专利名称：改进的头孢菌素的体内生产方法
技术领域：
本发明涉及一种生产头孢菌素的方法并且特别是生产7-ACA或其衍生物的方法，该方法包括以下步骤在有合适的酰基侧链前体或其盐或其酯存在的条件下发酵一种产黄青霉菌株，因而产生N-酰化7-ACA化合物，N-脱酰化如此产生的N-酰化7-ACA化合物和，任选地，酰化游离氨基和/或采用适合形成头孢菌素抗生素的侧链取代3’乙酸基，其中产黄青霉菌株被含有编码延伸酶(expandase)、羟化酶和乙酰转移酶的核苷酸序列的表达构建体所转化。
制备头孢菌素的半合成途径大多起始于发酵产物如青霉素G、青霉素V、头孢菌素C，例如以K.Matsumoto，生物加工技术(Bioprocess.Techn.)，16，67-88(1993)，J.G.Shewale和H.Sivaraman，加工生物化学(ProcessBiochemistry)，1989年8月，146-154，T.A.Sayidge，工业抗生素生物技术(Ed.E.J.Vandamme)Marcel Dekker，纽约，1984，或J.G.Shewale等，ProcessBiochemistry International，1990年6月，97-103中公开的方法将所述发酵产物转化为相应的β-内酰胺母核。获得的β-内酰胺母核随后通过与一个合适的侧链偶联而被转化为所需要的抗生素，这特别在EP0339751，JP53005185和CH640240中进行了描述。通过进行侧链和β-内酰胺母核的不同组合，可以获得多种青霉素和头孢菌素抗生素。
已知头孢菌素母核7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产用于医药工业的抗生素的重要中间体。
头孢菌素C显然是制备7-ACA以及其它治疗用头孢菌素的最重要的起始物。然而，头孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，因此意味着需要通过利用繁琐和昂贵的柱技术来进行长时间和高成本的分离过程来除去产品中未被转化的头孢菌素C。另外，制备7-ACA所必需的酶促或化学裂解难以对头孢菌素C的α-氨基己二酰侧链起作用。
为了克服本文上述的一些缺陷，已公开了一种生产7-ACA的发酵方法，该方法包括发酵生产某些N-取代的头孢菌素，该头孢菌素的侧链通过简单的酶促或化学裂解反应可容易地被去除。
通过一株能够表达酶活性去乙酸基头孢菌素合成酶(也被称为“延伸酶”)、去乙酰基头孢菌素C合成酶(“羟基化酶”)以及头孢菌素C合成酶(“乙酰转移酶”)(EP00540210)的重组产黄青霉菌株而实现了这些N-取代的头孢菌素如己二酰7-ACA的发酵生产。
在利用重组产黄青霉菌株进行己二酰7-ACA的体内生产过程中，观察到存在着和己二酰7-ACA相比大量的己二酰7-ACA，己二酰-7-氨基头孢烷酸(己二酰-7-ADAC)的前体。显然，乙酰转移酶基因没能以足以使己二酰-7-ADAC向己二酰-7-ACA大量转化的量进行表达。
本发明公开了被设计用来获得乙酰转移酶高水平表达的乙酰转移酶表达构建体。这样，增加了前体己二酰-7-ADAC转化为己二酰-7-ACA的量。
描述源自产黄支顶孢(Acremonium chrysogenum)(cefG)的乙酰转移酶基因的克隆和核苷酸序列的文献公开了一个起始于乙酰转移酶可读框(ORF)的第一个(EP0437378；Gutierrez等，细菌学杂志.1743056-3064(1992))，或第二个(Mathison等，Curr Genet.2333-41(1992))或第三个ATG(EP0450758)的编码序列。另外，在对不同启动子在产黄支顶孢(A.chrysogenum)中表达乙酰转移酶的效率进行的研究过程中，被测试的构建体是一种含有起始于第二个ATG的乙酰转移酶编码序列的融合构建体(Gutierrez等，应用微生物学生物技术48606-614(1997))。
本文以上引用的文献没有一篇公开了选择特定cefG 0RF的起始密码子来获得在重组产黄青霉菌株中进行乙酰转移酶高效表达的优点，该产黄青霉菌株用于生产7-ACA或其衍生物的发酵过程。
