专利名称：苏云金杆菌分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于苏云金杆菌的基因工程技术领域，具体涉及一种苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株。
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)杀虫剂是目前国内外生产量最大、应用面积最广的一种微生物杀虫剂，具有无污染、无残毒、对靶害虫专一和对人畜、植物等非目标生物安全等优点。苏云金杆菌对昆虫的致病作用主要靠杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystalproteins,ICPs)起作用，提高ICPs的产量即可提高产品的总毒力，降低生产成本。过去只从常规筛选和选育菌株着手，但其产量随着菌种的退化而不稳定或降低。
Ellis和Hemmingsen把分子伴侣定义为一类互不相关的细胞蛋白质，它们能介导其他蛋白质的正确装配，但它们本身却不是有功能的最终装配产物的组成成分。目前对其作用的详细机制还不清楚，分子伴侣概念已被广泛用于几乎所有动植物和细菌的蛋白质装配过程之中。现已证明，许多细胞内蛋白的装配都需要一类称做“分子伴侣”(molecularchaperone)的蛋白质帮助才能完成。分子伴侣概念的提出并没有否定“氨基酸的顺序决定蛋白质的空间结构”这一原则，只是补充和修正“自装配”学说，它认为在活细胞中蛋白质分子内部或分子间以及与其它非蛋白质分子间的相互作用都必须受到控制才能有效地形成有生物活性的正确装配产物。分子伴侣就是这种有控制功能的蛋白质，它能阻止不正确的相互作用以防止错误装配。这里的装配不仅指蛋白质的折叠，也包括蛋白质的多聚化和蛋白质与其它非蛋白质分子形成复杂的结构。任何装配过程都存在着因错误的相互作用而产生无功能活性的结构的可能性。只有当这种可能性极小时“自装配”才能自发完成。反之，正确的装配就必须有分子伴侣的帮助。分子伴侣概念的提出是近十几年来蛋白质研究的一次飞跃。
在苏云金杆菌中，国外实验室已发现来源于苏云金杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis subsp.israelensis)，定位于cry11Aa下游的一个开放读码框ORF编码20kDa蛋白，这个基因后来命名为P20基因。20kDa蛋白实际上具有“Chaperone”蛋白的作用。至目前为止，已经证实20kDa蛋白可促进Cyt1Aa(Wu and Federici,1993；Visisck and Whiteley1991)、Cry4Aa(Yoshisue,1992)、Cry11Aa(Wu and Federici,1995)蛋白的从头合成，有趣的是Cyt和Cry蛋白在氨基酸序列差异很大且生化特性也不一样(Hofte and whiteley,1989)，这些暗示着20kDa蛋白可能对其他蛋白同样有类似的功能，所以它在重组细胞中稳定那些特别容易降解的蛋白可能是有益的(Visick and Whiteley,1991)。1997年Thiery等在medellin亚种中也克隆到相似的基因，命名为p21med，其功能未知。上述20kDa蛋白虽然能提高ICP“表达”基因的表达水平，但没有关于它能激发ICP“沉默”基因的报道。ICP“表达”基因是指一个Bt菌株在正常培养条件下能够表达的杀虫晶体蛋白，这些蛋白的编码基因处于表达状态中，此类基因命名为ICP“表达”基因；ICP“沉默”基因是指一个Bt菌株在正常培养条件下由于未知的原因不能够表达的杀虫晶体蛋白，这些蛋白的编码基因其实存在于该菌株的染色体或质粒上，此类基因命名为ICP“沉默”基因。
本发明的目的之一是提供一个新的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的分子伴侣基因，该基因不仅能显著提高野生型苏云金杆菌ICP“表达”基因的表达水平和促进晶体的形成，且能激发苏云金杆菌ICP“沉默”基因的高水平表达。
本发明的目的之二是提供含有上述基因的重组载体。
本发明的目的之三是提供一种含有上述基因的苏云金杆菌及其构建方法。
