本发明涉及饲料添加剂生物制备领域，尤其涉及一种米曲霉固态发酵制备富多肽蛋白饲料添加剂的方法。
背景技术：
豆粕、棉籽粕及羽毛粉等农副产物粗蛋白含量高，营养成分比较齐全，是饲料工业和畜牧养殖业中使用最为广泛的蛋白。但这些蛋白质分子结构复杂，相对分子质量较大，消化率和生物学效价不及鱼粉等动物性蛋白质。同时植物性蛋白源中存在多种抗营养因子，如胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、植酸、脂肪氧化酶等，这些抗营养因子对营养成分的消化、吸收、代谢以及对动物的健康和生产性能产生不良影响。发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多种酶活，消除抗营养因子，把大分子量的饼粕蛋白质分解为多肽、寡肽、甚至小肽，从而增加水溶性，利于动物消化吸收。
多肽的生产方法主要有化学法、酶解法和微生物发酵法。其中化学法因安全性等问题在食品、饲料中难以使用；而酶解法采用的是多种蛋白酶处理富蛋白农副产物，酶解效果较好但酶的价格昂贵不利于推广；微生物发酵法主要是利用微生物对蛋白物料进行发酵处理，既可以将有毒的成分经微生物代谢掉，还可以通过微生物发酵将植物细胞壁彻底破坏，使得营养物质更易释放，有利于动物更快更好的吸收，而且发酵对饲料的营养成分破坏很小，不会造成营养价值降低。处理方便成本较低并可大量操作。因此，开发一种固态发酵富蛋白农副产物制备富活性多肽饲料添加剂产品，会产生巨大的经济和社会效益。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种能将大分子蛋白质降解为多肽且能提高蛋白饲料营养价值的固态发酵制备富多肽蛋白饲料添加剂的方法。本发明中的发酵所采用的的菌株为米曲霉，发酵过程采用分阶段变温控制，利用本发明的方法制备的蛋白饲料基本不含抗营养因子，分子量小且易吸收，因此，该方法适合在养殖领域推广和营养。
本发明中所述的米曲霉(aspergillusoryzae)dj36，已于2017年2月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号：cgmccno.13575。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种米曲霉固态发酵制备富多肽蛋白饲料添加剂的方法，具体步骤如下：
(1)用接种环刮取米曲霉孢子接种于菌种活化培养基上，将菌种活化培养基置于28～32℃的生化培养箱中静止培养3～5天，待米曲霉孢子成熟后，结束培养，备用；
(2)用含有0.01v/v％吐温80的0.75％无菌生理盐水将步骤(1)中培养成熟后的米曲霉孢子洗净后，放置于装有无菌玻璃珠和50ml无菌生理盐水的容器中，充分振荡20～30min，待米曲霉孢子充分打散后，即得单孢子菌悬液；
(3)将步骤(2)中所制备的单孢子菌悬液以5～10％(v/v)的接种量接入装有30～50ml种子培养基的三角瓶中，所述三角瓶在转速为180～220r/min、温度为26～34℃的条件下，摇床培养2～4天，即得米曲霉种子培养液；
(4)将步骤(3)中所制备的米曲霉种子培养液接入装有固态发酵培养基的三角瓶中发酵，发酵过程采用分阶段控制发酵，发酵初始至发酵48h，在此期间，摇晃三角瓶2～3次，并控制发酵的温度范围为28～32℃；发酵48h至96h，在此期间，摇晃三角瓶2～3次，并控制发酵的温度范围为30～35℃；发酵至96h时，向三角瓶中加入已灭过菌的补充蛋白悬浮液30～40ml并充分搅拌，搅拌均匀后，继续发酵至144h，同时控制发酵的温度范围为37～40℃；再次将发酵温度提高到45～50℃，继续发酵6～8h，即得固体发酵物；
(5)将步骤(4)中的固体发酵物置于55～60℃的低温条件下烘干至含水率低于10％，将烘干后的固体发酵物粉碎并过150～200目筛，即得富多肽干粉。
进一步地，所述步骤(3)中的种子培养基中放置有18～22粒已灭菌的玻璃珠，并用6～8层纱布将种子培养基的口封住。
