，1.2g ；
[0082]原料E:维生素H，生化试剂，4mg
[0083]原料F:无水乙醇，分析纯，250ml ；
[0084]稀释剂G:注射用水，余量，晕升；
[0085]I配方中各物质的用量为1000毫升单位容积的I号生长因子的用量；
[0086]II配方为:
[0087]原料a:烟酸，生化试剂，0.25g ；
[0088]原料b:L-胱氨酸，生化试剂，75g ；
[0089]原料c:尿嘧啶，生化试剂，2.5g ；
[0090]原料d:稀盐酸，药用级，150ml ;
[0091 ]原料e:七水合硫酸镁(MgSO4.7H20)，分析纯，50g ；
[0092]原料f:七水合硫酸锌(ZnSO4.7H20)，分析纯，1g ；
[0093]稀释剂h:注射用水，余量，晕升；
[0094]II配方中各物质的用量为1000毫升单位容积的II号生长因子的用量；
[0095]制备
[0096]制备条件、设备
[0097]环境气压:一个大气压；环境温度:室温；
[0098]制备设备:设备:烧杯，100ml ;不锈钢贮存罐；板框滤器(NA12滤板);反应釜；
[0099]制备工艺:
[0100]包括I号生长因子制备、II号生长因子制备、新培养基制备；
[0101]I号生长因子制备为:
[0102]将所述I配方中原料B置于烧杯内，加入稀释剂G浸没混匀，之后，加入原料F搅拌溶解，之后，加入原料A、原料C、原料D和原料E搅拌溶解，之后，加入稀释剂G使总量至1000ml，搅拌混合均匀；获得I号生长因子，待用；
[0103]II号生长因子制备为:
[0104]将所述II配方中的原料a、原料b和原料c置于烧杯内，加入稀释剂h浸没混匀，之后，加入原料d搅拌溶解，之后，加入原料e和原料f混合搅拌溶解，之后，加入稀释剂h使总量至1000ml，搅拌混合均匀；获得II号生长因子，待用；
[0105]新培养基制备为:
[0106]步骤一、将所述基配方中的原料1、原料2、原料3、原料4、原料5和原料6加入反应釜内，边搅拌边加热至50?60°C，使之充分溶解，获得初溶料；
[0107]步骤二、用烧杯从反应釜内取样20ml测定所述初溶料的pH值，用基配方中的中和剂将反应釜内初溶料的PH值调节至7.4±0.2，获得中和料；
[0108]步骤三、将基配方中的原料7投入反应釜内与所述中和料加热搅拌混合，加热温度至100°c，使之沸腾，沸腾持续时间3?5分钟，停止加热，获得含油料；
[0109]步骤四、将基配方中的所述原料8和原料12置于烧杯中搅拌溶解后投入反应釜内与所述含油料搅拌混合，搅拌混合用时I?2分钟，获得含糖料；
[0110]步骤五、将所述含糖料冷却至60°C从反应釜内取出，经板框滤器(NA12滤板)过滤后再次置于反应釜中，获得滤液；
[0111]步骤六、将基配方中的所述原料9、原料10、原料11和原料12投入反应釜中与所述滤液搅拌混合，在加热升温至60°C的温度下搅拌2分钟，获得浓液，停止加热，之后，用基配方中的所述稀释剂对所述浓液进行搅拌稀释，使总量至100ml ;静置冷却至室温，获得稀料；
[0112]步骤七、用烧杯从反应釜内取样20ml测定所述稀料的pH值，用基配方中的中和剂将反应釜内稀料的PH值调节至7.2±0.2，获得中和稀料；之后，将基配方中的脱色剂投入反应釜中对中和稀料进行搅拌脱色，搅拌脱色用时2分钟，获得脱色料；
[0113]步骤八、将所述脱色料移至贮存罐中，将贮存罐移至高压蒸汽灭菌釜内对所述脱色料进行连罐连盖的湿热灭菌，湿热灭菌时贮存罐的罐盖开启，湿热灭菌温度为112°C，湿热灭菌用时30分钟，之后，开启高压蒸汽灭菌釜，乘热封闭贮存罐的罐盖，之后，取出贮存罐，此时贮存罐内的物质即为破伤风类毒素新型培养基的成品。
[0114]有益效果
[0115]实验证明，本发明制备的破伤风类毒素新型培养基用于培养制备破伤风类毒素，接种培养用时67小时，破伤风杆菌产毒量为80Lf/ml，精制后毒素纯度大于2600Lf/ml，类毒素纯度大于2000Lf/ml ;产毒量大且稳定，毒素品质一致性好，且易于高度纯化。
【权利要求】
