专利名称：使用拉曼散射测量酶反应的方法
技术领域：
本发明涉及对酶反应中特异酶之靶底物的定性测量和定量测量，以及测量酶活性的方法。
已实施了一些方法以作为测量酶反应的方法，如果酶反应是可产生过氧化氢的反应系统，则下列方法是本技术领域中已知的，例如(1)使用过氧化氢电极的方法此方法适于测量电流的变化，电流变化的起因是当过氧化氢被电氧化时，因此通过还原共存于样品溶液中的物质产生电感应。
(2)Leuco或氧化缩合型分光光度测定法(参见日本专利公开公报No.59-182361(1984)，典型地，此仪器适于过氧化氢与4-氨基安替比林和酚反应以产生颜色，并在505nm下测量显色反应溶液的光吸收值。在Leuco型分光光度计中，由于色素原的自然氧化导致空白试剂显色容易引起错误。另一方面，在氧化缩合型分光光度测定法中，还原性物质易导致假阴性。另外，需要2mol过氧化氢才能产生1mol色素，因此该方法不适于测定量少的成分。
(3)荧光法，它适于过氧化氢与高香草酸反应以产生荧光并测量荧光。在荧光法中，敏感性显著依赖于仪器的性能。因此该方法受温度和共存物质的影响极大。
(4)化学发光法，适于在催化剂，如POD(过氧化物酶)存在的条件下通过氧化过氧化氢的能量激发鲁米诺或光泽精的底物，并检测底物由激发态返回至基态时所发出的光。在化学发光法中，仅在碱性条件下可得到足够量的光发射，反应速度缓慢且可重复性差。另外，当有蛋白质共存时，光发射的强度有所降低。
另一方面，被称为拉曼散射分析的方法，属于光学分析法。这种拉曼散射分析法利用下列现象当特定的分子被电磁波形式的辐射能量照射时，小部分携有光子的分子不返回到原始振动水平，而是在释放了所携光子之后，下降到具有不同电子基态的水平。因此，由这些分子释放的能量水平也是特异性的，通过检测以电磁波形式释放的能量水平可鉴定该特异性分子。
尽管由拉曼散射释放的能量射线可以处于低于(Stokes拉曼散射)或高于(antistokes拉曼散射)所吸收的能量的状态，但由于处于激发态的电子数目比处于基态的电子数目要少得多，因此antistokes担曼散射的强度非常微弱。因此，鉴定特异性分子的方法通常使用stoke拉曼散射进行测量。
通过拉曼散射测量酶反应的例子尚未见有报道。
本发明的目的是能够定性测量或定量测量酶反应的底物，或测量酶的活性。
在由发明人完成的铁氰离子拉曼散射测量中，当含有某种酶的靶底物和铁氰离子的样品溶液被单一波长的激发射线照射时，仅能观察到极其微弱的拉曼散射。然而，本发明人已发现了这样一种现象，即加入酶之前的样品溶液，其拉曼散射光谱的一些峰当样品溶液中加入酶以导致酶反应时，随着酶反应的展开此峰会增强，通过增强的拉曼散射峰即可进行酶反应的定性测量、定量测量或酶活性的测量。
在根据本发明的测量酶靶底物存在与否的定性测量法中，向已加入铁氰离子的样品溶液中加入酶，在加入酶之前和之后用单一波长的激发射线照射样品溶液，以使样品溶液的散射光能被接收并按其光谱成分分开，酶靶底物存在与否的测量取决于加入酶之后样品溶液的拉曼散射光谱是否包括加入酶之前样品溶液的拉曼散射光谱的增强峰。
在根据本发明的为得到底物浓度的定量测量法中，向含有已知浓度靶底物的标准样品溶液中加入恒定浓度的铁氰离子和恒定单位的酶以导致酶反应，用单一波长的激发射线照射标准样品溶液以接收来自标准样品溶液的散射光并将散射光按光谱成分分开，对多种靶底物浓度不同的标准样品溶液由标准样品溶液拉曼散射光谱增强峰的峰强度值随时间的改变测量反应速度，以形成可显示靶底物浓度和反应速度之间关系的校准曲线。在含有未知浓度靶底物的测量样品溶液中加入与形成校准曲线的测量中所用的那些浓度相同、单位相同的铁氰离子和酶，用与上述类似的激发射线照射待测样品溶液，以由拉曼散射峰(与形成校准曲线所用的那些相同)的峰强度值随时间的改变测量反应速度，根据校准曲线即可得到测量样品溶液的底物浓度。