进一步地，所述步骤(4)中固态发酵培养基由以下重量份原料组成：豆粕20～30份、棉籽粕15～20份、谷朊粉15～25份、羽毛粉15～20份、麸皮8～10份、玉米芯粉5～10份、谷糠5～8份、玉米粉5～8份、蔗糖5～10份、吐温-805～10份、无机盐液50～100份。
进一步地，所述无机盐液的成分为(nh4)2so41.25份、尿素1份、kh2po41份、mgso4·7h2o0.5份、nano30.2份、fecl30.02份、吐温-800.5份、水500份。
进一步地，所述固态发酵培养基的制备过程如下：将豆粕、棉籽粕、谷朊粉、羽毛粉、麸皮、玉米芯粉、谷糠、玉米粉、蔗糖及吐温-80置于容器中并拌匀，向容器中加入去离子水并翻拌均匀后，将容器置于室温下浸润18～24h，再向容器中均匀喷洒无机盐液，即得固态发酵培养基。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
(1)本发明中的米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产菊粉酶等，米曲霉所产的蛋白酶能将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且还可以使辅料中的粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率。
(2)本发明中的米曲霉固态发酵与液态发酵相比，具有培养基简单、设备的来源广、能源消耗低、投资少且操作简便等优点。利用本发明的方法制备的蛋白饲料基本不含抗营养因子，分子量小且易吸收，对猪的生产性能有显著的促进作用；本发明制备的蛋白饲料通过喂养实验，验证了富多肽蛋白饲料添加剂具有明显的增重效果，提高饲料的转化利用率，提高育肥猪的生产性能。
(3)本发明中的发酵过程采用分阶段控制发酵，并在发酵过程中摇晃三角瓶是使固态培养基松散不结块，采用该方法制备富多肽蛋白饲料添加剂不仅操作简单，而且能源消耗低。
综上所述，本发明中方法具有操作简单、能源消耗低且成本低等优点，因此，该方法适合在富蛋白农副产物生物转化领域推广和应用。
附图说明
以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1是本发明中米曲霉菌株的示意图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
(1)采样及样品处理：
从富含蛋白质及菊芋的地方取土样。称取固体土样5g，放入装有玻璃珠及100ml已灭菌的生理盐水的容器中，在室温条件下，将容器振荡30min，即得土样浑浊液，备用。
(2)富集培养：
吸取3ml的土样浑浊液，加入装有50ml富集培养基一的容量为250ml的三角瓶中，将三角瓶置于40℃、转速为200r/min的条件下，摇床培养6天，即得富集培养液；量取40ml的富集培养液至离心管中，将离心管置于5000r/min的条件下，离心8min，即得上清液和沉淀；倒掉上清液，将沉淀置于装有50ml富集培养基二的容量为250ml的三角瓶中，将三角瓶置于40℃、转速为200r/min的条件下，恒温摇床中培养3天。
富集培养基一：豆粕粉1g、谷朊粉0.5g、无机盐营养液1ml，加水至100ml，并调节溶液的ph为4.5；将富集培养基一置于121℃的条件下灭菌15min，待自然冷却后，再加入过滤除菌的氨苄青霉素至浓度50mg/l。
富集培养基二：菊芋粉2g、无机盐营养液1ml,加水至100ml，并调节溶液的ph为4.5；将富集培养基二置于121℃的条件下灭菌15min，待自然冷却后，再加入过滤除菌的氨苄青霉素至浓度50mg/l。
无机盐营养液：(nh4)2so45g、nano32g、尿素2g、k2hpo41.5g、cacl21.5g、mgso40.1g、feso4·7h2o0.01g、mns04·h201.6mg、zns04·h2o0.05g、cocl20.5mg、去离子水1000ml。
(3)初筛：