本发明公开了一种生产7-ACA或其衍生物的方法，该方法包括以下步骤在有合适的酰基侧链前体或其盐或其酯存在的条件下，对用含有编码延伸酶、羟基化酶和乙酰转移酶活性的核苷酸序列的表达构建体转化的产黄青霉菌株进行发酵培养，由此产生N-酰化7-ACA化合物，N-脱酰化如此产生的N-酰化7-ACA化合物，和任选地，酰化游离氨基和/或采用适合形成头孢菌素抗生素的侧链取代3’乙酸基，其特征在于编码乙酰转移酶的核苷酸序列源自于产黄支顶孢并且起始于所述核苷酸序列的第二个ATG。
通过本发明惊奇地发现，含有源自于产黄支顶孢的乙酰转移酶编码序列的表达构建体在该编码序列起始于可读框(ORF)的第二个ATG时的表达比起始于所述ORF的第一个或第三个ATG时的表达更高效。乙酰转移酶更高效表达的其中一个效果是N-酰化7-ADAC衍生物被更高效地转化为N-酰化7-ACA衍生物。
在本发明的方法中，转化的产黄青霉菌株被用来表达导致3’-酰化头孢菌素化合物产生的头孢菌素生物合成途径中的三种酶活性。
编码所述三种酶活性的基因的合适来源是用于得到延伸酶基因cefE和羟基化酶基因cefF(有关cefE参见EP0341892和有关cefF参见EP0465189)的细菌带小棒链霉菌或Nocardia lactamdurans，或用于得到双功能延伸酶/羟基化酶基因cefEF和乙酰转移酶基因cefG(有关cefEF参见EP0281391和Coque等，Mol.Gen.Genet.236453-458(1993)以及有关cefG参见EP0437378和EP0450758)的真菌产黄支顶孢。
根据本发明，乙酰转移酶活性是通过从产黄支顶孢中获得的cefG基因提供的。尤其是，本发明表明采用cefG ORF的第二个ATG作为起始密码子是有利的。cefG ORF的第二个ATG作为起始密码子的使用意味着用于本发明方法中的乙酰转移酶具有以蛋氨酸-亮氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-丝氨酸开头的N-端氨基酸序列。
在本发明的方法中，编码三种酶活性延伸酶、羟基化酶和乙酰转移酶的基因可以带有正处于计论之中的该基因本身具有的5’和3’调控序列或可以带有与所述基因异源的调控序列。
合适的5’和3’调控序列即为在丝状真菌宿主细胞中的重组基因表达提供的启动子和终止子的实例在Van den Hondel等(于More Gene Manipulationsin Fungi，Eds.Bennett和Lasure，396-427(1991))中或在丝状真菌的应用分子遗传学(Kinghorn，Turner(eds.)，Blackie，Glasgow，UK，1992)中提到。优选的启动子是黑曲霉葡糖淀粉酶启动子或源自于编码ACV合成酶、异青霉素N合酶、乙酰转移酶、磷酸甘油酸激酶的基因的产黄青霉启动子或者基因Y。也可以从相同的基因中获得转录终止子。
在本发明的一个实施方案中，所提供的一种发酵生产7-ACA或其衍生物的方法包括采用经表达构建体转化的产黄青霉菌株，该表达构建体中的编码延伸酶、羟基化酶和/或乙酰转移酶活性的基因的编码序列被融合到与所述编码序列异源的启动子序列上。所述异源启动子序列例如是源自于产黄青霉的IPNS(pcbC)启动子。
在本发明的另一个实施方案中，通过采用PCR技术能便利地实现选择的启动子序列和编码延伸酶、羟基化酶和/或乙酰转移酶活性的编码序列的起始密码子之间的精确融合。
产黄青霉宿主细胞的转化，通常能够通过DNA传递的不同手段，象PEG-Ca介导的原生质体摄取、电穿孔或粒子枪技术，和随后转化体的筛选来完成。例如见Van den Hondel en Punt，基因和转移以及用于丝状真菌的载体的研制，于真菌的应用分子遗传学(Peberdy，Laten，Ogden，Bennett，eds.)，剑桥大学出版社(1991)。显性和非显性选择标记的应用已有描述(Van den Hondel，见上文)。同源(来源于产黄青霉)和异源(非来源于产黄青霉)的选择标记也都已有描述(Gouka等，生物技术杂志(J.Biotechnol.)20 189-200(1991))。
在转化体的选择过程中，同源或异源的，有或无载体序列、与非选择性DNA物理连接的或非物理连接的不同转化体选择标记的应用在本技术领域中是已知的。