在根据本发明的为得到酶活性的酶活性测量法中，在含有已知浓度靶底物的样品溶液中加入恒定浓度的铁氰离子和恒定单位的酶以导致酶反应，用单一波长的激发射线照射样品溶液以使标准样品溶液的散射光能被接收并按其光谱成分分开，由酶反应前样品溶液拉曼散射光谱增强峰的峰强度随时间的改变测量反应速度，根据反应速度即可得到酶活性。
图1A和图1B显示了底物为葡萄糖，酶为葡萄糖氧化酶的酶反应系统中铁氰离子拉曼散射光谱的变化。图1A显示了通过在含有葡萄糖的反应溶液中加入铁氰离子测量的铁氰离子拉曼光谱。在此反应系统中，仅观察到铁氰离子极其微弱的拉曼散射。
另一方面，图1B显示了向含有葡萄糖和铁氰离子的图1A反应溶液中加入用作酶的葡萄糖氧化酶(GOD)几分钟后测量的拉曼散射光谱。此光谱包括一些峰，其中从加入酶之前的反应溶液的拉曼散射光谱中观察到的一些峰得到增强。
图2A和图2B显示了其它酶反应系统中铁氰离子拉曼散射光谱的变化。图2A显示了在含有乳酸作为底物的反应溶液中加入铁氰离子并测量其拉曼散射光谱的结果，与图1A类似，仅观察到铁氰离子微弱的拉曼散射峰。
另一方面，图2B显示了通过在含有乳酸和铁氰离子的图2A反应溶液中加入作为酶的乳酸氧化酶(LOD)并在间隔几分钟后进行测量所得的拉曼散射光谱。此拉曼散射光谱也包括峰，其中从加入酶之前的反应溶液的拉曼散射光谱中观察到的一些峰得到增强。
将图1B和图2B的光谱互相比较，增强的拉曼散射峰出现于相同的转变波数处，这表明这些光谱的峰是相同物质的拉曼散射光谱，尽管酶反应系统彼此不同。应理解尽管仍未阐明酶反应的进行是如何影响铁氰离子的，但不论酶反应的类型如何都会产生同样的影响，其铁氰离子受酶反应影响且峰强度水平有所增强的拉曼散射峰存在于与激发波长有关的转变波数的1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1和2450至2580cm-1处。峰位置的具体例子是1574cm-1，1658cm-1，1872cm-1，2012cm-1，2081cm-1，2142cm-1，2374cm-1，2464cm-1，2562cm-1等等。
根据本发明，进行定性测量所根据的事实是酶反应由这些拉曼散射峰的增强引起，即酶的靶底物存在于样品溶液中，通过这些拉曼散射峰中的任何一个可进行定量测量。另外，通过测量增强这些峰中任何一个的速度即可测量酶活性。
酶具有底物特异性和仅导致与特异性物质(靶底物)有关的某个反应的反应特异性。当导致酶反应时，在反应的起始阶段，其反应产物以恒定的速度产生，然后在下文作为实施例描述的图4所具体阐明的阶段中反应速度逐渐降低。下面等式(1)(称为Michaelis-Nenten等式)，确立了酶反应的起始阶段反应速度VO(反应速度的最大值)和底物浓度[S]之间的关系VO＝(Vmax·[S])/([S]＋Km)(1)其中Vmax表示最大反应速度，Km被称作Michaelis常数，图3(A)显示了此等式。Michmelis常数Km为相应于底物浓度[S]的值，[S]是当反应速度VO为Vmax/2时得到的，最大反应速度Vmax和Michaelis常数Km提供了酶活性。
可以画出图3(A)所示的图象，经过改变底物浓度[S]而保持酶浓度不变并测量反应速度VO，可估算最大反应速度Vmax并得到Michaelis常数Km。
最大反应速度Vmax是一渐近值，从图3A的图中不能正确地得到此值。已知使用Lineweaver-Burk作图的方法可作为实验得到Michaelis常数Km的方法。如下所述将等式(1)的两边取倒数
