本发明涉及一种蛋白源发酵方法，尤其是涉及一种固态发酵棉粕的方法。
背景技术：
棉粕是优良的植物源蛋白之一，其粗蛋白含量高达40％，但棉粕中的游离棉酚(FG)及其它抗营养因子严重影响了它的饲用价值。棉粕的脱毒方法有许多，如物理脱毒法(蒸煮脱毒、膨化脱毒)和化学脱毒法(硫酸亚铁、氢氧化钠)等，虽然可以部分降低棉粕中的FG含量，但是在诸如饲料适口性、饲料营养价值以及脱毒效果等方面还达不到令人十分满意的效果。
利用微生物发酵的方法不但能够有效脱除棉粕中的FG，而且还可以提高棉粕中的粗蛋白含量和酸溶性蛋白含量，其中部分大分子蛋白质被降解为小分子蛋白质、小肽、氨基酸等易被动物体肠道消化、吸收和利用的营养物质，并且发酵产物中存留有多种酶类、维生素和一些促生长因子等有益成份，提高了饲料的适口性和营养价值，增加了家畜等动物的采食量，增强了动物对疾病的抵抗力，在畜禽养殖中具有良好的应用发展前景，极具开发潜力，因而近年来我国在棉粕发酵脱毒方面的研究较为活跃。
中国专利CN 104256058A公开了一种生物发酵棉粕生产高小肽饲料的方法，属于生物发酵技术领域，以棉粕为原料，添加嗜酸乳杆菌液和酵母菌种子液，料液比为1∶0.6～1∶0.9，30～50℃条件下厌氧发酵3～4天，烘干粉碎得到固态发酵棉粕，该专利在发酵中棉粕没有经过预处理，棉粕中抗营养因子可能到不到有效去除，发酵过程中外加酶的使用会增加生产成本。目前尚未发现利用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌对棉粕进行发酵方面的专利。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高游 离棉酚降解的固态发酵棉粕的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种固态发酵棉粕的方法，该方法采用以下步骤：
(1)菌种选取：选取对棉粕中游离棉酚降解效果较好、产蛋白酶能力较强的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、产生良好发酵风味的酵母菌(S.cerevisiae)及乳酸菌(L.plantarum)；
(2)种子液制备：
(2-1)一级种子液制备：将斜面或甘油管保藏菌种接种至相应的种子培养基，其中枯草芽孢杆菌接种至LB培养基中，37℃、180rpm培养24h，酵母菌接种至马铃薯培养基中，30℃、200rpm培养20-30h，乳酸菌接种至MRS培养基中，37℃静置培养20-30h；
(2-2)二级种子液制备：将一级种子液接种到种子发酵罐中，乳酸菌接种到10L的玻璃瓶中，37℃发酵20-30h；酵母菌接种到15L的发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h，保持正压，30℃发酵20-30h；枯草芽孢杆菌接种到15L发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h，保持正压，37℃发酵20-30h；
(3)发酵培养液制备：连接种子发酵罐和发酵罐，开蒸汽灭菌30min，关蒸汽，将种子发酵罐的罐压调高并打开阀门，利用蒸汽将种子液压到发酵罐中的发酵培养基中进行接种，关掉阀门，通蒸汽清洗30min，液体发酵24h，每4h镜检一次菌种状态，得到混合菌液；
(4)固态发酵：棉粕经高温高压灭菌后，冷却至30-50℃，将混合菌液与豆粕混合进行堆积发酵，混合过程中，调整物料含水量至30-60wt％，20-35℃，24h翻料一次，发酵48-72h，发酵结束后，烘干、粉碎，终产品水分控制在10％以下，根据粒度要求选择筛网粉碎即可。
步骤(1)中所述的枯草芽孢杆菌为购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，菌种编号为CICC NO.10071的枯草芽孢杆菌；所述的酵母菌为购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC NO.1421的酵母菌；所述的乳酸菌为购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC NO.6009的乳酸菌。
步骤(3)中，枯草芽孢杆菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及 重量百分比含量：玉米淀粉1-5％；牛骨蛋白胨0.1-0.8％；棉粕1-2％；(NH4)2SO40.02-0.06％；其余为水，发酵培养基pH为7.2。
步骤(3)中，酵母菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：食品级葡萄糖粉1-5％；(NH4)2SO40.1-0.5％；食品级KH2PO40.05-0.1％；食品级MgSO4·7H2O 0.01-0.05％；酵母浸膏0.1-0.5％；其余为水，发酵培养基pH为7.2。
步骤(3)中，乳酸菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：酵母浸膏1-5％；牛骨蛋白胨1-4％；食品级葡萄糖粉1-4％；轻质CaCO30.1-0.5％；其余为水，发酵培养基pH为7.0。
步骤(4)中，混合菌液由枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以重量比2:1:1混合得到，菌液以1-8wt％接种量接至发酵底物棉粕中。
