菜籽蛋白微胶囊的超声波制备方法及作为功能食品的应用与流程

本发明涉及功能食品微胶囊技术领域，特指一种以油菜籽活性蛋白为原料、采用逆流超声处理制备微胶囊并对姜黄素进行包埋的的方法，并将其开发为功能食品。

背景技术：

维生素、不饱和脂肪酸、多酚类化合物或益生菌等生物活性成分，具有调节人体生理机能的功能，可以延缓和预防慢性疾病的发生。然而，上述活性成分对食品加工和储藏过程中温度、氧、光、ph和金属离子等因素敏感，易于发生氧化、异构化、聚集或降解等结构改变，导致生物活性降低或丢失。而且，疏水性和两亲性活性成分在水中溶解度非常低。这些在很大程度上限制了生物活性成分在食品和医药工业中的应用。如姜黄素(curcumin)，从姜科植物.(curcumalongal)中提取的一种相对分子质量小的多酚类物质，通常认为它是姜黄中最有效的成分。研究表明，姜黄素具有抗炎症、抗肿瘤、清除自由基、抗癌作、抗氧化、降低血糖、血脂等多种生理活性。然而姜黄素易受环境因素的影响，如在酸、中性环境中溶解性低；在碱液中容易降解，性质不稳定，；在光照、加热及铁离子的存在下易分解；口服用药吸收性差等问题。研究发现对生物活性成分进行包埋是食品加工和储藏过程中对其保护、消化以及增加生物利用度的一种有效手段。天然的生物大分子(如蛋白质、多糖等)不但具有高的营养价值，而且具有多种功能特性，已被广泛用作包埋技术中的原料。

油菜籽因含有丰富的油脂和优质蛋白质而成为世界及我国重要的油料作物之一。我国历来是油菜生产大国，目前种植面积和产量均居世界之首，其种植面积占全国油料作物总种植面积的30％以上；菜籽油产量占主要食用植物油总产量的35％以上；2016年全国油菜籽总产量已达到1400万吨。油菜籽含有40-45％的油脂，20-25％的蛋白质和25％的碳水化合物，不仅是主要的油料作物，也是巨大的植物蛋白资源，菜籽蛋白的氨基酸组成合理，其赖氨酸含量与大豆相当，而蛋氨酸等含硫氨基酸的含量则高于大豆蛋白，是我国有待开发利用的最大优质实用蛋白，具有重要的经济价值。

目前菜籽蛋白并没有能像大豆蛋白那样得到广泛的应用，主要有两个原因：一是菜籽粕中含有硫苷、植酸等有毒有害物质，主要还是用作肥料，产品附加值低，资源浪费严重；二是对菜籽蛋白的研究力度、深度和广度远不及对大豆蛋白的研究。随着“双低”油菜的推广种植，菜籽蛋白作为大宗植物蛋白成为可能，对菜籽蛋白的研究也随之变得更加重要。国内外对菜籽蛋白的提取工艺、结构特性以及功能性质进行了相应研究，但都存在一些诸如提取率不高和工艺复杂等缺陷，并未实现产业化，目前国内外都很重视菜籽粕的加工潜质，积极采用现代加工技术，进行综合加工，以实现更好的经济和社会效益。目前菜籽粕的深加工主要集中于加工制备菜籽蛋白、菜籽蛋白活性肽以及采用微生物发酵制备菜籽饼粕饲料。

研究发现蛋白质微胶囊可以对生物活性成分起到很好的包埋和保护作用。因此国内外学者进行了大量的蛋白质对生物活性成分包埋的研究。乳化法是蛋白质微胶囊包埋生物活性成分的常用方法，此法的不足表现在蛋白质微胶囊包埋生物活性成分的过程中需要添加有机溶剂、表面活性剂、戊二醛交联剂等，这些试剂的残留使蛋白质微胶囊的具有一定毒性；去溶剂法和化学交联法也涉及有毒交联剂的引入；因此这三种方法不是蛋白质微胶囊包埋生物活性成分的理想方法。离子交联法和自组装法制备蛋白质微胶囊，条件温和，不需要有毒的交联剂，不生成化合键，仅依靠非共价键进行连接，因而被广泛使用。特别是自组装法，对于营养递送系统设计而言，安全性等相对更佳。然而蛋白质毕竟是具体独特性质的生物大分子，仅仅通过简单自组装法包埋生物活性成分，蛋白质分子对生物活性成分的包埋效率低。

为了解决这一问题，本发明引进先进的逆流超声波技术，希望超声波能激发蛋白质与多酚两种生物大分子溶液产生与其自身固有频率相匹配的共振频率，产生交联，获得了一种包埋效率高、ph稳定、粒径均一的蛋白质微胶囊，利用所得的蛋白质微胶囊对生物活性成分进行包埋和保护。