1/VO＝(Km/Vmax)(1/[S])＋(1/Vmax)(2)等式(2)可表示为图3B所示的横坐标轴为1/[S]，纵坐标轴为1/VO的线性表示形式，而通过显示在与底物浓度[S]有关的图3B图中实验得到的VO可实验得到Km和Vmax。
根据本发明，如上文所述，在酶反应系统中加入铁氰离子以得到拉曼散射峰增加速度的最大值VO，此峰增强的原因是铁氰离子受酶反应的影响，根据最大值VO和底物浓度[S]之间的等式(1)或(2)可得到酶活性。
本发明并不局限于上文所阐述的酶反应。本发明也适用于氧化还原酶的酶反应，如吡喃糖氧化酶、胆红素氧化酶、胆甾醇氧化酶和多酚氧化酶以及其它类型的那些酶。
根据本发明，通过测量拉曼散射光即可进行底物的定性测量或定量测量，或进行酶活性的测量，此散射光通过受酶反应影响的铁氯离子而增强，而经简单的光学测量法即可测量酶反应。
联系附图从下文对本发明的详细描述中可更明显地看出本发明的上述和其它目的、特征、方面和优点。
图1A和图1B分别阐明了在葡萄糖/葡萄糖氧化酶反应系统中酶反应之前和之后来自铁氰离子的拉曼散射光谱；图2A和图2B分别阐明了在乳酸/乳酸氧化酶反应系统中酶反应之前和之后来自铁氰离子的拉曼散射光谱；图3A和图3B分别显示与酶反应速度相关的Michaelis-Menten等式和Lineweaver-Burk作图法；
图4阐明了在2081cm-1的转变波数处，被酶反应增强的峰随时间的变化；图5阐明了在2081cm-1的转变波数处，具有不同葡萄糖浓度的有关标准样品溶液的峰随时间的变化；图6显示了根据图5所示的测量结果形成的葡萄糖浓度校准曲线；图7是显示进行本发明的典型测量装置的方块图；和图8A和图8B分别是显示吸取180°增强散射和90°增强散射的元件部分的剖面图。
在石英散射光元件中引入250μl用作底物的葡萄糖溶液(100mg/d1)，14.5μ用作酶的葡萄糖氧化酶以及250μl铁氰化钾溶液(0.5M)，用磷酸缓冲溶液调节PH至7.4以制备样品溶液，依次将它们维持在25℃并使之反应。He-Ne激光束作为激发射线被投射到反应溶液上，其散射光按光谱成分分开以每隔10秒钟测量一次在激发射线波长的2081cm-1波数周围转变位置处峰的增长，结果以符号＂a＂示于图4。
当反应开始时，起始阶段的峰强度基本上呈线性增长，然后增长速度有所降低。测量峰强度在起始阶段呈线性增长的反应速度VO。
类似地，图4显示了在底物为乳酸，酶为乳酸氧化酶的反应系统中加入铁氰化钾以导致反应并测量2081cm-1转变波数处相同峰的改变所得的结果，此结果以符号＂b＂表示。
至于反应溶液，其中每份铁氰化钾溶液(0.5M)的量定为恒定值250μl，每份葡萄糖氧化酶的浓度定为恒定值14.5μ，每份葡萄糖底物的量定为恒定值250μl，而葡萄糖浓度可在250mg/dl，125mg/dl、100mg/dl、80mg/dl和50mg/dl中变化，图5显示了每隔10秒钟测量在光散射光谱的2081cm-1转变波数处的峰的强度变化所获得的结果。
图6表示在从图5的结果所获得的各葡萄糖浓度下的反应速度最大值和葡萄糖浓度之间的相关性结果。图6用作为获得测量样品溶液的未知葡萄糖浓度的校准曲线。
为了对具有未知葡萄糖浓度的测量样品进行定量测量，类似于形成校准曲线的情况，向250μl的测量样品溶液中加入250ml铁氰化钾溶液(0.5M)和14.5U葡萄糖氧化酶，混和物调节至pH7.4，样品温度保持在25℃，以便例如能根据诸如2081cm-1的转变波数处的峰等的规定峰的强度变化测量反应速度的最大值。通过将测出的反应速度最大值用于图6的校准曲线即可得到底物的葡萄糖浓度。