将富集后的培养液逐级稀释到10-3、10-4、10-5、10-6，取各级稀释的培养液0.2ml分别涂布于霉菌筛选培养基上，将培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿口封好，并置于35℃恒温培养箱中倒置培养3天后，再将平板置于28℃恒温培养箱中继续倒置培养2天。将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分别为蛋白酶初筛培养基和菊粉酶初筛培养基；将接种好的培养皿置于38℃恒温培养箱中倒置培养3天。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从初筛平板上接种出来，进一步复筛。
霉菌筛选培养基：pda培养基800ml、孟加拉红0.02g、琼脂粉15g、氯霉素0.2g及无机盐营养液10ml，并加水至1000ml；将霉菌筛选培养基置于121℃的条件下灭菌15min，其中，孟加拉红和氯霉素在灭菌后加入。
pda培养基：马铃薯浸出液1000ml和蔗糖20g。
马铃薯浸出液的制备步骤如下：称取200g马铃薯，洗净后去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，加水至1000ml。
蛋白酶初筛培养基：pda培养基100ml、干酪素2g、无机盐营养液1ml及琼脂粉1.5g，调节溶液的ph为5；将蛋白酶初筛培养基置于121℃的条件下灭菌20min，
菊粉酶初筛培养基：菊粉2g、酵母粉0.2g、无机盐营养液1ml及琼脂1.5g，加水定容至100ml，ph为4.5。将菊粉酶初筛培养基置于121℃的条件下灭菌15min。
(4)复筛
初筛得到的菌株于pda培养基平板上划线，并置于35℃恒温培养箱中培养3天，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化。
将纯化后的菌株接种到固体种子培养基上，并将固体种子培养基置于35℃的条件下培养4天后，切取1平方厘米的菌苔接种到装有40ml液体种子培养基的三角瓶中，并将三角瓶置于温度为38℃、转速为180r/min的条件下，震荡培养3天后，按照10％(v/v)的接种量，将液体种子接种到液体发酵培养基中，将液体发酵培养基置于转速为160r/min、温度为36℃的条件下进行震荡发酵培养4天；将发酵液置于离心管中离心，即得上清液和沉淀，收集上清液测定蛋白酶活性和木聚糖酶活性，选取活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的蛋白酶、菊粉酶高产菌株。
固体种子培养基：pda培养基99ml、无机盐营养液1ml及琼脂粉1.5g；将固体种子培养基置于121℃的条件下灭菌15min。
液体种子培养基：菊粉3g、大豆蛋白1g、蛋白胨1g及无机盐营养液1ml；加去离子水至100ml，将液体种子培养基置于121℃的条件下灭菌15min。
复筛发酵培养基：菊粉3g、无机盐营养液1ml、蛋白胨1g、大豆蛋白2g、麸皮粉3g、吐温-800.5ml及无机盐营养液1ml，加去离子水至100ml；将复筛发酵培养基置于121℃的条件下灭菌15min。
实施例1
一种米曲霉固态发酵制备富多肽蛋白饲料添加剂的方法，具体步骤如下：
(1)用接种环刮取米曲霉孢子接种于菌种活化培养基上，将菌种活化培养基置于28℃的生化培养箱中静止培养3天，待米曲霉孢子成熟后，结束培养，备用；
(2)用含有0.01v/v％吐温80的0.75％无菌生理盐水将步骤(1)中培养成熟后的米曲霉孢子洗净后，放置于装有无菌玻璃珠和50ml无菌生理盐水的容器中，充分振荡20min，待米曲霉孢子充分打散后，即得单孢子菌悬液；
(3)将步骤(2)中所制备的单孢子菌悬液以5％(v/v)的接种量接入装有30ml种子培养基的三角瓶中，所述三角瓶在转速为180r/min、温度为26℃的条件下，摇床培养2天，即得米曲霉种子培养液；