技术实现要素：

为解决上述问题，该发明主要是通过扫频超声波和逆流超声波处理等技术手段制备菜籽活性蛋白微胶囊，并研究其对姜黄素的包埋作用。

本发明负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊，是由以下重量份的原料制备而成：

油菜籽活性蛋白：10-25份；

姜黄素：1-5份。

优选以下重量份的原料制备而成：

油菜籽活性蛋白：5份；

姜黄素：1份。

其中所述的油菜籽活性蛋白按照下述步骤进行制备：

(1)脱脂后的油菜籽饼粕采用粉碎机粉碎后过60筛，按照料液比1:10(mg/ml)加入蒸馏水；调ph到4，在室温下搅拌2h，4℃下经10000r/min离心20min，留离心残渣；

(2)将离心残渣按照料液比1:10(mg/ml)加入蒸馏水；调ph到12，于室温下搅拌1h，同时进行多频模式超声处理，超声处理结束后，于4℃下经10000r/min离心20min，保留上清液，

(3)将上清液ph调到4，充分搅拌后静置30min；4℃温度下经10000r/min离心20min，收集沉淀，然后将沉淀按照料液比1:10(mg/ml)的比例用ph＝4的蒸馏水清洗两次，经冷冻干燥获得菜籽活性蛋白粉末。

其中步骤(2)中所述的多频超声处理模式为：三频同步或者双频同步或者单频超声处理，超声功率密度80～120w/l；超声脉冲工作时间10s；脉冲间歇时间3s，超声处理时间为1h。

其中步骤(2)中三频同步或者双频同步或者单频超声处理的超声波频率组合为：20khz、35khz、35/40khz或者20/35/40khz，优选20/35/40khz。

油菜籽活性蛋白微胶囊负载姜黄素的制备方法，按照下述步骤进行：

(1)将油菜籽活性蛋白溶解到蒸馏水中，磁力搅拌的同时调节ph＝12，至蛋白完全溶解；得到油菜籽活性蛋白浓度为(10-25)mg/ml溶液；

(2)将浓度为(10-20)mg/ml的叶黄素乙醇溶液快速注入步骤(1)制备的油菜籽活性蛋白溶液中，使得油菜籽活性蛋白和姜黄素的质量比为(10-25)：(1-5)；调节溶液体系的ph＝8～12；

(3)室温下将步骤(2)得到的混合溶液进行逆流超声波处理，具体参数为脉冲宽度1～5s、脉冲间隔1～5s、超声功率密度50～80w/l；超声频率20khz，料液以逆流循环的方式通过超声探头。

(4)超声结束后，静置1h即得负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥后得到负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊。

其中步骤(2)中所述的油菜籽活性蛋白和姜黄素的质量比例优选为5：1。

其中步骤(3)中优选调节混合溶液的ph＝10。

其中步骤(3)中优选超声参数为脉冲宽度5s、脉冲间隔5s、超声功率密度80w/l；超声频率20khz，料液以逆流循环的方式通过超声探头。

油菜籽活性蛋白微胶囊负载姜黄素的制备方法，或者按照下述步骤进行：

(1)将油菜籽活性蛋白溶解到蒸馏水中，磁力搅拌的同时调节ph＝12，至蛋白完全溶解；得到油菜籽活性蛋白浓度为(10-25)mg/ml溶液；

(2)将浓度为(10-20)mg/ml的叶黄素乙醇溶液快速注入步骤(1)制备的油菜籽活性蛋白溶液中，使得油菜籽活性蛋白和姜黄素的质量比为(10-25)：(1-5)；调节溶液体系的ph＝8～12；

(3)室温下将步骤(2)得到的混合溶液进行双频扫频超声波处理，双频扫频超声处理时固定上下板间距为10cm，扫频周期300s，间歇比1:1.2(超声10s，间歇12s)，上下每块振板功率为600w；

(4)超声结束后，静置1h即得负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥后得到负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊。

其中步骤(2)中所述的油菜籽活性蛋白和姜黄素的质量比例优选为5：1。

其中步骤(3)中优选调节混合溶液的ph＝10。

其中步骤(3)中所述的双频频率组合为：33khz/68khz、33khz/40khz、33khz/28khz、28khz/40khz；最优选佳频率组合为33khz/68khz。

包埋姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊具有稳定性好、生物相容性好、缓释时间长、包载率高等优点，可应用于食品、保健品、药品。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明在油菜籽活性蛋白包埋姜黄素的过程中施加了逆流超声波和扫频超声波，改变油菜籽活性蛋白的高级结构，使其结构打开，暴露活性基团，蛋白质形成小的聚集体，从而促进各聚集体通过疏水相互作用形成微胶囊为包埋生物活性成分提供基础。