图7阐明了测量本发明拉曼散射光的典型装置，数1表示激发光源，例如它可由激光装置形成以测量拉曼散射光。可由进行连续振动的Ar离子激光，Kr离子激光、He-Ne激光、He-Cd激光或NdYAG激光，或者脉冲激光制备的激光装置可选自越过紫外区附近和红外区附近的宽波长范围的激光。除激光装置外也可使用卤素灯或其类似物作为光源，这里假定将He-Ne激光用作光源1。数2表示控制光源1输出的能源装置。
数4表示带通滤光器，它适用于从激光束12上切割边带，激光束12是从光源1振荡出的。激光束12被分成样品侧面的激发射线12s和参照侧面的参照射线12r，以致穿过波段通过的滤光器7以切割由半镜5产生的波长射线，再通过透镜9即可使激发射线12s集中并投射到元件3上。
元件3是石英管状散射光元件，它含有反应溶液，例如可将它维持在恒定温度25℃。镜11a被放置于激发射线12s的投射方向以便能增强由元件3所含反应溶液产生的散射光，从而使激发射线12s穿过元件3被传送，然后被镜11a反射又重新投射到元件3上，因此增强了拉曼散射。另一个镜11b被放置于上激发射线12s的投射方向呈90°的方向以将激发射线反射到分光镜22上，由元件3发出的散射光与激发射线以及被镜11b反射的激发射线一起被集中透镜16和20集中，并穿过滤光器21被分光镜22集中。滤光器21适于切割激发光成分以仅将散射光成分引入分光镜22中。分光镜22和检测器23由多波道检测系统形成，此系统中有多色器，其中沿着分光镜22的色散方向放置了多个检测元件。数24表示检测器控制部分以将各个波长的输出信号与多波道检测器23分开。
分光镜22可任选地由校验分光镜制备，而检测器23可由含有单个检测元件的检测器制备。在这种情况下就需要分光镜控制部分25以校验分光镜22的波长。
另一方面，穿过半镜5从激发射线12s分离的参照射线12r穿过镜6弯向检测器30，12r先穿过波段通过的滤光器8以切割由镜6产生的波长射线再投射到检测器30上，以检测光源强度。处理数据的运算/输出部处理数据的运算/输出部分31用显示光源强度的参照射线侧面检测器30的检测值校正了由分光镜22和检测器23发出的拉曼散射光的检测值以得到拉曼散射光谱，因此从特异峰的强度变化可计算出反应速度的最大值并将此值输出。当进行定量测量时，处理数据的运算/输出部分31含有以前测量所形成的校准曲线资料，由根据校准曲线测量未知样品所得的反应速度最大值计算出底物浓度以输出之。当分光镜22进行波长校验时，处理数据的计算/输出部分31穿过分光镜控制部分25进行波长校验。
图8A和8B显示了通过激发射线进一步有效增强拉曼散射的典型元件。
参见图8A，元件3a为圆底烧瓶的形状，它是由如玻璃、石英或聚乙烯对苯二酸盐的透明材料制成以用于贮存样品溶液。元件3a被束缚于接合球状元件支撑物10a中，元件支撑物10a具有反射性内表面，元件支持物10a留有窗口以接收由激发光源发出的激发射线12s并以与投射方向呈180°的角度的方向吸收散射光。激发射线12s由镜14弯曲并穿过元件支撑物10a的窗口被引入元件3a。
数16表示聚光透镜，可用于聚集由元件支撑物10a的窗口发出的散射光。当镜14被设置于聚光透镜16的光轴时，其孔径与聚光透镜16的孔径相比足够小，不会阻止聚光透镜16聚集散射光。元件3a所贮存的样品溶液使用的激发射线被元件支持物10a的内表面重复反射，利用拉曼散射可将此射线从元件支撑物10a的窗口中取出并引向光谱检测器。
参见图8B，在另一方面，其元件支撑物10b留有窗口以吸取散射光，此散射光的方向与激发射线12s的投射方向呈90°。元件3a被束缚于具有反射内表面的接合球状元件支撑物10b中，而元件支撑物10b留有窗口以从Y方向引入激发射线12s，并在与Y方向呈90°角的x方向吸取散射光18。