只要发酵是在有合适的侧链前体存在的条件下进行的，转化了的产黄青霉菌株的发酵培养可以在本技术领域已知的任何合适的发酵培养基中进行。在这方面，合适的侧链前体被定义为一种能产生经发酵生产的头孢筛化合物的N-酰基侧链的N-酰基侧链前体，所述N-酰基侧链能进行简单的化学或酶促去除。特别是，合适的侧链前体是二羧酸，更特别地是如式(1)所示的二羧酸HOOC-X-(CH2)n-COOH (1)其中n是至少为2的偶数，和x是(CH2)p-A-(CH2)q，其中p和q每一个分别是0，1，2，3或4，和A是CH＝CH-CH＝CH，CH＝CH，C≡C，CHB，C＝O，O，S，NH，氮被选择地取代或硫被选择性也氧化，和B是氢、卤素、C1-3烷氧基、羟基或选择性取代的甲基，条件是当A是CH＝CH-CH＝CH时p＋q应为0或1，当A是CH＝CH或C＝C时p＋q应为2或3或当A是CHB，C＝O，O，S或NH时p＋q应为3或4，或其盐或其酯。
如式(1)的合适侧链前体的实例是己二酸、3’-羧甲基硫代丙酸(WO95/04148)、3，3’-硫代二丙酸(WO95/04149)或如WO98/48034或WO98/48035中提供的侧链前体。优选的侧链前体是己二酸或反式-β-氢化粘康酸。
通过在有合适酰基侧链前体例如己二酸存在的条件下进行发酵所获得的N-酰化7-ACA化合物，例如己二酰-7-ACA可通过采用常规的回收技术，例如下述简单的溶剂萃取方法从发酵培养基中高效地回收过滤培养液并将与水不溶混的有机溶剂加到滤液中。调节pH以便从水层中萃取头孢菌素。pH范围必须低于4.5；优选地在4至1之间，更优选地在2至1之间。这样使头孢菌素与存在于发酵培养液中的许多其它杂质中分离。优选使用少量有机溶剂，结果得到更浓缩的头孢菌素溶液，因而使体积流速减小。第二个可能性是在pH为4或更低的pH下进行全部培养液的萃取。优选地是培养液在pH范围为4至1的条件下用与水不混溶的有机溶剂进行萃取。
任何不影响头孢菌素分子的溶剂都可以使用。合适的溶剂是，例如，乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁酮、醇如丁醇等。
此后头孢菌素在pH4至pH10之间，优选地在pH6至pH9之间用水反萃取。终体积能再次被减小。可在0℃至50℃的温度下，优选地在0℃至10℃的温度下，进行回收。
由于7-氨基通过合适的酰基侧链的存在被进行了适当的保护，所以通过本发明方法生产的N-酰化头孢菌素衍生物能被方便地用作化学合成半合成的头孢菌素的中间体。
或者，为了去除N-酰基，例如己二酰，侧链和获得所需的7-ACA，用合适的酶处理由此获得的N-酰化头孢菌素的水溶液。
优选地，使用固定化酶以便能重复使用酶。用于这种粒子的制备和酶的固定化的方法已在EP0222462中进行了大量描述。水溶液的pH值是，例如pH4至pH9，在这个范围内头孢菌素的降解反应被减少到最低并且所需的酶转化被优化。将酶加到头孢菌素的水溶液中同时通过例如加入无机碱如氢氧化钾溶液或采用阳离子交换树脂将pH维持在适当水平。当反应完成时，过滤除去固定化酶。另一种可能是，以一种固定化或流化床柱的形式应用固定化酶，或者以溶液的形式使用酶并且通过膜过滤除去产物。接着，将水溶液的pH调到2和5之间的值，优选地3和4之间。然后晶体7-ACA被滤掉。
合适的酶是，例如源自于在位置62、177、178和179的一个或多个位置上具有突变的假单胞菌SY77微生物。也可以使用来源于其它假单胞菌微生物，优选地假单胞菌SE83的酶，选择性地在相应于假单胞菌SY77的62、177、178和179位置的一个或多个位置上具有突变。
脱酰化也能以本技术领域已知的化学方法进行，例如，通过在低于10℃的温度下加入五氯化磷并接着在室温或低于室温的温度下加入醇如异丁醇来形成偕氯代亚胺侧链的方法。
在本发明的一个实施方案中，含有N-酰化7-ACA衍生物或脱酰化后得到的7-ACA的水溶液可以采用合适的酰化剂进行处理以便将可能存在于所述水溶液中的任何(酰基)-7-ADAC转化成相应的(酰基)-7-ACA衍生物。所述的酰化反应例如能通过采用乙酸酐，例如通过US5221739中公开的方法，或采用合适的脂酶或酯酶，例如EP667396中公开的方法来完成。
