专利名称：含有imp脱氢酶基因的dna及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产次黄苷和/或鸟苷的改良方法，用于该方法的新的微生物以及用于衍生该新微生物的新DNA。所说的次黄苷和/或鸟苷可用作生产5′-次黄苷酸(5′IMP)和5′-鸟苷酸(5′-GMP)的原料，后者则分别是日本木鱼(干燥的鲣鱼)和香茹的香味成分。
现有技术中，已使用了属于芽孢杆菌属(美国专利3，960，661号、日本专利公开57-41915号和美国专利4，701，413号)、短杆菌属(美国专利3，736，228号)及其他有需要腺嘌呤之性质并且最好具有各种药物抗性的细菌，发酵生产次黄苷。另外，也已使用属于芽孢杆菌属(美国专利3，912，587和美国专利4，283，346)、短杆菌属(日本专利公开58-17592号)等的细菌生产鸟苷。然而，因为次黄苷和鸟苷是通过共同的生物合成途径产生的，所以有时在培养次黄苷生产菌时同时会产生鸟苷，或相反在培养鸟苷生产菌时可伴随鸟苷产生大量的次黄苷。在这种情况下，为了由培养液中分离次黄苷或鸟苷，需要使用复杂的纯化工艺。
为此，有人提出了使用含有质粒的转化体生产鸟苷的方法，其中使用了近年发展的重组DNA技术，将编码在鸟苷生物合成途径中起重要作用之IMP脱氢酶基因的DNA连接到所说的质粒中(美国专利4，749，650号)。
另一方面，为了抑制副产物鸟苷的生成，还有人提出了利用重组DNA技术衍生IMP脱氢酶缺陷性菌株的方法(欧洲专利公开273660A号)。
但是，即使后两种方法，与次黄苷和鸟苷在食品工业中的重要性相比，仍不能令人满意。前者因为使用了质粒，故从生产的稳定性来看仍是不能令人满意的，而后者则需要不停地提供微生物生长所必需的黄嘌呤。因此，期望建立一种生产次黄苷和/或鸟苷的改良方法。
本发明的一个目的是提供一种生产次黄苷和/或鸟苷的改良方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于本发明方法的、属于芽孢杆菌属的新微生物。
本发明的再一个目的是提供一个用于衍生本发明之新微生物的含有IMP脱氢酶基因的新DNA。
本领域的熟练技术人员将会根据下文参照附图所作的描述，进一步了解本发明的这些目的和其他目的以及本发明的优点。
图1图解显示了下文实施例1中所述质粒pEX214的构建。
图2-1到2-3图解显示了IMP脱氢酶基因的DNA顺序。
图3图解显示了下文实施例1中所述质粒pEX214△3的构建，及位于IMP脱氢酶基因5′上游之连接位点邻近区的DNA顺序。
图4图解显示了下文实施例1中所述质粒pEX241的构建。
图5图解显示了下文实施例1中所述质粒pEX242的构建。
图6图解显示了下文实施例1中所述质粒pEX210的构建。
附图中，符号P、X、H、Sm、S、E、Sa、K、C、Ms、Mb、N和M分别代表限制性酶PstⅠ、XbaⅠ、HincⅡ、SmaⅠ、SspⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、ClaⅠ、MspⅠ、MboⅠ、NruⅠ和MluⅠ的酶切位点。符号(f)表明其末端被转变成平头。加阴影部分是IMP脱氢酶基因区、空白部分是IMP脱氢酶基因的相邻区域，黑色部分是SPO1-26启动子，粗实线是氯霉素乙酰转移酶基因区，实线是载体区域。
本发明人已注意到这样一个事实，即生产菌的IMP脱氢酶活性与积聚的鸟苷量密切相关，从而深入地研究了增加鸟苷或次黄苷之产率的方法，即通过酶基因的高表达以选择性地积聚大量鸟苷，或相反通过基因的低表达以选择性地积聚大量次黄苷。
使用重组DNA技术，本发明人已成功地得到了一种新的微生物，该微生物系衍生于能够产生次黄苷或次黄苷与鸟苷的微生物菌株，其中染色体上编码IMP脱氢酶基因之DNA的启动子部分被允许目的基因在该微生物菌株中高表达的不同的启动子所取代，另外也已由能够产生次黄苷和鸟苷、或次黄苷与黄苷，或黄苷和/或鸟苷的微生物菌株衍生得到了另一株新微生物，其中染色体上编码IMP脱氢酶基因之DNA的启动子部分被允许目的基因在该微生物菌株中进行低表达的不同的启动子所取代。
其后发现，按上述技术，使用选自芽孢杆菌属细菌的微生物(作为接受体)制得的新微生物，能够大量积聚鸟苷(或次黄苷)，因为在其染色体DNA上已整合了具有允许高(或低)表达目的产物之启动子的IMP脱氢酶基因，从而可以分别非常稳定地生产次黄苷和/或鸟苷。
已基于上述发现完成了本发明，并提供了含有芽孢杆菌属微生物染色体之IMP脱氢酶基因的DNA，其中IMP脱氢酶基因的启动子被不同的可表达启动子所取代。此外，本发明还提供了其中整合了本发明之DNA的载体、用本发明的DNA或载体转化的能够产生次黄苷和/或鸟苷的芽孢杆菌属微生物、以及生产次黄苷和/或鸟苷的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的芽孢杆菌属微生物，以产生和积聚次黄苷和/或鸟苷并收集所得产物。
用于本发明的含有IMP脱氢酶基因区域的DNA，最好含有全部编码该酶基因的DNA，以及其上游和下游的某些外周部分。但它可以含有开放读码之5′上游部分的DNA，包括酶的转译起始位点、SD顺序、启动子及其某些5′上游区。
