专利名称：核黄素葡糖苷的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过发酵从淀粉中生产核黄素葡糖苷的方法。本说明书中所用的“核黄素葡糖苷”一词包括以每个核黄素分子上有一个或多个葡萄糖成分为特征的核黄素葡糖苷。
已知核黄素葡糖苷为在尿中发现的核黄素代谢物的一种。其比核黄素易溶于水。在20℃和37℃下核黄素葡糖苷的溶解度分别为2.2和3.5mg/ml。相比较之下，在这些温度时核黄素的溶解度为0.1和0.2mg/ml〔见酶学方法(Methods in Enzymology),Academic出版社，18B,404-417(1971)〕。
核黄素本身被广泛地在饮料中用作着色物和/或营养物，但因其在水中的低溶解度使饮料变混浊。用于静脉内滴注的含核黄素的溶液也变得浑浊且易于堵塞注射管。为解决这种溶解性的问题，更易溶的核黄素葡糖苷可用来替代核黄素以制备澄清的饮料和(注射用)溶液。
核黄素葡糖苷由Whitby用大鼠肝脏的丙酮干燥粉末首次获得〔生物化学杂志(Biochem.J.)50,433(1952)〕。当核黄素孵育在含有转葡萄糖苷酶及如麦芽糖、糊精、淀粉、糖原和水杨苷等葡糖基供体的溶液中时发生核黄素的葡萄糖苷化作用。已报道转葡糖苷酶广泛分布于动物器官、微生物及植物中，如大鼠肝脏，米曲霉(Aspergillus oryzae)，大肠杆菌(Escherichia coli)，肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)以及西葫芦(Cucurbita pepo)和甜菜(Beta vulgaris)的子叶。然而，通过这些酶反应方法或是在含有核黄素和葡糖基供体的培养基中发酵的核黄素葡糖苷的生产能力都非常低，且其纯化过程对于实际应用过于复杂〔见维生素学杂志(J.Vitaminology)6,139-144(1960)和酶学方法18B,404-417(1971)〕。
通过本发明的方法，利用在含有淀粉的培养基中一种产核黄素葡糖苷的微生物的发酵，可以以较高产量生产核黄素葡糖苷，甚至不必添加核黄素。此方法包括培养一种属于芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，其能在含有淀粉的液体培养基中在有氧条件下产生核黄素葡糖苷。
可以用于本发明的微生物包括所有属于芽孢杆菌属的有淀粉酶活性的菌株，如短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，及其能产生核黄素的重组体。
其中一些这样的菌株已保藏于发酵研究所(Institute forFermentaton),Osaka，日本(IFO)。其保藏号为短芽孢杆菌IFO 15304,蜡状芽孢杆菌IFO 15305，环状芽孢杆菌IFO 13626，凝结芽孢杆菌IFO12583，地衣芽孢杆菌IFO 12200，巨大芽孢杆菌IFO 15308，短小芽孢杆菌IFO 12092和枯草芽孢杆菌IFO 13719，其均列于IFO的“培养物目录”，微生物，第10版，1996。由此，这些微生物的样品可由公众从IFO获得。
用于本发明中最优选的菌株的例子是枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60〔pRF93〕120Ade+，枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60Ade+等等〔欧洲专利公开文本(EP)405370A1和821063A2〕。宿主菌RB50是抗玫瑰黄色素的去调节(deregulated)枯草芽孢杆菌。质粒pRF69含有SP01-15启动子和与rib操纵子同方向的cat基因。宿主微生物和质粒pRF69的详细描述见EP405370A1。此宿主微生物RB50和质粒pRF69已按照布达佩斯条约分别在指定日期保藏在农业研究机构保藏中心(NRRL),Peoria,ILLinois，和美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville,Maryland，保藏号为枯草芽孢杆菌RB50:(NRRL)B-18502(最初为1989年5月23日，于1989年8月24日再次保藏)pRF69:ATCC68338(1990年6月6日)前一保藏是由S.L.Misrock所做，c/o Pennie和Edmonds,1155Avenue of the Americas，纽约，NY 10036，美国。由于此保藏的保藏人多次更改，目前有效保藏人为Hoffmann-La Roche公司，340Kingsland Street,Nutley,New Jersey 07110。后一保藏是由BioTechnica国际公司所做，85 Bolton Street,Cambridge,Massachusetts 02140，美国(目前其保藏人为OmniGene Bioproducts公司，763-D ConcordAvenue,Cambride,Massachusetts 02138)。