在进一步的步骤中，通过本发明方法获得的7-ACA化合物被用作制备多种头孢菌素抗生素的起始物，终产物以及中间体。通过采用公知的化学或酶促偶联方法，7-ACA的游离氨基例如可被任何合适的侧链所酰化，结果产生N-酰化7-ACA的衍生物。另外，在3’位置上可能发生取代反应。如此制备的头孢菌素化合物的实例是头孢氨噻、头孢唑琳、头孢曲松、头孢氨呋肟、头孢罗齐、头孢他定和头孢氯。
实施例1用于在产黄青霉中表达乙酰转移酶的pICG1WA、pICG2WA和pICG3WA构建体含有包括产黄青霉pcbC启动子和penDE终止子的野生型产黄支顶孢cefG基因的脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶(cefG)表达盒pICG1WA按照以下方法进行构建。cefG基因的N-末端部分，即ORF的第一个ATG的开端，是通过采用引物#1和#2(分别是SEQ ID NO1和2)的PCR反应从产黄支顶孢的染色体DNA中得到的。cefG基因的C-末端部分是通过采用引物#3和#4(分别是SEQ ID NO3和4)的PCR反应从相同的模板得到的。采用引物#1和#4以及上述片段作为模板进行融合PCR后，产生了一个完整的cefG基因(这里进一步表示为cefG1基因)，该cefG基因中缺失了内。SfiI和HimdIII位点而建立了一个新MsiI位点。
在下一个步骤中，pcbC启动子的第一部分是采用引物#5和#6(分别是SEQ IDNO5和6)PCR-扩增的，并且在采用引物#5和#4融合PCR后，被直接引入cefG1基因的前面。用PstI/NsiI消化后，一个1592bp片段被连接到一个4.3kb的pISEWA-N(以前在WO98/46772中描述的载体)的PstI/NsiI载体片段上从而产生青霉属转化载体pICG1WA。
构建pICG2WA所需要的cefG2基因的N-末端部分，即ORF的第二个ATG的开端，来源于采用引物#5和#7(SEQ ID NO7)的PCR反应中的pICG1WA。CefG2基因的C-末端部分来源于采用引物#8和#9(分别是SEQ ID NO8和9)的PCR反应中的相同模板。采用引物#5和#9和上述片段作为模板进行融合PCR后，就产生了完整的cefG2基因。
为了构建pICG3WA，其中cefG基因起始于第三个ATG，采用了与所述pICG2WA的构建相同的步骤。为了完成这一构建，采用了引物#5/#10(分别是SEQ ID NO5/10)和#11/#9(分别是SEQ ID NO 11/9)。
进行了内PstI/NcoI位点的消化后，cefG2/cefG3融合片段被连接到pICG1WA的PstI/NcoI载体片段上，产生了青霉属转化载体pICG2WA和pICG3WA。
实施例2不同ATG起始密码子选择对乙酰转移酶的表达的影响不同pICGWA构建体进行了NotI消化后，通过EP635574中描述的Ca-PEG介导的原生质体转化，将分离的cefG片段引进产黄青霉中。
所使用的产黄青霉菌株预先已用源自于产黄支顶孢的含有双功能延伸酶/羟基化酶编码序列(cefEF)的表达构建体进行了转化，该转化是在产黄青霉pcbC启动子和penDE终止子的调控下进行的。
所述片段用amdS共转化(EP635574)，其能够使产黄青霉转化体在含有作为唯一氮源的乙酰胺的选择培养基上生长。转化体通过在选择培养基上反复培养而得到纯化。单个稳定菌落被用于进一步筛查由PCR得到的cefG基因的存在通过测定转化体产生己二酰-7-ACA的能力，cefG阳性菌落被用于进一步筛查cefG的表达。
为此，转化体被接种到如WO95/04149所述的液体培养基中，补充了0.5-3mg/ml的己二酸钠作为制备试验的侧链前体。通过HPLC和NMR对生长良好的培养物滤液进行己二酰-7-ACA产量的分析。表1显示的结果清楚地表明，与含有起始于第一个ATG(表示为“ATG1”)或第三个ATG(表示为“ATG3”)的cefG的转化体相比，含有起始于ORF的第二个ATG(表示为“ATG2”)的cefG的转化体的己二酰-7-ACA产量有所增加。
表1结合了起始于第一个、第二个或第三个ATG的cefG编码序列的产黄青霉转化体的己二酰-7-ACA产率。