与现有技术相比，本发明以枯草芽抱杆菌、酵母菌、植物乳酸杆菌对棉粕进行固态发酵。发酵过程中，优化的枯草芽孢杆菌可有效降解棉粕中的抗营养因子—游离棉酚，另外枯草芽孢杆菌具有较强的产蛋白酶能力，可降解棉粕中大分子蛋白质，将棉粕中大分子量蛋白质分解为更易吸收的小分子量蛋白质或肽。酵母菌不仅提供丰富的菌体蛋白，对发酵产品产生良好的发酵香味也有很大作用。乳酸菌在发酵过程中产生各种有机酸，降低发酵产品的酸度，有利于动物肠道吸收。采用微生物发酵的方法，不仅有效的降解去除棉粕中的游离棉酚等毒性物质，同时获得对动物生长有益的代谢产物，从而提高棉粕的营养价值和在饲料养殖中的添加比例。
以枯草芽抱杆菌、酵母菌、植物乳酸杆菌对棉粕进行固态发酵，发酵底料进行高温高压灭菌处理后，可提高游离棉酚的降解，混菌发酵后游离棉酚的降解率≥60％，对棉粕蛋白的降解效果好，TCA-NSI指数≥40.0％，粗蛋白含量≥48％，而且促进了动物的生长和生产能力及减少疾病的发生率给动物养殖提供了全天然无公害高营养价值的棉粕饲料产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种固态发酵棉粕的方法，采用以下步骤：
(1)菌种选取：选取对棉粕中游离棉酚降解效果较好、产蛋白酶能力较强的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、产生良好发酵风味的酵母菌(S.cerevisiae)及乳酸菌(L.plantarum)，其中，枯草芽孢杆菌购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，菌种编号为CICC NO.10071；酵母菌购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC NO.1421；乳酸菌购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC NO.6009；
(2)种子液制备：
(2-1)一级种子液制备：将斜面或甘油管保藏菌种接种至相应的种子培养基，其中枯草芽孢杆菌接种至LB培养基中，37℃、180rpm培养24h，酵母菌接种至马铃薯培养基中，30℃、200rpm培养20h，乳酸菌接种至MRS培养基中，37℃静置培养20h；
(2-2)二级种子液制备：将一级种子液接种到种子发酵罐中，乳酸菌接种到10L的玻璃瓶中，37℃发酵20h；酵母菌接种到15L的发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h，保持正压，30℃发酵20h；枯草芽孢杆菌接种到15L发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h，保持正压，37℃发酵20h；
(3)发酵培养液制备：连接种子发酵罐和发酵罐，开蒸汽灭菌30min，关蒸汽，将种子发酵罐的罐压调高并打开阀门，利用蒸汽将种子液压到发酵罐中的发酵培养基中进行接种，枯草芽孢杆菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米淀粉1％；牛骨蛋白胨0.1％；棉粕1％；(NH4)2SO40.02％；其余为水，发酵培养基pH为7.2。酵母菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：食品级葡萄糖粉1％；(NH4)2SO40.1％；食品级KH2PO40.05％；食品级MgSO4·7H2O 0.01％；酵母浸膏0.1％；其余为水，发酵培养基pH为7.2，乳酸菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：酵母浸膏1％；牛骨蛋白胨1％g；食品级葡萄糖粉1％；轻质CaCO30.1％；其余为水，发酵培养基pH为7.0。关掉阀门，通蒸汽清洗30min，液体发酵24h，每4h镜检一次菌种状态，得到混合菌液；
(4)固态发酵：棉粕经高温高压灭菌后，冷却至30℃，将混合菌液与豆粕 混合进行堆积发酵，混合菌液由枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以重量比2:1:1混合得到，菌液以1wt％接种量接至发酵底物棉粕中，混合过程中，调整物料含水量至30wt％，20℃，24h翻料一次，发酵48h，发酵结束后，烘干、粉碎，终产品水分控制在10％以下，根据粒度要求选择筛网粉碎即可。
实施例2
一种固态发酵棉粕的方法，采用以下步骤：
(1)菌种选取与实施例1相同；
(2)种子液制备：
(2-1)一级种子液制备：将斜面或甘油管保藏菌种接种至相应的种子培养基，其中枯草芽孢杆菌接种至LB培养基中，37℃、180rpm培养24h，酵母菌接种至马铃薯培养基中，30℃、200rpm培养24h，乳酸菌接种至MRS培养基中，37℃静置培养24h；
(2-2)二级种子液制备：将一级种子液接种到种子发酵罐中，乳酸菌接种到10L的玻璃瓶中，37℃发酵20-30h；酵母菌接种到15L的发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h，保持正压，30℃发酵24h；枯草芽孢杆菌接种到15L发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h。保持正压，37℃发酵24h；