这样一个DNA顺序通常是用重组DNA技术由微生物的染色体DNA中分离的。作为用于这一目的的宿主-载体系统，可使用一般常用的EK系统。即其中作为宿主，可使用衍生于大肠杆菌K-12菌株的微生物，如大肠杆菌C600(T.Maniatisetal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1982，PP.504)、大肠杆菌JA221(IFO14359，ATCC33875)、大肠杆菌MM294(ATCC33625)〔Proc.Natl.Acad.Scl.USA，73，4174(1976)〕或其衍生株。作为载体，可使用质粒PBR322、pACYC184、pACYC177、pUC18、pUC19、pHSG396、pHSG298等。
另外，可使用由噬菌体载体如Charon4A(MolecularCloning，pp.31)、EMBL3和EBML4(J.Mol.Biol.，170，827)等与大肠杆菌DP50SupF(MolecularCloning，pp.504)、大肠杆菌NM538和NM539(J.Mol.Biol.，170，827)、大肠杆菌LE392(J.Biol.Chem.，218，97)等宿主结合的宿主-载体系统。当然，也可使用以芽孢杆菌属微生物如枯草芽孢杆菌MI114(Gene，24，255)或其突变体作宿主，并以具有在芽孢杆菌属微生物中自主复制能力的质粒如PUB110、pC194、pE194、pS194、pSA2100、pHY300PLK等作载体的宿主-载体系统。
原则上，只要微生物之IMP脱氢酶基因的碱基顺序与下文所述用作接受体的芽孢杆菌属微生物之染色体上IMP脱氢酶基因的碱基顺序有高度同源性，均可以使用，而不必受IMP脱氢酶基因之供体微生物来源的限制。其中，当使用芽孢杆菌属微生物时，可实现所谓的自身克隆并因其易于操作，故应优先选用。还期望所得到的转化体是稳定的。再者，供体不一定能产生次黄苷、鸟苷、黄苷或其嘌呤碱基。但该供体最好没有IMP脱氢酶缺陷。
这种供体微生物的例子包括枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、短小芽孢杆菌(B.Pumilus)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。更具体地说，可包括下列微生物菌株枯草芽孢杆菌№168(BGSClAl)、枯草芽孢杆菌№.115(IFO14187，FERMBP-1327)、枯草芽孢杆菌MI114(Gene，24，255)、短小芽孢杆菌ATCC7061和地衣芽孢杆菌ATCC14580(BGSC是BacillusGeneticStockGenter，IFO是InstituteofFermentation，Osaka，ATCC是AmericanTypeCultureCollection)。
可按照美国专利4，749，650号中所述的方法由这些供体微生物中分离含IMP脱氢酶基因的DNA。另外，按照欧洲专利公开273660A号中所述的方法，可由供体微生物的基因库中筛选一个能补偿IMP脱氢酶缺陷型芽孢杆菌突变体对黄嘌呤之需求的重组体，从而得到含有IMP脱氢酶基因的DNA，所说的重组体的染色体上具有与下文所述用作接受体的芽孢杆菌属微生物高度同源的IMP脱氢酶基因DNA顺序。
可利用重组DNA技术，使用大肠杆菌的宿主-载体系统，由如此得到的含IMP脱氢酶基因的DNA中制备和分离本发明的新DNA。
可按下述方法由含IMP脱氢酶基因的质粒中制备和分离本发明的新DNA。
在下述的于大肠杆菌内制备本发明DNA的步骤中，为实验方便起见，可在新的载体内再克隆该DNA片段，或者将其连接到多聚接头下游。为此，最好利用大肠杆菌载体PUC119的多聚接头进行再克隆，这样，新DNA的制备和DNA顺序的测定均可比较方便地完成。
首先，由含有IMP脱氢酶基因的DNA中制备缺失启动子区的DNA片段。为此，可按下述程序进行用只有一个切点的限制性酶切割含IMP脱氢酶基因的质粒，所说的酶切点位于启动子上游并在靠近启动子的位置上。然后用从其末端依次切断双股DNA的酶，如BAL31消化已在切点被切断了的质粒，删除IMP脱氢酶基因的上游区，得到剪短的DNA片段。这种情况下，为得到正好删除了IMP脱氢酶基因之启动子的DNA片段，可利用不同量的内切酶和控制不同的反应时间制得有不同长度的DNA片段，然后借助下文所述的适当方法，如根据对片段的DNA顺序测定结果，由其中筛选出所需的DNA片段。测定DNA顺序时，可将DNA片段再克隆到适用于该目的的载体中，如M13、PUC118或PUC119中，然后用已知方法F.Sanger等人(Proc，Natl.Acad.Sci.USA，74，5463)的方法进行DNA顺序测定。
可按下述程序将一不同的启动子插入如此得到的DNA中IMP脱氢酶基因开放读码的上游(即SD顺序的上游)区内。使用只有一个切点的限制性酶切断质粒，该酶切点位于含IMP脱氢酶基因之质粒的开放读码的上游(SD顺序的上游)，且质粒中的启动子已按常规方法删除。另一方面，由含启动子顺序的DNA中切掉一个能在下文所述接受体内表现有启动子活性的DNA片段，并根据需要用琼脂糖凝胶电泳法分离和提取之。然后，混合已被切割的质粒和DNA片段，如果粘性末端是相同的，即可用T4DNA连接酶将它们连接起来;如果它们的末端不同，则可用T4DNA聚合酶将其转变成平头，并用T4DNA连接酶连接之。这样便得到了所需的DNA。
在这种情况下，如果IMP脱氢酶基因之5′相邻区的一部分被连接到已被置换的启动子的5′上游，则将是有利的，因为此时在下文所述之接受体的染色体上重组后，发生了双交换型(doublecrossing-overtype)重组。