拉曼散射可识别多个峰，其中铁氰离子受酶反应影响，而峰被增强，不仅可通过实施例中所用的转变波数2081cm-1处的峰，通过任何其它峰都可进行底物的定性测量或定量测量，或进行酶活性的测量。
尽管已详细描述和阐明了本发明，但仍应清楚地理解这些描述和阐明仅仅是为了说明和举例的目的，而并不为了限制本发明，本发明的实质和范围仅由附加的权利要求的词语来限定。
权利要求
1.一种定性测量的方法，它包括下列步骤在已加入铁氰离子的样品溶液中加入酶；在加入所说酶之前和之后用单一波长的激发射线照射所说样品溶液，以接收来自所说样品溶液的散射光并按其光谱成分将所说散射光分开；和根据所说样品溶液在加入所说酶之后的拉曼散射光谱是否包括所说样品溶液在加入所说酶之前的拉曼散射光谱的峰的增强峰即可测量所说酶的靶底物存在与否。
2.根据权利要求1的测量方法，其特征在于用作拉曼散射峰的峰存在于与激发波长相关的转变波数1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1或2450至2580cm-1处。
3.根据权利要求1的测量方法，其特征在于所说酶是氧化还原酶。
4.一种定量测量的方法，它包括下列步骤向含有已知浓度靶底物的标准样品溶液中加入恒定浓度的铁氰离子和恒定单位的酶以导致酶反应，用单一波长的激发射线照射所说标准样品溶液以接收来自所说标准样品溶液的散射光并将所说散射光按光谱成分分开，在酶反应前对多种靶底物浓度不同的标准样品溶液由所说标准样品溶液拉曼散射光谱增强峰的峰强度值随时间的改变测量反应速度，以形成可显示所说靶底物浓度和所说反应速度之间关系的校准曲线；和在含有未知浓度靶底物的待测样品溶液中加入与形成所说校准曲线的测量中所用的那些浓度相同，单位相同的铁氰离子和酶，用与上述类似的激发射线照射所说待测样品溶液，以由与形成所说校准曲线所用的那些相同的拉曼散射峰峰强度值随时间的改变测量反应速度，根据所说的校准曲线即可得到所说测量样品溶液的底物浓度。
5.根据权利要求4的测量方法，其中，用作拉曼散射峰的峰存在于与激发波长相关的转变波数1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1或2450至2580cm-1处。
6.根据权利要求4的测量方法，其特征在于所说酶是氧化还原酶。
7.测量酶活性的方法，它包括以下步骤在含有已知浓度靶底物的样品溶液中加入恒定浓度的铁氰离子和恒定单位的酶以导致酶反应；用单一波长的激发射线照射所说样品溶液以使所说标准样品溶液的散射光能被接收并按其光谱成分将所说散射光分开；和在所说酶反应前，由所说样品溶液拉曼散射光谱增强峰的峰强度随时间的改变测量反应速度，根据所说反应速度即可得到酶活性。
8.根据权利要求7的测量方法，其特征在于用作拉曼散射峰的峰存在于与激发波长相关的转变波数1550至1680cm-1，1850至1880cm-1，2000至2150cm-1，2350至2380cm-1或2450至2580cm-1处。
9.根据权利要求7的测量方法，其特征在于所说酶是氧化还原酶。
全文摘要
有关反应溶液，其中每份铁氰化钾、葡萄糖氧化酶和葡萄糖底物的量规定为恒定值，而葡萄糖浓度可以改变，每隔10秒钟测量光散射光谱转变波数2081cm
文档编号C12Q1/00GK1159576SQ96107318
公开日1997年9月17日 申请日期1996年3月11日 优先权日1996年3月11日
发明者窦晓鸣, 山崎丰, 上野山晴三, 山口佳则 申请人:株式会社京都第一科学