(4)将步骤(3)中所制备的米曲霉种子培养液接入装有固态发酵培养基的三角瓶中发酵，发酵过程采用分阶段控制发酵，发酵初始至发酵48h，在此期间，摇晃三角瓶2次，并控制发酵的温度范围为28℃；发酵48h至96h，在此期间，摇晃三角瓶2次，并控制发酵的温度范围为30℃；发酵至96h时，向三角瓶中加入已灭过菌的补充蛋白悬浮液30ml并充分搅拌，搅拌均匀后，继续发酵至144h，同时控制发酵的温度范围为37℃；再次将发酵温度提高到45℃，继续发酵6h，即得固体发酵物；
(5)将步骤(4)中的固体发酵物置于55℃的低温条件下烘干至含水率低于10％，将烘干后的固体发酵物粉碎并过150目筛，即得富多肽干粉。
在本实施例中，所述步骤(3)中的种子培养基中放置有18粒已灭菌的玻璃珠，并用6层纱布将种子培养基的口封住。
在本实施例中，所述步骤(4)中固态发酵培养基由以下重量份原料组成：豆粕20g、棉籽粕15g、谷朊粉15g、羽毛粉15g、麸皮8g、玉米芯粉5g、谷糠5g、玉米粉5g、蔗糖5g、吐温-805ml、无机盐液50ml。
在本实施例中，所述无机盐液的成分为(nh4)2so41.25g、尿素1g、kh2po41g、mgso4·7h2o0.5g、nano30.2g、fecl30.02g、吐温-800.5ml、水500ml。
在本实施例中，所述固态发酵培养基的制备过程如下：将豆粕、棉籽粕、谷朊粉、羽毛粉、麸皮、玉米芯粉、谷糠、玉米粉、蔗糖及吐温-80置于容器中并拌匀，向容器中加入去离子水并翻拌均匀后，将容器置于室温下浸润18h，再向容器中均匀喷洒无机盐液，即得固态发酵培养基。
实施例2
一种米曲霉固态发酵制备富多肽蛋白饲料添加剂的方法，具体步骤如下：
(1)用接种环刮取米曲霉孢子，接种于菌种活化培养基上，将菌种活化培养基置于30℃的生化培养箱中静止培养4天，待米曲霉孢子成熟后，结束培养，备用；
(2)用含有0.01v/v％吐温80的0.75％无菌生理盐水将步骤(1)中培养成熟后的米曲霉孢子洗净后，放置于装有无菌玻璃珠和50ml无菌生理盐水的容器中，充分振荡25min，待米曲霉孢子充分打散后，即得单孢子菌悬液；
(3)将步骤(2)中所制备的单孢子菌悬液以8％(v/v)的接种量接入装有40ml种子培养基的三角瓶中，所述三角瓶在转速为200r/min、温度为30℃的条件下，摇床培养3天，即得米曲霉种子培养液；
(4)将步骤(3)中所制备的米曲霉种子培养液接入装有固态发酵培养基的三角瓶中发酵，发酵过程采用分阶段控制发酵，发酵初始至发酵48h，在此期间，摇晃三角瓶3次，并控制发酵的温度范围为30℃；发酵48h至96h，在此期间，摇晃三角瓶3次，并控制发酵的温度范围为32℃；发酵至96h时，向三角瓶中加入已灭过菌的补充蛋白悬浮液35ml并充分搅拌，搅拌均匀后，继续发酵至144h，同时控制发酵的温度范围为38℃；再次将发酵温度提高到48℃，继续发酵7h，即得固体发酵物；
(5)将步骤(4)中的固体发酵物置于58℃的低温条件下烘干至含水率低于10％，将烘干后的固体发酵物粉碎并过200目筛，即得富多肽干粉。
在本实施例中，所述步骤(3)中的种子培养基中放置有20粒已灭菌的玻璃珠，并用7层纱布将种子培养基的口封住。
在本实施例中，所述步骤(4)中固态发酵培养基由以下重量份原料组成：豆粕25g、棉籽粕18g、谷朊粉20g、羽毛粉18g、麸皮9g、玉米芯粉8g、谷糠6g、玉米粉7g、蔗糖8g、吐温-808ml、无机盐液80ml。
在本实施例中，所述无机盐液的成分为(nh4)2so41.25g、尿素1g、kh2po41g、mgso4·7h2o0.5g、nano30.2g、fecl30.02g、吐温-800.5ml、水500ml。
在本实施例中，所述固态发酵培养基的制备过程如下：将豆粕、棉籽粕、谷朊粉、羽毛粉、麸皮、玉米芯粉、谷糠、玉米粉、蔗糖及吐温-80置于容器中并拌匀，向容器中加入去离子水并翻拌均匀后，将容器置于室温下浸润20h，再向容器中均匀喷洒无机盐液，即得固态发酵培养基。
实施例3
一种米曲霉固态发酵制备富多肽蛋白饲料添加剂的方法，具体步骤如下：
(1)用接种环刮取米曲霉孢子，接种于菌种活化培养基上，将菌种活化培养基置于32℃的生化培养箱中静止培养5天，待米曲霉孢子成熟后，结束培养，备用；