作为切割含IMP脱氢酶基因之质粒的限制性酶，可以使用任何一种在IMP脱氢酶基因的上游区只有一个切点的限制酶。具体地说，最好选择在IMP脱氢酶基因之启动子的5′上游区特别是在接近启动子的位置有一个酶切点，而不会在任何其他部位切断质粒的酶。另外，当插入不同的启动子时，可选用在IMP脱氢酶基因之开放读码和SP顺序的5′部分，并与之接近的位置，有一个酶切位点，而不会在任何其他部分切断质粒的酶。适用的酶包括AflⅡ、ApaⅠ、AxyⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、BstEⅡ、ClaⅠ、EcoRⅠ、Eco8lⅠ、HpaⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、MluⅠ、NcoⅠ、PstⅠ、SacⅠ、SacⅡ、SalⅠ、SmaⅠ、SphⅠ、SplⅠ、SspⅠ、StuⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ等。
对用于本发明的启动子没有特别地限制，只要它有一个能在用于继后步骤的接受体内表达的DNA顺序，不管其来源(即原核生物的、真核生物的或合成的DNA)如何，均可使用。这些启动子包括得自芽孢杆菌属细菌之染色体的、得自芽孢杆菌属细菌之噬菌体的、或得自能在芽孢杆菌属细菌细胞内自主复制之质粒的启动子，其可允许基因比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因有更强的表达(高表达)，或者使基因比芽胞杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因有更弱的表达(低表达)。更具体地说，高表达的启动子包括那些用Magasanik所述方法(Magasanik，B.，“MethodinEnzymology”，Vol.VI，PP.106-111，AcademicPress，NewYork，USA)，在每分钟，每毫克蛋白质形成1.5nmolXMP的情况下检测时，具有每分钟，每毫克蛋白质至少形成7.5nmolxMP的正常IMP脱氢酶活性的启动子。低表达的启动子包括那些于同样条件下检测时，具有每分钟，每毫克蛋白质至多形成0.5nmolXMP的IMP脱氢酶活性的启动子。其特定实例如下高表达的启动子AAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTATATACASPO1-15〔Lee，GAndPero，J.J.Mol.
Biol.，152，247(1981)〕AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAACSPO1-26〔Leeetal.，Mol.Gen.
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Natl.Acad.Sci.，USA，78，1336(1981)〕ATTAATGTTTGACAACTATTACAGAGTATGCTATAATGGTAGTATCφ29Al〔Yoshikawa，H.etal.，Proc.
Natl.Acad.Sci.，USA，78，1336(1981)〕TAATATCGTTGACATTATCCATGTCCGTTGTTAAGATAAACATGAAPuroperon〔Ebbole，D.J.andZalkin，H.，J.Biol.Chem.，262，8274(1987)〕
低表达的启动子AATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTVeg〔Moran，C.P.，Jr.etal.，Mol.
Gen.Genet.，186，339(1982)〕AAGTCTCCTTGAAATCAGAAGATATTTAGGATATATTTTTCTATGGtms〔Moran，C.P.，Jr.etal.，Mol.
Gen.Genet.，186，339(1982)〕AAAAACGGTTGCATTTAAATCTTACATATCTAATACTTTCAAAGACPenp〔Himeno，T.etal.，J.
Bacteriol.，168，1128(1986)〕CAGTAATATTGACTTTTAAAAAAGGATTGATTCTAATGAAGAAAGCcat〔Horinovichi，S.andWeisblum，B.，J.Bacteriol.，150，815(1982)〕AATTCCAAGTGTTAATATTCCTTAAAAAACATTTACTTCCATGGAAATGATGATAGATTAATTTTTAAGAAAAAGAACTGGTAATTCGCGAATTATGAAAAAGCGCTTTTTCTGCAPl〔K.Nakahamaetal.，Gene，36，179(1985)〕可由含有所说的启动子的DNA(质粒)上将其切下来，然后用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳法分级分离并回收之。另外，可使用市场上出售的DNA合成仪(如美国AppliedBiosystems公司制造的仪器)，依照磷酰胺方法合成有上述启动子的碱基顺序的DNA。
为了大量获得本发明的新DNA，然后用上述加有T4DNA连接酶的连接反应混合物转化需要黄嘌呤的宿主微生物，以得到转化体，其中，宿主微生物对黄嘌呤的需要通过取代的启动子的表达得到补偿。可按照已知方法，如“MolecularCloning”一书第86-93页中所述的方法，由转化体大量生产该DNA。