(3)发酵培养液制备：连接种子发酵罐和发酵罐，开蒸汽灭菌30min，关蒸汽，将种子发酵罐的罐压调高并打开阀门，利用蒸汽将种子液压到发酵罐中的发酵培养基中进行接种，枯草芽孢杆菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米淀粉3％；牛骨蛋白胨0.5％；棉粕1％；(NH4)2SO40.04％；其余为水，发酵培养基pH为7.2。酵母菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：食品级葡萄糖粉3％；(NH4)2SO40.3％；食品级KH2PO40.08％；食品级MgSO4·7H2O 0.03％；酵母浸膏0.3％；其余为水，发酵培养基pH为7.2。乳酸菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：酵母浸膏3％；牛骨蛋白胨3％；食品级葡萄糖粉3％；轻质CaCO30.3％；其余为水，发酵培养基pH为7.0。关掉阀门，通蒸汽清洗30min，液体发酵24h，每4h镜检一次菌种状态，得到混合菌液；
(4)固态发酵：棉粕经高温高压灭菌后，冷却至40℃，将混合菌液与豆粕混合进行堆积发酵，混合菌液由枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以重量比2:1:1 混合得到，菌液以5wt％接种量接至发酵底物棉粕中。混合过程中，调整物料含水量至40wt％，30℃，24h翻料一次，发酵60h，发酵结束后，烘干、粉碎，终产品水分控制在10％以下，根据粒度要求选择筛网粉碎即可。
实施例3
一种固态发酵棉粕的方法，采用以下步骤：
(1)菌种选取与实施例1相同；
(2)种子液制备：
(2-1)一级种子液制备：将斜面或甘油管保藏菌种接种至相应的种子培养基，其中枯草芽孢杆菌接种至LB培养基中，37℃、180rpm培养24h，酵母菌接种至马铃薯培养基中，30℃、200rpm培养30h，乳酸菌接种至MRS培养基中，37℃静置培养30h；
(2-2)二级种子液制备：将一级种子液接种到种子发酵罐中，乳酸菌接种到10L的玻璃瓶中，37℃发酵30h；酵母菌接种到15L的发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h，保持正压，30℃发酵20-30h；枯草芽孢杆菌接种到15L发酵罐中，转速200转/min、通气量1m3/h。保持正压，37℃发酵30h；
(3)发酵培养液制备：连接种子发酵罐和发酵罐，开蒸汽灭菌30min，关蒸汽，将种子发酵罐的罐压调高并打开阀门，利用蒸汽将种子液压到发酵罐中的发酵培养基中进行接种，枯草芽孢杆菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米淀粉5％；牛骨蛋白胨0.8％；棉粕2％；(NH4)2SO40.06％；其余为水，发酵培养基pH为7.2，酵母菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：食品级葡萄糖粉5％；(NH4)2SO40.5％；食品级KH2PO40.1％；食品级MgSO4·7H2O 0.05％；酵母浸膏0.5％；其余为水，发酵培养基pH为7.2。乳酸菌所接种的发酵培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：酵母浸膏5％；牛骨蛋白胨4％；食品级葡萄糖粉4％；轻质CaCO30.5％；其余为水，发酵培养基pH为7.0。关掉阀门，通蒸汽清洗30min，液体发酵24h，每4h镜检一次菌种状态，得到混合菌液；
(4)固态发酵：棉粕经高温高压灭菌后，冷却至30-50℃，将混合菌液与豆粕混合进行堆积发酵，混合菌液由枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以重量比2:1:1混合得到，菌液以8wt％接种量接至发酵底物棉粕中。混合过程中，调整 物料含水量至60wt％，35℃，24h翻料一次，发酵72h，发酵结束后，烘干、粉碎，终产品水分控制在10％以下，根据粒度要求选择筛网粉碎即可。
实施例4
混菌发酵棉粕具体工艺步骤：取500kg棉粕，棉粕经高温高压灭菌后，冷却至30℃左右，发酵底物用100kg水进行混料，采用的混合菌液为实施例2的步骤(3)制备得到的发酵混合液，混合菌液以2％的接种量与发酵原料混合，混合过程中调整物料含水量至40％，采用堆积固态发酵工艺，发酵温度控制在28℃，24h翻料一次，发酵48h，烘干粉碎，游离棉酚的降解率≥60％，TCA-NSI指数≥40.0％，粗蛋白含量≥48％。
实施例5
混菌发酵棉粕具体工艺步骤：取300kg高蛋白豆粕，棉粕经高温高压灭菌后，冷却至40℃左右，发酵底物用70kg水进行混料，采用的混合菌液为实施例2的步骤(3)制备得到的发酵混合液，混合菌液以5％的接种量与发酵原料混合，混合过程中调整物料含水量至50％，采用堆积固态发酵工艺，发酵温度控制在30℃，24h翻料一次，发酵60h，烘干粉碎，游离棉酚的降解率≥62％，TCA-NSI指数≥42.0％，粗蛋白含量≥48％。
实施例6
混菌发酵棉粕具体工艺步骤：取600kg高蛋白豆粕，棉粕经高温高压灭菌后，冷却至50℃左右，发酵底物用100kg水进行混料，采用的混合菌液为实施例2的步骤(3)制备得到的发酵混合液，混合菌液以3％的接种量与发酵原料混合，混合过程中调整物料含水量至60％，采用堆积固态发酵工艺，发酵温度控制在35℃，24h翻料一次，发酵72h，烘干粉碎，游离棉酚的降解率≥62％，TCA-NSI指数≥40.0％，粗蛋白含量≥48％。