(2)用含有0.01v/v％吐温80的0.75％无菌生理盐水将步骤(1)中培养成熟后的米曲霉孢子洗净后，放置于装有无菌玻璃珠和50ml无菌生理盐水的容器中，充分振荡30min，待米曲霉孢子充分打散后，即得单孢子菌悬液；
(3)将步骤(2)中所制备的单孢子菌悬液以10％(v/v)的接种量接入装有50ml种子培养基的三角瓶中，所述三角瓶在转速为220r/min、温度为34℃的条件下，摇床培养4天，即得米曲霉种子培养液；
(4)将步骤(3)中所制备的米曲霉种子培养液接入装有固态发酵培养基的三角瓶中发酵，发酵过程采用分阶段控制发酵，发酵初始至发酵48h，在此期间，摇晃三角瓶3次，并控制发酵的温度范围为32℃；发酵48h至96h，在此期间，摇晃三角瓶3次，并控制发酵的温度范围为35℃；发酵至96h时，向三角瓶中加入已灭过菌的补充蛋白悬浮液40ml并充分搅拌，搅拌均匀后，继续发酵至144h，同时控制发酵的温度范围为40℃；再次将发酵温度提高到50℃，继续发酵8h，即得固体发酵物；
(5)将步骤(4)中的固体发酵物置于60℃的低温条件下烘干至含水率低于10％，将烘干后的固体发酵物粉碎并过200目筛，即得富多肽干粉。
在本实施例中，所述步骤(3)中的种子培养基中放置有22粒已灭菌的玻璃珠，并用8层纱布将种子培养基的口封住。
在本实施例中，所述步骤(4)中固态发酵培养基由以下重量份原料组成：豆粕30g、棉籽粕20g、谷朊粉25g、羽毛粉20g、麸皮10g、玉米芯粉10g、谷糠8g、玉米粉8g、蔗糖10g、吐温-8010ml、无机盐液100ml。
在本实施例中，所述无机盐液的成分为(nh4)2so41.25g、尿素1g、kh2po41g、mgso4·7h2o0.5g、nano30.2g、fecl30.02g、吐温-800.5ml、水500ml。
在本实施例中，所述固态发酵培养基的制备过程如下：将豆粕、棉籽粕、谷朊粉、羽毛粉、麸皮、玉米芯粉、谷糠、玉米粉、蔗糖及吐温-80置于容器中并拌匀，向容器中加入去离子水并翻拌均匀后，将容器置于室温下浸润24h，再向容器中均匀喷洒无机盐液，即得固态发酵培养基。
实验与结果
以实施例1所制备的富多肽蛋白饲料添加剂，做临床疗效总结如下。
1、品种选择
选择健康、体重约为60kg的育肥猪60头，按体重相近，公母各半的原则将其分为实验组和对照组，每组30头。
2、饲料选择
对照组喂养的饲料是在基础饲粮原料中添加0.4％的未经发酵的物料；实验组喂养的饲料是在基础饲粮原料中添加0.4％的经过本技术发酵处理后的富多肽蛋白饲料添加剂；试验期为30天。
3、判断标准
在实验过程中，测定每只猪的日采食量；在试验始、末，对每只猪称重；测定猪日增重、日耗料量、料重比。
观测记录猪群健康指标，记录每天每组每头猪的腹泻次数和持续时间。观察实验猪的发病情况、腹泻频次、死亡率。
4、结果
在实验期中，对照组有2头猪发生腹泻，共腹泻7天。实验组猪健康状况良好，未发生腹泻现象。对照组存活率为80％，实验组存活率均为100％。
在实验过程中，与对照组相比，实验组育肥猪的食欲更加旺盛。同时饲养过程未发生任何不良状况，实验猪外观皮肤、毛色、健康状况及行为均正常。猪健康状况测定见下表：
表1试验猪健康状况测定结果
微生物饲料添加剂对育肥猪生产性能的影响：
表2富多肽饲料添加剂对猪生产性能的影响
由表2可见，猪的始重：对照组和实验组猪的始重没有显著差异；未重：实验组猪的平均末重较对照组提高了6.50％；日均增重：实验组猪的日均增重较对照组提高了28.94％，增重效果非常明显，说明经发酵后的富多肽饲料其能提供营养，促进猪的生长；日均采食量：实验组猪的日均采食量较对照组提高5.79％，说明添加富多肽蛋白饲料添加剂后饲料的适口性好，可增强育猪的食欲、增加采食量且实验组中育肥猪的毛色短亮；实验组饲料转化率为29.91％，显著高于对照组24.54％。
综上得出结论：实验组中的育肥猪增重显著，促长作用明显，在提高育肥猪日增重及降低料肉比方面效果显著，能较大程度的提高饲料的转化利用率。
综上所述，上述实施方式并非是本发明的限制性实施方式，凡本领域的技术人员在本发明的实质内容的基础上所进行的修饰或者等效变形，均在本发明的技术范畴。