可按常规方法用限制酶切割上述方法制得的质粒，用琼脂糖凝胶电泳法分离，然后再用电泳洗脱等方法提取和分离，可从质粒中分离出含IMP脱氢酶基因(其中启动子已被置换)的DNA。
以下描述用新DNA转化接受体以衍生新微生物的方法。
作为进行这种转化的接受体，可使用任何一种微生物，在该微生物内可掺入某细胞外线性DNA并在其与该DNA的碱基顺序有高度同源性的染色体上发生部分重组，以改变其遗传性征，即任何具有这种转化能力的微生物均可使用。该微生物不一定与IMP脱氢酶基因的供体完全相同，而只要其染色体DNA的碱基顺序与上述线性DNA中所含有的IMP脱氢酶基因的碱基顺序高度同源即可。为制备有产生次黄苷和/或鸟苷之能力的转化体，从已知的观点看，芽孢杆菌属的细菌如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌等都是适用的，即它们可积聚两种或多种嘌呤核苷酸及其相关物质，如次黄苷、鸟苷和黄苷，它们具有转化的能力，没有致病性，并且长久以来已被安全地用于发酵工业中。
此外，在许多情况下，当为上述用作接受体的微生物提供适于积聚嘌呤核苷酸及其相关物质的一种或多种已知特性，如嘌呤类似物抗性(如8-氮杂鸟苷抗性)、核苷酸磷酸化酶缺陷、5′-鸟苷酸还原酶缺陷、叶酸拮抗物抗性时，可望获得进一步改善的效果。
芽孢杆菌属接受体的例子包括枯草芽杆菌BM1032(IFO14559，FERMBP-1242)枯草芽孢杆菌1A3(BGSC№1A3)枯草芽孢杆菌NA-6011(IFO14189，FERMBP-291)枯草芽孢杆菌NA-6012(IFO14190，FERMBP-292)枯草芽孢杆菌NA-6128(IFO14373，FERMBP-617)枯草芽孢杆菌NA-7821(IFO14368，FERMBP-618)枯草芽孢杆菌ATCC19221枯草芽孢杆菌ATCC14662短小芽孢杆菌(FERMP-2116)短小芽孢杆菌(FERMP-4832)短小芽孢杆菌(FERMP-4829)地衣芽孢杆菌IFO12485当用本发明的新DNA转化芽孢杆菌属微生物时，可使用在质粒中以整合形式存在的DNA。但一般说来，最好使用切割质粒或切下本发明的DNA后得到的线性DNA。
可按照已知方法〔C.AnagnostopoulosandJ.Spizien，J.Bacteriol.，81，741(1961)〕用该线性DNA片段转化芽孢杆菌属的微生物。
为了有效地得到本发明的转化体，可以预先切掉接受体IMP脱氢酶基因的全部或部分启动子，使之成为需要黄嘌呤的菌株。然后在不含黄嘌呤的琼脂平板上接种并培养之，即可由大量接受体微生物细胞中筛选出所需的转化体，因为用本发明的DNA转化的菌株已不再需要黄嘌呤。可用其中IMP脱氢酶基因的启动子和全部或部分开放读码已被删除的DNA转化接受体，并用复制平板法筛选需要黄嘌呤的菌株，以得到其中染色体上IMP脱氢酶基因的启动子和全部或部分开放读码被删除的突变株。可按照制备其中缺失启动子之DNA的同样方法，由含有IMP脱氢酶基因(其与接受体的IMP脱氢酶基因有高度同源性)和相邻区域的质粒中制得用于这一目的DNA，条件是用核酸外切酶进一步消化，以不仅缺失启动子，而且还切掉了全部或部分结构基因;或者是使用适当的限制性酶制备其中基因的启动子和开放读码均缺失的DNA。在这种情况下，最好适当选择核酸外切酶消化的条件，以尽可能多地缺失基因的启动子和开放读码，并尽可能多地保留相邻区域。在用限制性酶制备上述DNA时，所用的酶最好有一个能满足上述条件的酶切位点。另外，在制备这样的DNA时，可将下文所述的标志基因插入缺失的部分中，并利用该标志如药物抗性标志得到需要黄嘌呤的菌株。从而便很容易进行筛选，实际操作中也是很便利的。可参照欧洲专利公开273660A中所述的方法插入选择标志并收集转化体。用如此制得的需要黄嘌呤的菌株作为接受体并用本发明的DNA进行转化。然后将细胞悬浮液涂布于不含黄嘌呤的琼脂平板上，并从生长于平板上的菌落中得到本发明的新的微生物。
如下所述，如此得到的转化体是一种新的微生物。即，用适当的限制性酶切割转化体和用于转化之接受体的染色体DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳、用碱进行变性处理并转移到硝化纤维素滤器上。另外，用放射性核素分别标记含IMP脱氢酶基因的片段和含所用启动子的DNA片段。用它们作探针进行Southern杂交，并分析与各探针杂交所得片段的大小，以证实启动子已被交换。另外，也可测定转化体之染色体DNA上IMP脱氢酶基因内启动子区的DNA顺序，来进一步证实启动子的交换。当基于用本发明的DNA转化产生双交换型重组时，IMP脱氢酶基因的表达强度是不同的。而当用本发明的DNA造成单交换型重组时，除上述特征外，还表达了所用之标志物的特征。但其他一些特征则与接受体的特征相同。
下述实施例中制得的本发明转化体的典型例子包括枯草芽孢杆菌NA6242(IFO14867，FERMBP-2381，CCTCCM90018)枯草芽孢杆菌NA6243(IFO14868，FERMBP-2382，CCTCCM90019)其中IFO号是根据布达佩斯条约规定在InstituteforFermentation，Osaka的保藏登记号.FERMBP号是在FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustralScienceandTechnology(FRI)的保藏登记号。各转化体已于1989年4月3日保藏在IFO，于1989年4月12日保藏在FRI。