(2)本发明在油菜籽活性蛋白包埋姜黄素的过程中施加了逆流超声波和扫频超声波，，取代传统制备蛋白微胶囊过程中的加热和金属离子，减少了加热和金属离子对活性成分姜黄素的破坏作用，提高了生物活性成分的包埋效率和负载率。

(3)本发明中包埋姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊的制备方法，工艺操作简单，制备过程中未涉及有机试剂，适宜工业化生产，且油菜籽活性蛋白原料价格便宜，制备工艺简单。

(4)本发明的包埋姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊具有稳定性好、生物相容性好、缓释时间长、包载率高等优点，可应用于食品、保健品、药品及化妆品等多个领域。

(5)本发明以菜籽油加工的下脚料菜籽饼粕为原料，提取其中的油菜籽活性蛋白并用作制备包埋姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊的原料，有利于菜籽加工副产物的综合利用，同时提高菜籽饼粕的附加值。

附图说明

图1是本发明的多模式超声波生物处理设备结构图，其中1、2、3为超声振板，4为盛液器，5为水浴锅，6为温度探头，7为循环泵，8为电脑程序控制器，9、10、11为超声控制器。

图2是扫频双频超声预处理装置的设备图，1-超声池，2-温度计，3-恒温水浴池，4-超声波上振板，5-超声波下振板，6-样品处理区域，7-电脑控制器，8-超声波发生器。

图3是逆流超声处理设备结构示意图，1为聚能式超声波探头，2为超声波控制器，3为超声杯型腔，4为进料口，5为循环泵，6为盛液器，7为出料口。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

图1为本发明的多模式超声波生物处理设备，该设备配有一台电脑程序控制器8，可设定超声工作参数(超声功率密度、频率、脉冲工作时间、间歇时间和处理总时间)分别控制三个超声控制器9、10、11，分别连接三支不同频率的超声振板1、2、3，可实现单一频率/两个频率/三个频率超声波处理；将需要处理的溶液投入盛液器4中进行单频/双频/多频超声处理，启动循环泵7对溶液进行循环。通过水浴锅5和温度探头6实现溶液温度的自动控制。

图2为本发明使用的扫频双频超声预处理装置的设备图，为江苏大学自主研制。超声发生器8能发出定频和扫频两种模式的超声波，单台超声波发生器功率为600w。在超声池1中上下对称放置超声波振板上板4和超声波下板5，通过超声波发生器8控制超声波振板上板4和超声波下板5；电脑控制器7设定超声波各参数后，控制超声波发生器8，发出符合要求的超声波；3为本发明中设备的恒温水浴池，通过温度计2实时监控温度，并根据工作需要调节介质温度；将需要处理的液原料置于样品袋中置于处理液区域6中进行超声波处理。

图3为本发明的逆流超声处理设备，该设备配有超声波控制器2，控制超声参数，聚能式超声波探头1对进料口4进入超声杯型腔3的物料进行处理，超声的同时启动循环泵5对料液进行循环，6为盛液器，7为出料口。

本发明中的油菜籽活性蛋白或者按照下述步骤进行制备：

(1)脱脂后的油菜籽饼粕粉碎过60筛，按照料液比1:10(mg/ml)加入蒸馏水；调ph到4，在室温下搅拌2h，4℃10000r/min离心20min，留离心残渣；

(2)将离心残渣按照料液比1:10(mg/ml)加入蒸馏水；调ph到12，于室温下搅拌1h，同时进行多频模式超声处理，超声处理结束后于4℃10000r/min离心20min，保留上清液。多频超声处理模式为：三频同步或者双频同步或者单频超声处理，超声功率密度80～120w/l；超声脉冲工作时间10s；脉冲间歇时间3s，超声处理时间为1h。三频同步超声处理的超声波频率组合为：20/35/40khz。

(3)将上清液ph调到4，充分搅拌后静置30min；4℃10000r/min离心20min，收集沉淀，然后将沉淀按照料液比1:10(mg/ml)的比例用ph＝4的蒸馏水清洗两次，经冷冻干燥获得菜籽活性蛋白粉末，经测定油菜籽蛋白的纯度为86％，油菜籽蛋白的得率为26％。

实施例1-4(不加超声)

(1)将油菜籽活性蛋白溶解到蒸馏水中，磁力搅拌的同时调节ph＝12，至蛋白完全溶解；得到油菜籽活性蛋白浓度为(10-25)mg/ml溶液；

(2)将浓度为(10-20)mg/ml的叶黄素乙醇溶液快速注入步骤(1)制备的油菜籽活性蛋白溶液中，使得油菜籽活性蛋白和姜黄素的质量比见表1；调节溶液体系的ph＝10；

(3)静置1h后，即得负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥后得到负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊。