1.一种破伤风类毒素新型培养基的制备方法，包括配方和制备工艺，其特征在于:所述的配方，包括新培养基配方、I号生长因子配方和II号生长因子配方； 所述新培养基配方简称基配方，所述基配方为: 原料1:蛋白胨酵母粉，药用级，14.62毫克； 原料2:胰蛋白胨，药用级，5.64毫克； 原料3:酵母粉，10克； 原料4:三水合乙酸钠CH3COONa.3H20，分析纯，5克； 原料5:磷酸二氢钾KH2PO4,分析纯，I克； 原料6:磷酸氢二钠Na2HPO4，药用级，0.4克； 原料7:甘油，药用级，60毫升； 原料8:葡萄糖，分析纯，2.5克； 原料9:1号生长因子，5晕升； 原料10:11号生长因子，2毫升； 原料11:六水合三氯化铁FeCl3.6H20，分析纯，0.03克； 原料12:注射用水，770毫升； 脱色剂:活性炭，药用级，2克； 中和剂:氢氧化钠NaOH溶液，20%,按需量，毫升； 稀释剂:注射用水，余量，毫升； 配方中各物质的用量为1000毫升单位容积培养基的用量； 所述I号生长因子配方简称I配方，所述I配方为: 原料A:盐酸硫胺，生化试剂，0.3g ； 原料B:核黄素，生化试剂，0.3g ； 原料C:盐酸吡哆辛，生化试剂，0.3g ； 原料D:泛酸钙，生化试剂，1.2g; 原料E:维生素H，生化试剂，4mg 原料F:无水乙醇，分析纯，250ml ； 稀释剂G:注射用水，余量，毫升； I配方中各物质的用量为1000毫升单位容积的I号生长因子的用量； 所述II号生长因子配方简称II配方，所述II配方为: 原料a:烟酸，生化试剂，0.25g ； 原料b:L-胱氨酸，生化试剂，75g ； 原料c:尿嘧啶，生化试剂，2.5g ； 原料d:稀盐酸，药用级，150ml ； 原料e:七水合硫酸镁MgSO4.7H20，分析纯，50g ； 原料f:七水合硫酸锌ZnSO4.7H20，分析纯，1g ； 稀释剂h:注射用水，余量，毫升； II配方中各物质的用量为1000毫升单位容积的II号生长因子的用量； 所述的制备工艺，包括I号生长因子制备、II号生长因子制备、新培养基制备；其中， 所述I号生长因子制备为，将所述I配方中原料B置于烧杯内，加入稀释剂G浸没混匀，之后，加入原料F搅拌溶解，之后，加入原料A、原料C、原料D和原料E搅拌溶解，之后，加入稀释剂G使总量至1000ml，搅拌混合均匀；获得I号生长因子，待用； 所述II号生长因子制备为，将所述II配方中的原料a、原料b和原料c置于烧杯内，加入稀释剂h浸没混匀，之后，加入原料d搅拌溶解，之后，加入原料e和原料f混合搅拌溶解，之后，加入稀释剂h使总量至1000ml，搅拌混合均匀；获得II号生长因子，待用；所述新培养基制备为: 步骤一、将所述基配方中的原料1、原料2、原料3、原料4、原料5和原料6加入反应Il内，边搅拌边加热至50?60°C，使之充分溶解，获得初溶料； 步骤二、用烧杯从反应釜内取样20ml测定所述初溶料的pH值，用基配方中的中和剂将反应釜内初溶料的PH值调节至7.4±0.2，获得中和料； 步骤三、将基配方中的原料7投入反应釜内与所述中和料加热搅拌混合，加热温度至100°C，使之沸腾，沸腾持续时间3?5分钟，停止加热，获得含油料； 步骤四、将基配方中的所述原料8和原料12置于烧杯中搅拌溶解后投入反应釜内与所述含油料搅拌混合，搅拌混合用时I?2分钟，获得含糖料； 步骤五、将所述含糖料冷却至60°C从反应釜内取出，经板框滤器(NA12滤板)过滤后再次置于反应釜中，获得滤液； 步骤六、将基配方中的所述原料9、原料10、原料11和原料12投入反应釜中与所述滤液搅拌混合，在加热升温至60°C的温度下搅拌2分钟，获得浓液，停止加热，之后，用基配方中的所述稀释剂对所述浓液进行搅拌稀释，使总量至100ml ;静置冷却至室温，获得稀料；步骤七、用烧杯从反应釜内取样20ml测定所述稀料的pH值，用基配方中的中和剂将反应釜内稀料的PH值调节至7.2±0.2，获得中和稀料；之后，将基配方中的脱色剂投入反应釜中对中和稀料进行搅拌脱色，搅拌脱色用时2分钟，获得脱色料； 步骤八、将所述脱色料移至贮存罐中，将贮存罐移至高压蒸汽灭菌釜内对所述脱色料进行连罐连盖的湿热灭菌，湿热灭菌时贮存罐的罐盖开启，湿热灭菌温度为112°C，湿热灭菌用时30分钟，之后，开启高压蒸汽灭菌釜，乘热封闭贮存罐的罐盖，之后，取出贮存罐，此时贮存罐内的物质即为破伤风类毒素新型培养基的成品。
【文档编号】C12N1/20GK104498388SQ201410692050
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】杨盼景, 陈培培, 熊细双, 杨廷潺 申请人:浙江卫信生物药业有限公司