当然，经适当地选择启动子和接受体细胞，可很容易地按本文所述的方法制得不同的转化体。
可用生产次黄苷和/或鸟苷的常规发酵方法，使用本发明制得的转化体生产次黄苷和/或鸟苷。
为此，可使用含有碳源、氮源、金属离子，及必要时还含有氨基酸、核酸、维生素等其他营养素的培养基。作为碳源，可使用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖化淀粉及糖蜜等。它们可以单独或联合使用。作为氮源，除使用蛋白胨、大豆粉、干酵母、尿素等有机氮源外，还可单独或联合使用硫酸、硝酸、盐酸、碳酸等的铵盐、及气态氨、氨水等无机氮源。作为其他营养素，可适当选择并单独或结合使用微生物生长所必需的无机盐、氨基酸和维生素等。作为腺嘌呤源，可使用腺嘌呤、腺苷和腺苷酸及含有它们或其提取物的微生物细胞。
另外，必要时可向培养基内加入硅油、聚二醇醚等消泡剂，以及表面活性剂等。
一般可在需氧条件如通气深层培养条件下进行培养。培养基的PH值最好在4-9范围内。当培养期间PH发生变化时，可向其中加入硫酸、碳酸钙、氢氧化钠、气态氨、氨水等，以将PH调到上述范围。一般可在20至45℃的范围内选择最适培养温度，所选择的温度应适于使用的特定微生物的生长和次黄苷和/或鸟苷的积聚。当次黄苷和/或鸟苷的积聚量达到最大时即可停止培养。一般说来，培养24至144小时可获得理想的结果。
可使用已知的方法如沉淀法由培养物中分离次黄苷和/或鸟苷，并使用层析法等分离和纯化之(如使用离子交换树脂、活性碳等)。
按照本发明的方法，可以增加次黄苷或鸟苷(为生产重要的香味成分5′-次黄苷酸或5′-鸟苷酸的原料)的积聚比率，并可在工业上实现其高产率生产。
即是说，使用能够产生次黄苷或鸟苷的芽孢杆菌属微生物作为接受体并用本发明的DNA去转化它，可得到有高度生产鸟苷能力的新微生物。因为有高表达之启动子的IMP脱氢酶基因已被整合到该新微生物的染色体上，故可很稳定地反复生产鸟苷。另外，按照本发明的方法，也可使用能产生次黄苷和鸟苷，或次黄苷和黄苷、或黄苷和/或鸟苷的芽孢杆菌微生物作为接受体，并用本发明的其他DNA转化之，得到有高度生产次黄苷能力的新微生物。因后一株新的微生物染色体上的IMP脱氢酶基因的启动子是经过修变的，故可很稳定地反复生产次黄苷。
下述参考实施例和实施例旨在进一步详细阐述本发明，而不构成对本发明之范围的限制。
在下列参考实施例和实施例中，使用的所有限制性酶(均由NipponGeneCo.，Ltd.，Japan生产)和修饰酶用量均为每微克DNA5单位。除特别指出者外，反应条件均如厂商提供的使用说明书所述。
参考实施例1含枯草芽孢杆菌IMP脱氢酶基因之质粒pEX117的分离按照“MolecularCloning”一书第86-93页中所述的方法，由含有该质粒的重组体，即大肠杆菌TEX117(日本专利公开60-156388号)中提取含有得自枯草芽孢杆菌NA6012(IFO14190，FERMBP-292)之IMP脱氢酶基因区的重组质粒pEX117。即将大肠杆菌TEX117接种在LB培养基(含细菌用胰化胨10g/升，酵母浸膏5g/升，氯化钠5g/升)上并向其中加入140μg/ml氯霉素以扩增该质粒。培养过夜后，收集并洗涤细胞。向洗过的细胞中加入溶菌酶，再加0.2N含1%十二烷基硫酸钠的氢氧化钠溶液以使细胞溶解。加入5M乙酸钾后，离心得到含质粒的上清液。向该上清液内加入0.6体积的异丙醇以沉淀质粒DNA，用乙醇洗涤后将其溶解在TE缓冲液(10mMTris-HCl缓冲液-1mMEDTA，pH8.0)。向该溶液内加入氯化铯使其比重达到1.60，再加入溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓至终浓度为600μg/ml。于20℃下，以50，000rpm离心该混合物(超离心，转子V65Ti)，然后用紫外光检测质粒的沉淀带并收集之。用正丁醇除去溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓后，将其对TE缓冲液透析，由300ml培养液中得到约200μg重组质粒pEX117。
用不同的限制性酶切割pEX117，基于HindⅢ消化的λ噬菌体DNA的分子量作出琼脂糖凝胶电泳图谱，并由之得到如图1所示的限制性酶切图。
pEX117为一重组质粒，其中在pBR322的PstⅠ位点内插入了一个约6.4千碱基对(Kbp)的DNA片段。
实施例1其中IMP脱氢酶基因之一部分启动子顺序被SPOl取代的新DNA的制备1-i)IMP脱氢酶基因的再克隆用XbaⅠ和HincⅡ双重消化pE117(3μg)，同时用XbaⅠ和HincⅡ双重消化pUC119(1μg)。将它们混合后向混合物内加入1/2体积的7.5M乙酸铵。再加入乙醇达终浓度为70%，以沉淀DNA。离心后，将DNA溶解于TE缓冲液(5μl)中并用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Japan)使之彼此连接。用该反应混合物的一部分(5μl)转化大肠杆菌X895(IFO 14308，FERMP-7411，需要黄嘌呤的菌株)并将细胞悬液涂布于含氨苄青霉素(25μg/ml)的M-9CATA培养基(每升含Na2HPO46g、KH2PO43g、NaCl0.5g、NH4Cl 1g、MgSO41mM、CaCl21mM、葡萄糖2g、酪蛋白氨基酸2g、色氨酸50mg腺嘌呤50μg、琼脂15g，PH7.2)上。37℃保温1天后，按照常规方法由生长于平板上的转化体中提取质粒并定名为pEX214。按照S.N.Cohen等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕的方法进行转化。然后按参考实施例1中所述的同样方法大量制备DNA，由1升培养液中约制得1300μgDNA。