本发明的分子伴侣基因是从新分离的苏云金杆菌Bt.ZB522菌株中克隆得到的，该基因与p20和p21med基因相比其同源性分别为97.8％和85.1％(如图2和图3所示)，该基因编码21kDa蛋白，具有分子伴侣作用，命名为p21zb基因。p21zb基因的DNA和氨基酸序列已输入国际数据库EMBL，且已得到认可，其Accession NO为AJ011857，其全序列
公开日为1999年12月30日。
该基因的基本特征如下a．序列特征长度549bp，类型为核酸，双链，线性b．分子类型DNAc．来源克隆自苏云金杆菌d．DNA序列如
图1所示。
本发明还构建了含有上述p21zb基因的重组载体。该重组载体是将含有完整p21zb基因及其调控区的Pst1片段插入出发载体的多克隆位点而构成的。出发载体可以是各种细菌如Bt、E.coli等的载体和病毒的载体。
上述所用的出发载体优选Bt-E.coli穿梭载体pHT3101(D.Lereclus等,1989)，所构建成的含p21zb基因的重组载体为pHZB1。pHZB1的结构及构建过程如图6所示。
将含有完整p21zb基因及其调控区的Pst1片段插入pHT3101的多克隆位点，酶切分析筛选获得重组质粒pHZB1。外源片段的导入对pHT3101复制特性、稳定性和安全性均无影响。
所采用的Bt-E.coli穿梭载体pHT3101(如图6所示)，为法国巴斯德研究所D.Lereclus等人构建。pHT3101由三部分构成一个2.9kb的BalⅠ片段来源于Bt，为Bt中的复制子；一个1kb的红霉素(Em)抗性基因，来源于链球菌；一个pUC18的全组件，由青霉素(Ap)抗性基因、多克隆位点、大肠杆菌的复制子和LacZ基因的5’-端α-lac片段组成。pHT3101是目前已知的苏云金杆菌稳定性较好的质粒，能在Bt-E.coli中稳定遗传。基因片段插入到多克隆位点后导致LacZ基因失活，得到的重组克隆在含有IPTG和X-gal的LB-红霉素/青霉素平板上是白色菌落。相反，非重组质粒则可大肠杆菌宿主互补为蓝色菌落。pHT3101及其衍生质粒已在苏云金杆菌的基因克隆和基因表达中得到广泛应用，质粒遗传性稳定，不带有任何危险的标记基因，对人类和生态环境没有或危害的可能性极小。
本发明还提供了一种含有上述p21zb基因的苏云金杆菌杀虫工程菌。该工程菌是用本发明的上述含p21zb基因的重组载体pHZB1转化苏云金杆菌出发菌而获得的。其具体构建成方法为a．根据需要，选择具有较高杀虫活性的苏云金杆菌为出发菌株；b．参照Schurter(1989)及Brain&Luke(1988)的方法制备出发菌的感受态细胞；c．采用高压电激法将含p21zb基因的穿梭载体导入出发菌的感受态细胞；d．在抗生素板上筛选阳性菌落。抽提阳性菌落的质粒，转化大肠杆菌JM101或TG1，再提取质粒，酶切分析确认阳性菌落，即为目标工程菌。
本发明的含有p21zb基因的苏云金杆菌杀虫工程菌还可通过将含p21zb基因的Bt重组载体经转座子载体(transposon vector)整合进Bt出发菌染色体中而获得。
本发明的含有p21zb基因的苏云金杆菌杀虫工程菌的代表菌株为Bt-YPF22菌株。该菌株是由本发明的含有p21zb基因的重组载体pHZB1转化野生菌株Bt-F2而获得的。
上述工程菌Bt-YPF22已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏编号CCTCCM98018，保藏日1998年11月26日。
由该Bt-YPF22菌株即可直接提取得到本发明的重组载体质粒pHZB1。质粒pHZB1的复制方法参照Sambrook(1989)方法，转化大肠杆菌如TG1或JM10，加入氨苄青霉素(100ug/ml)和红霉素(50ug/ml)的培养基培养，碱法提取质粒。
由质粒pHZB1经NsiⅠ/ClaⅠ酶切，可得约1.2kb的DNA片段；也可经PstⅠ酶切，可得约1.5kb的DNA片段，即可获得本发明的p21zb基因。
试验表明，本发明的p21zb基因的表达产物有助于ICPs表达和形成晶体，具分子伴侣的功能，而且能激发苏云金杆菌ICP“沉默”基因的高水平表达，是一个“增产”基因。含有此基因的重组质粒pHZB1经电激转化至野生菌株Bt-F2，获得工程菌株。在相同培养条件下，取等量培养物经SDS-PAGE蛋白电泳证实，工程菌产生的晶体量提高一倍多。生物测定也表明，工程菌株的毒力明显提高。这表明，p21zb基因具有增产增效的功能，用其构建的工程菌的可获得高产高毒的新性状。