通过将pRF 69导入到RB50的rib位点后，再用挑选可生长于氯霉素水平增加的情况下的菌落以扩增基因的方法获得枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60Ade+。通过将氯霉素抗性基因交换为四环素抗性基因从pRF89衍生出质粒pRF93(见EP405370A1，第二位点整合，实施例8)。枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60〔pRF93〕120Ade+的获得是通过将第二个质粒pRF93在染色体bpr位点整合(EP821063A2)。染色体位点上带有修饰过的rib操纵子的重组菌株通过药物抗性扩增。
已知在合适的罐发酵条件下枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60〔pRF93〕120Ade+能产生多于14.0g/l的核黄素(EP 821063A2)。质粒pRF93的制备也在该欧洲专利公开文本中描述。
在本发明优选的实施方案中，通过在含有淀粉特别是一种可溶性淀粉和/或一种或多种其它淀粉及补加了合适营养物的液体培养基中，在有氧条件下培养最后述及的微生物菌株来实现核黄素葡糖苷的生产。此培养基所含的一种可溶性淀粉和/或一种或多种其它淀粉的(总)浓度从约25g/l到约400g/l，优选的从约200g/l到约300g/l。微生物的接种量一般地从约1％到约30％，优选约5％到约20％。
培养基含有的淀粉，原则上可用任何种类的，诸如可溶性淀粉，马铃薯淀粉，玉米淀粉和小麦淀粉。通常要求培养基含有养分。这些养分可以是可消化的氮源，如有机物，例如，胨，酵母提取物，大豆粉，玉米浸液，棉籽渣，干燥酵母和肉膏提取物；无机物，例如，硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，硝酸钾和磷酸钾；维生素；金属；氨基酸；微量元素；以及附加的可同化碳源，例如D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，D-山梨糖醇，蔗糖，糖蜜，淀粉水解物，乙酸和乙醇(如有需要)。
培养方便地在pH约4.0到约9.0，优选地约4.5到约8.0下进行。培养期依据特定的微生物和所用培养基而不同，一般地在约10到约150小时的范围内。进行培养的温度范围方便地从约20到约45℃，优选地从25到40℃。
如此累积的核黄素葡糖苷由那些每个核黄素分子上带一个或多个葡萄糖成分的混合物组成。如需要，所产生的核黄素葡糖苷可容易地浓缩成核黄素单葡糖苷，且可通过下面方法加以回收，如含有核黄素和核黄素葡糖苷的培养液首先经过过滤或离心以除去细胞。再将分离的滤液用葡糖淀粉酶处理，通过此方式将核黄素葡糖苷浓缩成核黄素单葡糖苷。约一单位葡糖淀粉酶/(毫克核黄素葡糖苷)足以达到此目的(一个单位在pH4.5和55℃下从淀粉中释放1.0mg葡萄糖)。采用的酶量依孵育温度、时间及其它反应条件如pH而定。若酶浓度和/或温度低，则需要较长的孵育时间。尝试在37℃下孵育2至3天，显示有良好结果。参照这些数据，0.001至100单位/毫克，25至70℃下孵育1分钟至100小时，优选地0.1至10单位/毫克，30至60℃下孵育3分钟至70小时的条件可被适当地采用。为了进一步纯化(如有需要)，可将处理过的溶液经吸附树脂处理。无论是否要获得核黄素单葡糖苷，为了分离每一组分，在发酵过程中累积的核黄素葡糖苷可用标准技术，优选的包括吸附树脂和凝胶过滤从发酵液中分离出。
本发明已从一般意义上加以描述，下列给出的图和实施例意在更加详细阐明本发明，而不以任何方式对本发明加以限制。
图1典型培养液的HPLC分析。
实施例1将在含有60μg/ml氯霉素和1209μg/ml四环素的胰蛋白
血琼脂碱性培养基(TBAB,DIFCO Laboratories,Detroit，美国)的琼脂平板上生长的枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60〔pRF93〕120Ade+取一环，接种于含有8ml种子培养基的试管中。
在试管摇床上于37℃培养试管内容物2.75小时。如此制备的种子培养基(4ml)接种于500ml带棉塞的三角瓶中，接种后生产培养基达40ml。种子培养基及生产培养基组成如下
种子培养基 生产培养基酵母提取物 20.0g/l20.0g/lKH2PO47.57.5谷氨酸钠5.05.0(NH4)2SO45.05.0MgCl2·6H2O 1.51.5MnSO4·nH2O 0.05 0.05CaCl2·2H2O 1.01.0FeCl3·6H2O 0.025 0.025灭菌前pH6.7葡萄糖 13.3g/l-麦芽糖 26.7g/l-可溶性淀粉 - 200g/l(MnSO4·nH2O中的n代表4～6的整数，表示硫酸锰的不同水合程度。)生产培养基在37℃下以240转/分培养3天。通过薄层层析分析发酵液中核黄素相关化合物的生产水平。取1μl发酵液点在硅胶板上(Kieselgel 60F254,MERCK,Darmstadt，德国)，用含有丙酮、正丁醇和水(体积比5∶4∶1)的溶液系统展开。检测出至少三个非核黄素的化合物，命名为组分A,B和C，均为黄色。组分A,B,C和核黄素的Rf值分别为O.27,0.15,0(展开后保留在加样点)和0.41。相应的，组分A量最大。与黄素单核苷酸或黄素-腺嘌呤二核苷酸的直接比较表明，上述组分与这些核苷酸无关。