质粒pEX214的构建如图1中所示。
1-ⅱ)pEX214中所含IMP脱氢酶基因之DNA顺序的测定按照N.Poncz等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，4298(1982)〕所述的方法，制备缺失pEX214之XbaⅠ-HincⅡ片段的DNA片段，并按Sanger方法测定其碱基顺序。为实现Sanger氏方法，其中使用了SEQUENASE(由UnitedStatedBiochemicalCorp.USA制造，并按厂商推荐的方法使用之)。
其碱基顺序测定结果如图2所示。
1-ⅲ)IMP脱氢酶基因之启动子的缺失用XbaⅠ切割pEX214(10μg)后，用乙醇沉淀法回收DNA并溶解于TE缓冲液(10μl)中。然后加入缓冲液、水和BAL31(0.2U)使反应混合物体积达到50μl并于30℃保温。每隔1分钟取出7μl反应混合物并向各等份内加入TE缓冲液饱和的苯酚(7μl)。用乙醇沉淀法由该溶液中回收DNA并溶解于TE缓冲液(5μl)中。然后，用T4DNA聚合酶将结合端转变成平头。向如此得到的7份DNA溶液中分别加入PstⅠ，消化后进行琼脂糖凝胶电泳。切下含有相当于电泳分离约为1.7kbp(1.6至1.75kbp)之DNA的琼脂，并用电洗脱器(由IBICorp.USA制造)由琼脂回收该DNA片段。这个片段是用BAL31由1分钟反应的样品中得到的。
另一方面，按照同样方法用SmaⅠ和PstⅠ双消化pUC119(1μg)，并回收约相当于3.2kbp的DNA片段。
混合上述两片段，用连接试剂盒连接之，并用于转化大肠杆菌JM109。将细胞悬液铺敷在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37℃下保温1天并收集生长于平板上的12个转化体。按照上面1-ⅱ)中所述的同样方法，检查各转化体内所含质粒上被插入部分的碱基顺序，以选择其中缺失了-35区的质粒pEX214△3。
图3中显示了pEX214△3的构建及其碱基顺序的测定。
1-ⅳ)将1MP脱氢酶基因的5′相邻区插入pEX214△3用SmaⅠ和XbaⅠ双重消化pEX117(5μg)。用SspⅠ切割pEX214(20μg)。分别用琼脂糖凝胶电泳法分级分离后，由前者中回收1.45kbp片段(约1μg)并由后者中回收1.2kbp片段(约4μg)。进一步用XbaⅠ切割1.2kbp的SspⅠ片段并按同样方法分析分离以回收0.1kbp的片段(约0.2μg)。另一方面，用EcoRⅠ切割pEX214△3(1μg)后，按“MolecularCloning”第395页所述的方法，用T4DNA聚合酶将粘性末端转变成平端。向其中加入上面回收的1.45kbp(1μg)和0.1kbp(0.2μg)部分，并用连接反应试剂盒连接这三个片段。然后使用部分连接反应混合物(5μl)转化大肠杆菌X895菌株。由生长于含氨苄青霉素之LB琼脂平板上的转化体中提取质粒并定名为pEX241。
图4中显示了pEX241的构建程序。
1-ⅴ)将SPO-1启动子连接到pEX241上用EcoRⅠ切割含SPO1-26启动子的质粒pSPO1-26(10μg)，然后用琼脂糖凝胶电泳法分级分离以回收约0.1kbp的DNA片段，并将其溶解于TE缓冲液(5μl)中。另一方面，用KpnⅠ切割pEX241(1μg)并与上述0.1Kbp片段混合。然后用T4DNA聚合酶将粘性末端转变成平端。用连接反应试剂盒连接并用以转化大肠杆菌X895菌株。将转化反应混合物涂布于含有氨苄青霉素的M-9CATA琼脂平板上、并由生长于平板上的菌落中得到大肠杆菌TF242(IFO14864，FERMBP-2378，CCTCCM90015)转化株。按照参考实施例1中所述的同样方法，由培养液中得到质粒(约1，200μg)并定名为pEX242。用PvuⅠ和PstⅠ双重消化质粒pEX242(50μg)。经琼脂糖凝胶电泳分级分离后，回收2.9kbp片段(产率约7μg)。
图5中显示了pEX242的构建程序。
实施例22-ⅰ)含有其中缺失大部分IMP脱氢酶基因的DNA之质粒的制备用XbaⅠ和MluⅠ双重消化pEX117(5μg)。以琼脂糖凝胶电泳法分级分离后回收7.0Kbp和3.8Kbp的片段。进一步用NruⅠ消化3.8Kbp片段得到NruⅠ-MluⅠ部分。另一方面，按照实施例1中所述的同样方法，由pEX214中制得XbaⅠ-SspⅠ片段(0.1Kbp)。
然后，用ClaⅠ消化pC194(5μg)得到1.7Kbp的ClaⅠ片段。再用MspⅠ和MboⅠ双重消化该片段，得到一个含有氯霉素乙酰转移酶基因的1.05Kbp片段。用T4DNA聚合酶将该片段的粘性末端填成平头。
然后以上述方法制得4个其量分别为0.5μg、0.5μg、0.1μg和0.2μg的下列片段7.0Kbp的XbaⅠ-MluⅠ片段、2.2Kbp的NruⅠ-MluⅠ片段、0.1Kbp的XbaⅠ-SspⅠ片段、1.05Kbp的MspⅠ-MboⅠ片段(两端均填成平头)。混合这些片段并用连接反应试剂盒连接之。用该反应混合物的一部分转化大肠杆菌C600，并将细胞悬液涂布于含氯霉素(10μg/ml)和四环素(12.5μg/ml)的LB琼脂平板上。37℃保温1天后，按常规方法由生长于平板上的菌株中提取质粒并定名为pEX210。