作为本发明工程菌Bt-YPF22的出发菌的苏云金杆菌Bt-F2菌株从我国土壤中分离获得。这株野生菌株产生的伴孢晶体为菱形，主要含分子量为130～140kDa和60～70kDa两种蛋白，基因型属于cry1和cry2。
在基因工程菌Bt-YPF22(CCTCC M98018)中，目的基因p21zb及其调控区片段位于高拷贝的重组质粒pHZB1上，在受体菌中能稳定遗传和表达，在电子显微镜下能观察到晶体数量明显增多，晶体形状也发生明显变化，不仅有菱形，还有方形晶体，两种形状的晶体数量上均等。连续培养150代质粒丢失频率小于10-4/代。
以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明的p21zb基因的DNA序列。
图2是p21zb基因与p20基因的DNA序列同源性比较，显示其同源性为97.8％，其中第一行为p21zb基因，第二行为p21基因。
图3是p21zb基因与p21med基因的DNA序列同源性比较，显示其同源性为85.1％。
图4是p21zb蛋白与p20蛋白的氨基酸序列同源性比较，显示其同源性为97.3％，其中第一行为p21zb蛋白，第二行为p20蛋白。
图5是p21zb蛋白与p21med蛋白的氨基酸序列同源性比较，显示其同源性为70.2％。
图6是穿梭质粒pHT3101的结构及重组质粒pHZB1的结构和构建过程示意图。
图7是工程菌Bt-YPF22和Bt-QS与相应出发菌株的晶体蛋白SDS-PAGE对比分析图M1和M2代表标准蛋白，Q代表Bt-QS,S代表Bt-S181,Y代表Bt-YPF22,F代表Bt-F2。
图8是电激转化晶体缺陷型菌株的晶体蛋白SDS-PAGE对比分析图；M代表标准蛋白，B代表晶体缺陷型菌株BtK-BE20,Q代表晶体缺陷型菌株Bti-4Q7,T代表晶体缺陷型菌株Btt-P12；(+)表示经pHZB1(p21zb基因)转化。
实施例1．p1zb基因的制备过程从我室新分离菌株Bt-ZB522中提取质粒，质粒DNA经PstⅠ酶切消化，随机克隆于穿梭质粒pHT3101上，并直接电激转化晶体缺陷型菌株BtK-BE20，将转化处理的受体菌涂布于含50ug/ml Em和100ug/ml Ap的LB平板培养基上培养，在光学显微镜下观察有无伴孢晶体产生，进而确定有效重组子。用此法筛选到的重组菌株之一JB001，能够产生大卵圆型晶体。提取JB001的全部质粒，转化大肠杆菌JM101，获得重组穿梭质粒pHZB001，外源片段大小为1.6kbp的片段。
基因p21zb也可如前面所述，直接从Bt-YPF22(CCTCC M98018)菌株提取质粒pHZB1,经NsiⅠ/ClaⅠ酶切，可得约1.2kb的DNA片段；也可经PstⅠ酶切，可得约1.5kb的DNA片段，p21zb基因(549bp)定位于这两个片段上，即获得本发明的p21zb基因。
实施例2．含p21zb基因的重组质粒pHZB1的构建a．设计2个引物PrimerⅠ:C[CTGCAG]GTCAACACCCTGGGTCAA，括号中为PstⅠ位点；PrimerⅡ:G[ATGCAT]TCATTGATGTTCGG，括号中为NsiⅠ位点；模板为质粒pWF45，含有基因cryIA(c)的启动子。通过PCR反应获得195bp的DNA片段，序列测定表明PCR产物是预期的；b．上述片段与pALTER-EX1/PstⅠ、NsiⅠ连接转化，获得重组质粒pAL-P。；c．质粒pAL-P经PstⅠ/HindⅢ双酶切获295bp含启动子的DNA片段，插入BluscriptM13-，得到质粒pBL-P；d．p21zb基因的ORF、启动子调控区域及转录终止区等定位于NsiⅠ/ClaⅠ双酶切的1.2kb片段内，把这个片段插入质粒pBL-P，获得重组质粒pBL-P-CH；e．质粒pBL-P-CH经KpnⅠ/Bam HⅠ双酶切，回收约1 5kb片段，插入pUC18，获得配套质粒pHZY1。
f．质粒pBL-P-CH经PstⅠ酶切，回收约1.5kb片段，插入pHT3101，获得Bt表达载体质粒pHZB1。