培养液的HPLC分析在如图1所述的条件下进行。组分A的保留时间为8.6分钟，而核黄素的为9.6分钟。组分A,B和C的紫外可见光吸光光谱与核黄素的一致。
用444nm处紫外吸光度测量的组分A,B和C的总产量为3.51g/l(基于核黄素)
实施例2将以与实施例1类似的方法获得的培养液用在乙酸钠缓冲液(pH4.5)中的黑曲霉葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)(Sigma化学公司，Mssouri，美国)于55℃处理2.5小时。通过薄层层析分析，发现培养液中的组分A,B和C集中于组分A。此外，也检测到一个与真正葡萄糖相同的点。因而，通过处理，从组分B和C中释放出了葡萄糖。再将此溶液用填装有吸附树脂的柱AmberliteXAD-7(Rohm和Haas公司，费城，美国)处理。组分A和核黄素均被树脂吸附(葡萄糖不被吸附)，在用水洗后以1∶1的丙酮水溶液洗脱。经蒸发以除去丙酮而浓缩后，冷冻干燥洗脱液。所得粉末重新溶于小量氢氧化钠溶液中并用装填有凝胶过滤树脂的柱一Toyopearl HW-40F(TOYO SODA Mfg有限公司，东京，日本)处理，以分离组分A和核黄素。洗脱的组分A流份被冷冻干燥。所得的粉末纯度为97％。
组分A的分子量用质谱仪测得为m/z 539。此值对应于核黄素单葡糖苷。组分A再用1N盐酸于95℃下水解2.5小时，以研究葡萄糖成分附着到核黄素上的可能性。再将水解物与真正的核黄素和葡萄糖样品一起点样于薄层层析板上并展开。结果发现，核黄素和葡萄糖已被从组分A中释放。此外，组分A的1H和13C NMR谱分析显示，葡糖苷键为在核黄素5′位上的一个α-键。从这些结果中可以推出，组份A与5′-D-核黄素α-D-葡糖苷6,7-二甲基-9-(5′-〔α-D-吡喃葡萄糖基〕-D-核糖醇基)-异咯嗪相同。
实施例3短小芽孢杆菌RLX3是一种经N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理两次衍生自短小芽孢杆菌RC15(FERM-BPNo.2834,JP Kokai No.203982/1995)的黄色产核黄素突变菌株，以除了不加抗生素之外如同实施例1中所述的方法培养。结果，在培养3天后产生了(基于444nm处所测的核黄素的紫外吸收值)0.25g/l核黄素葡糖苷。
权利要求
1．一种用于生产核黄素葡糖苷的方法，其包括培养一种属于芽孢杆菌属的微生物，其能在含有淀粉的液体培养基中在有氧条件下产生核黄素葡糖苷。
2．一种如权利要求1的方法，其中的微生物属于短芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的种类。
3．一种如权利要求2的方法，其中的微生物是短芽孢杆菌IFO 15304，蜡状芽孢杆菌IFO 15305，环状芽孢杆菌IF O13626，凝结芽孢杆菌IFO 12583，地衣芽孢杆菌IFO 12200，巨大芽孢杆菌IFO15308，短小芽孢杆菌IFO 12092或枯草芽孢杆菌IFO 13719。
4．一种如权利要求2的方法，其中的微生物是枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60Ade+或枯草芽孢杆菌RB50::〔pRF69〕60〔pRF93〕120Ade+。
5．一种如权利要求1～4中任一项的方法，其中培养基中淀粉的初始浓度从约为25g/l到约为400g/l，优选地约为200g/l到约为300g/l。
6．一种如权利要求1～5中任一项的方法，其中培养是在pH约为4.0到约为9.0，优选地pH约为4.5到约为8.0下进行。
7．一种如权利要求1～6中任一项的方法，其中培养是在温度以约20℃到约45℃，优选地从25℃到45℃下进行。
全文摘要
一种用于生产核黄素葡糖苷的方法,其包括培养一种属于芽孢杆菌属的微生物,如短芽孢杆菌,蜡状芽孢杆菌,环状芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌,短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌,其在含有淀粉的液体培养基中在有氧条件下能产生核黄素葡糖苷。其中优选的菌株是枯草芽孢杆菌RB50∶∶[pRF69]60Ade+和枯草芽孢杆菌RB50∶∶[pRF69]60[pRF93]120Ade+。所产的核黄素葡糖苷可用作核黄素的溶解性更好的替代物以制备澄清饮料和注射用溶液。
文档编号C12P19/32GK1230597SQ9812277
公开日1999年10月6日 申请日期1998年12月4日 优先权日1997年12月4日
发明者T·星野, S·增田 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司