图6显示了pEX210的构建程序。
2-ⅱ)染色体上缺失大部分IMP脱氢酶基因之转化体的衍化用PstⅠ切割质粒pEX210(50μg)，并按照实施例1-ⅴ)中所述的方法分离和回收7.0Kbp的片段。将该片段(1μg)加到按C.Anagnostopoulos和J.Spizizen〔J.Bacteriol.，81，741(1961)〕所述方法制备的枯草芽孢杆菌NA6128(IFO14373，FERMBP-617)的感受态细胞悬液(1ml)中。37℃下振荡培养1小时后，将培养物铺敷在含有氯霉素(10μg/ml)的LB琼脂平板上并于37℃下保温1天。收集所得转化体并定名为枯草芽孢杆菌NA6210(IFO14866，FERMBP-2380，CCTCCM90017)。将该微生物菌株接种在M-9CATA琼脂平板和含有黄嘌呤(50μg/ml)的M-9CATA琼脂平板上，然后观察在两培养基上的生长情况。结果发现，该菌株在前一平板上没有生长，而只在后一平板上生长。由此可见，NA6210菌株已变成了需要黄嘌呤的菌株。
2-ⅲ)携带IMP脱氢酶基因之转化体的衍化其中所说基因的启动子被SPO1-26启动子所取代制备枯草芽孢杆菌NA6210菌株的感受态细胞，并向其悬液(1ml)内加入实施例1-ⅴ)中制得的pEX242的PvuⅠ-PstⅠ片段(2.9Kbp，1μg)。将混合物于37℃下振荡1小时。然后将细胞悬液涂布于M-9CATA琼脂平板上并于37℃保温1天。收集在平板上生长的菌落，得到枯草芽孢杆菌NA6242菌株(IFO12485，FERMBP-2381)。观察该菌株在LB琼脂平板和含氯霉素(10μg/ml)之LB琼脂平板上的生长情况。结果发现，其可在前一平板上生长，但在后一平板上则不生长。可见，该菌株是对氯霉素敏感的，但其起始菌株即NA6210菌株是对氯霉素有抗性的。
2-ⅳ)枯草芽孢杆菌NA6128和NA6242之IMP脱氢酶活性的比较用Magasanik所述的方法检测枯草芽孢杆菌NA6242的IMP脱氢酶活性时，结果为每分钟每毫克蛋白中生成了13mmolXMP。另一方面，按同样方法检测枯草芽孢杆菌NA6128的IMP脱氢酶活性，则结果为每分钟每毫克蛋白中生成了1.5nmolXMP。可见，由于置换了启动子，其酶促活性提高了约8.7倍。
实施例3由枯草芽孢杆菌NA6242生产鸟苷在含有种子菌培养基(20ml，如表1所示)的200ml体积Erlenmeyer培养瓶内接种一铂金耳枯草芽孢杆菌NA6242，并于37℃下振荡培养18小时。取其1ml培养物接种在含主发酵培养基(20ml，如表1所示)的200ml有皱褶的培养瓶内，并于37℃下旋转振荡培养84小时。培养结束后，用高效液相层析法测定其中积聚的鸟苷量。结果发现，其中积聚了24.0mg/ml鸟苷。如按同样方法培养枯草芽孢杆菌NA6128时，则只积聚8.0mg/ml鸟苷。
表1浓度(g/升)培养基成分种子菌培养基发酵培养基葡萄糖30120谷氨酸钠1010硫酸铵-20尿素310玉米浆2020硫酸镁22腺嘌呤0.20.075磷酸氢二钾21-氯化钾-0.5氯化钙25硫酸锰-0.0025碳酸钙-30PH7.06.8实施例4p1启动子插入pEX241中由按照日本专利公开№60-137291中所述方法制备的含P1启动子的质粒pBTM128中切下含P1启动子的DNA片段，并按照实施例1-ⅴ)中所述的同样方法连接到pEX241中。即，先用EcoRⅠ和PstⅠ双重消化PBTM128(10μg)，经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收长约0.1Kbp的DNA片段，并将其溶解在TE缓冲液(5μl)中。另一方面，用KpnⅠ切割pEX241(1μg)并与上述的0.1Kbp片段混合。用T4DNA聚合酶将粘性末端填成平头，然后用连接反应试剂盒连接两片段并用以转化大肠杆菌X895。将细胞悬液涂布于A-9CATA琼脂平板上，于37℃保温过夜。由平板上形成的一个菌落分离得到转化体大肠杆菌TF243(IFO14865，FERMBP-2379，CCTCCM90016)。按照参考实施例1所述的同样方法，由1升培养液中提取到约1，200μg质粒，并定名为pEX243。用PvuⅠ和PstⅠ双重消化pEX243，经琼脂糖凝胶电泳分级分离后回收2.9Kbp的片段，得到约7μgDNA。
实施例5携带IMP脱氢酶基因之转化体的衍生其中所说基因的启动子被P1启动子所取代按实施例2所述方法制备枯草芽孢杆菌NA-6210的感受态细胞，向其中加入实施例4中制得的pEX243的PvuⅠ-PstⅠ片段(2.9Kbp，7μg)，并按实施例2-ⅲ)中所述的同样方法进行转化。将细胞悬液涂布于M-9CATA琼脂平板上，并由所形成的菌落中得到转化体枯草芽孢杆菌NA6243(IFO14868，FERMBP-2382，CCTCCM90019)。按照实施例2-ⅲ)中所述方法检查该菌株，发现它是对氯霉素敏感的菌株。
按实施例2-ⅳ)中所述方法检测枯草芽孢杆菌NA6243菌株的IMP脱氢酶活性时，该活性值为0.5nmol已生成的XMP/分钟、毫克蛋白质，可见，由于置换了启动子，使酶促活性约降低1/3。