重组质粒pHZB1也可如前面所述，直接从Bt-YPF22(CCTCC M98018)菌株提取得到。
实施例3．含p21zb基因的工程菌Bt-YPF22的构建a．选择具有较高杀虫毒性的Bt-F2菌株作为出发菌株；b．参照Schuler(1989)及Brain&Luke(1988)的方法制备苏云金杆菌感受态细胞；c．吸取0.01～0.05uf/ul的质粒pHZB1加入到准备好的感受态细胞中，充分混匀，置冰浴10分钟，移入预冷的电激杯中(0.2mm)，电压1500v，电阻400～800进行电激，电激后迅速移入冰浴经10分钟，加入800ml SOC,30～35℃静止培养1～2小时，然后取样，涂布于青霉素和红霉素双抗板上筛选阳性菌落。由于pHZB1是Bt-E.coli的穿梭质粒，可抽提阳性菌落的质粒，转化大肠杆菌JM101或TG1，再提取质粒，酶切分析而排除假阳性菌落。确认的阳性菌落即为Bt-YPF22。
权利要求
1．苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的分子伴侣基因，其特征在于该基因为p21zb，其DNA序列如下ATGACAGAAA ATGGAGTGTT TTATAAAATA TTCACAACAG AAAATAATAA TTTCTGTATA 60AATCCTACTT TGTTAGAAAG GGTTTTTAAA AATAATTTAG ATGAATTTGA TTTTTCGCTA 120GTAAAAAAAA ACTTAGAACA TGAGAAGAAT TGTGTGATTA CTTCTACAAT GAATCAAACA 180ATTTCTTTCG AGAATATGAA TAGTACAGAA ATGGGGCATA AGACATATTC CTTTTTAAAT 240CAAACAGTTT TAAATAATAA GGGGAAATCC TCTTTAGAGG AACAAGTCTC TAATATTTTT 300TATAGATGTG TATATATGGA AGTTTGGAAA TCAAGTTCAT ATATTAACCC TCTTGAGCAG 360GATTCTAATA AATTAAGGTA TGTGTGTAGT TTGCTCTTTA TAGTGCCCTA TAAGGATAAC 420ATAACATCAA TTATTCCAGT AAATTTACAA CTAACATTAT TATCGAAAAA TGTAAAACAA 480TCGTCTTCTA CAAATATATT TTCAGGAGAT ATACATTTTA ATATGGTAAC AATGACTTAT 540TTAACTTAA 549
2．一种重组载体，其特征是该载体含有权利要求1所述的基因。
3．按照权利要求2所述的载体，其特征是该载体为苏云金杆菌表达载体pHZB1。
4．一种苏云金杆菌杀虫工程菌，其特征是该菌株含有权利要求1所述的基因。
5．按照权利要求4所述的苏云金杆菌杀虫工程菌，其特征在于该菌株为Bt-YPF22(CCTCC M98018)。
6．权利要求4所述的苏云金杆菌杀虫工程菌的构建方法，其特征包括a．根据需要，选择具有较高杀虫活性的苏云金杆菌为出发菌株；b．参照Schurter(1989)及Brain&Luke(1988)的方法制备出发菌的感受态细胞；c．采用高压电激法将含p21zb基因的穿梭载体导入出发菌的感受态细胞；d．在抗生素板上筛选阳性菌落，抽提阳性菌落的质粒，转化大肠杆菌JM101或TG1，再提取质粒，酶切分析确认阳性菌落，即为目标工程菌。
全文摘要
本发明涉及克隆自苏云金杆菌(Bt)的一个分子伴侣(Chaperone)基因p21zb以及含有该基因的载体和菌株。该基因转入Bt菌株不仅能显著提高野生型苏云金杆菌杀虫晶体蛋白(ICPs)的产量,且能激发苏云金杆菌杀虫晶体蛋白“沉默”基因的高水平表达。本发明构建了含有p21zb基因的重组载体和工程菌,该工程菌的ICPs表达量比出发菌提高一倍以上,室内外试验证实了该工程菌株对鳞翅目害虫的幼虫有高毒力和良好的遗传稳定性,且有高产高毒的新性状。
文档编号C12N15/32GK1234446SQ98122230
公开日1999年11月10日 申请日期1998年12月3日 优先权日1998年12月3日
发明者余健秀, 庞义, 邓日强 申请人:中山大学