(4)叶黄素包封率和负载率的测定

取负载姜黄素的油菜籽活性蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒溶液，经超滤管(截留分子量12kd)在8000×g下离心30min，取滤液500μl定容至25ml，测其在波长为450nm处的吸光值，并计算游离姜黄素质量。根据下式计算姜黄素的包封率和负载率：

姜黄素的包封率(％)＝(姜黄素总质量－游离姜黄素质量)×100/姜黄素总质量；

姜黄素的负载率(％)＝(姜黄素总质量－游离姜黄素质量)×100/样品总质量。

实施例1-4制备过程相同，只是油菜籽活性蛋白/姜黄素质量不同，具体见表1不同油菜籽活性蛋白/姜黄素质量比对姜黄素包封率和负载率的影响。

通过表1中对比实施例1-4不同油菜籽活性蛋白/姜黄素质量比对姜黄素包封率和负载率的影响可以看出，随着油菜籽活性蛋白的量增加，姜黄素的包封率逐步降低，但是当油菜籽活性蛋白/姜黄素质量比为20:1时，姜黄素的包封率又升高了，达到了34.8％。

表1不同油菜籽活性蛋白/姜黄素质量比对姜黄素包封率和负载率的影响

实施例5-8(加双频扫频超声处理)

(1)将油菜籽活性蛋白溶解到蒸馏水中，磁力搅拌的同时调节ph＝12，至蛋白完全溶解；得到油菜籽活性蛋白浓度为20mg/ml溶液；

(2)将浓度为(10-20)mg/ml的叶黄素乙醇溶液快速注入步骤(1)制备的油菜籽活性蛋白溶液中，使得油菜籽活性蛋白和姜黄素的质量比为10：1；调节溶液体系的ph＝10；

(3)室温下将步骤(2)得到的混合溶液进行双频扫频超声波处理，双频扫频超声处理时固定上下板间距为10cm，扫频周期300s，间歇比1:1.2(超声10s，间歇12s)，上下每块振板功率为600w；扫频双频频率组合为：见表2；

(4)超声结束后，静置1h，即得负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥后得到负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊。

(5)叶黄素包封率和负载率的测定

取负载姜黄素的油菜籽活性蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒溶液，经超滤管(截留分子量12kd)在8000×g下离心30min，取滤液500μl定容至25ml，测其在波长为450nm处的吸光值，并计算游离姜黄素质量。根据下式计算姜黄素的包封率和负载率：

姜黄素的包封率(％)＝(姜黄素总质量－游离姜黄素质量)×100/姜黄素总质量；

姜黄素的负载率(％)＝(姜黄素总质量－游离姜黄素质量)×100/样品总质量。

实施例9-10(加逆流超声处理)

(1)将油菜籽活性蛋白溶解到蒸馏水中，磁力搅拌的同时调节ph＝12，至蛋白完全溶解；得到油菜籽活性蛋白浓度为20mg/ml溶液；

(2)将浓度为(10-20)mg/ml的叶黄素乙醇溶液快速注入步骤(1)制备的油菜籽活性蛋白溶液中，使得油菜籽活性蛋白和姜黄素的质量比为10：1；调节溶液体系的ph＝10；

(3)室温下将步骤(2)得到的混合溶液进行逆流超声波处理，具体超声参数为脉冲宽度1～5s、脉冲间隔1～5s、超声功率密度50～80w/l；超声频率20khz，料液以逆流循环的方式通过超声探头。

(4)超声结束后，静置1h即得负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥后得到负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊。

(5)叶黄素包封率和负载率的测定

取负载姜黄素的油菜籽活性蛋白微胶囊溶液，经超滤管(截留分子量12kd)在8000×g下离心30min，取滤液500μl于25ml容量瓶中定容，测定a450处的吸光值，并计算游离姜黄素质量。根据下式计算姜黄素的包封率和负载率：

姜黄素的包封率(％)＝(姜黄素总质量－游离姜黄素质量)×100/姜黄素总质量；

姜黄素的负载率(％)＝(姜黄素总质量－游离姜黄素质量)×100/样品总质量。

实施例5-10制备过程相同，只是超声参数略有改变，表2不同超声波模式对姜黄素包封率和负载率的影响。

表2不同超声波模式对姜黄素包封率和负载率的影响

通过表2中对比实施例5-10不同超声波模式对油菜籽活性蛋白微胶囊包埋姜黄素的包封率和负载率的影响，可以发现超声波处理可以显著提高油菜籽活性蛋白微胶囊包埋姜黄素的包封率，与对照相比(不超声)，逆流超声波处理使姜黄素的包封率提高62.7％～70.9％，而33khz/68khz的双频扫频超声波处理则使姜黄素的包封率提高了77.1％。