实施例6由枯草芽孢杆菌NA6243生产次黄苷在含有表1所示种子菌培养基(20μl)的200ml体积Erlenmeyer培养瓶内接种一铂金耳枯草芽孢杆菌NA6243，并于37℃下振荡培养18小时。取1ml培养物接种于含表1所述主发酵培养基(20ml)的200ml体积有皱褶的培养瓶内，并于37℃下旋转振荡培养84小时。发酵结束后按实施例3中所述的同样方法测定积聚的次黄苷和鸟苷量，测得次黄苷量为27.0mg/ml，鸟苷量为3.0mg/ml。而按同样方法培养枯草芽孢杆菌NA6128时，则只聚积22.0mg/ml次黄苷和8.0mg/ml鸟苷。
权利要求
1.含有枯草杆菌属微生物之染色体中IMP脱氢酶基因的DNA，特征在于其中IMP脱氢酶基因的启动子被不同的可表达启动子取代。
2.根据权利要求1的DNA，其中不同的启动子是选自于一组由芽孢杆菌属细菌染色体的质粒、衍生于芽孢杆菌属细菌之噬菌体的质粒、以及能在芽孢杆菌属细菌内自主生长的质粒中得到的启动子。
3.根据权利要求1的DNA，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子取代，后者可比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更强。
4.根据权利要求1的DNA，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子取代，后者可比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更弱。
5.与含有芽孢杆菌属微生物染色体之IMP脱氢酶基因的DNA整合的载体，其中IMP脱氢酶基因的启动子被一不同的可表达启动子所取代。
6.根据权利要求5的载体，其中该不同的启动子选自于一组由芽孢杆菌属细菌染色体的质粒、衍生于芽孢杆菌属细菌之噬菌体的质粒、以及能在芽孢杆菌属细菌内自主生长的质粒中得到的启动子。
7.根据权利要求5的载体，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子取代，后者可比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更强。
8.根据权利要求5的载体，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子所取代，后者可比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更弱。
9.带有某一基因的芽孢，杆菌属微生物，其中芽孢杆菌属微生物之染色体上基因的启动子在其染色体上被一不同的可表达启动子取代。
10.根据权利要求9的可产生次黄苷和/或鸟苷的芽孢杆菌属微生物，其为用含有芽孢杆菌属微生物之染色体上IMP脱氢酶基因的DNA转化的，其中IMP脱氢酶基因的启动子被一不同的可表达启动子或整合了该DNA的载体所取代。
11.根据权利要求10的微生物，其中不同的启动子选自于一组由芽孢、杆菌属细菌染色体的质粒、衍生于芽孢杆菌属细菌之噬菌体的质粒、以及能在芽孢杆菌属细菌内自主生长的质粒中得到的启动子。
12.根据权利要求10的微生物，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子所取代，后者可比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更强。
13.根据权利要求10的微生物，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子所取代，后者可比芽杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更弱。
14.一种生产次黄苷和/或鸟苷的方法，该方法包括在培养基中培养能够产生次黄苷和/或鸟苷的芽孢杆菌属微生物，该微生物是用含有芽孢杆菌属微生物染色体上IMP脱氢酶基因的DNA转化的，其中IMP脱氢酶基因的启动子被一不同的可表达启动子或整合了该DNA的载体所取代，以产生和积聚次黄苷和/或鸟苷并收集所得产物。
15.根据权利要求14的方法，其中不同的启动子选自一组由芽孢杆菌属细菌染色体的质粒、衍生于芽孢杆菌属细菌之噬菌体的质粒、以及能在芽孢杆菌属细菌内自主生长的质粒中得到的启动子。
16.根据权利要求14的方法，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子所取代，后者可比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更强。
17.根据权利要求14的方法，其中IMP脱氢酶基因的启动子被某一启动子取代，后者可比芽孢杆菌属微生物之染色体上的IMP脱氢酶基因表达更弱。
全文摘要
本发明公开了含有芽孢杆菌属微生物之染色体的IMP脱氢酸基因的DNA，其中IMP脱氢酶基因的启动子被一个不同的可表达启动子所取代。还公开了整合了该DNA载本、能用上述DNA或载体转化了的、产生次黄苷和/或鸟苷的芽孢杆菌属微生物、以及生产次黄苷和/或鸟苷的方法，该方法包括在培养基中培养所说的芽孢杆菌属微生物以产生并积聚次黄苷和/或鸟苷，并收集所得产物。
文档编号C12N15/75GK1046558SQ9010219
公开日1990年10月31日 申请日期1990年4月18日 优先权日1989年4月19日
发明者宫川権一郎, 神崎直之, 长谷川建夫 申请人:武田药品工业株式会社