序列表<110>DSM N.V.<120>改进的头孢菌素的体内生产方法<130>乙酰转移酶<140><141><150>EP98204469.5<151>1998-12-22<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#1；5′5′cefG1，delta SfiI<400>1tgctgccgtc cgcccaagtg gcccgtctaa ag 32<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#2；3＇5′cefG1，delta HindIII<400>2aggcgacata tgggtgtcta gaaaaataat ggt 33<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #3；5′3＇cefG1，delta HindIII<400>3gacacccata tgtcgcctca gatcgcc 27<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#4；3′3′cefG1，引入NsiI<400>4cttttggaca cggatagctt agcctggatt gtc 33<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#5； 5′通用Pipns引物<400>5ccaggctaag ctatccgtgt ccaaaagtat tc32<210>6<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #6；3′5′cefG1引物<400>6tgcattggct cgtcatgaag agcctatcac attaatgact gatcgaggaa tcc53<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #7；3′5′cefG2引物<400>7cacacaggaa gagagctcag20<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#8；5′3′cefG2引物<400>8ggacggcagc atatgggtgt ctagaaaaat aatggt 36<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #9；3′通用cefG引物<400>9ccgcagcata tgggtgtcta gaaaaataat ggtg34<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220<223人工序列的描述引物 #10；3′5′cefG3引物<400>10gacacccata tgctgcggga tagcctcac 29<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物 #11；5＇3′cefG3引物<400>11aggcccattc cagagtgtgc 20
权利要求
1.一种生产7-ACA或其衍生物的方法，包括步骤在有合适的酰基侧链前体或其盐或其酯存在的条件下，对用含有编码延伸酶、羟基化酶和乙酰转移酶的核苷酸序列的表达构建体转化的产黄青霉菌株进行发酵，由此产生N-酰化7-ACA化合物，N-脱酰化如此产生的N-酰化7-ACA化合物，和任选地，酰化游离氨基和/或采用适合形成头孢菌素抗生素的侧链取代3’乙酸基，其特征在于编码乙酰转移酶的核苷酸序列源自于产黄支顶孢并且起始于出现在所述核苷酸序列中的可读框的第二个ATC。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述侧链前体选自由己二酸、3’-羧甲基硫代丙酸、3，3’-硫代二丙酸和反式-β-氢化粘康酸组成的一组物质。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述侧链前体是己二酸。
全文摘要
本发明公开了一种生产7－ACA或其衍生物的方法,包括步骤:在有合适的酰基侧链前体或其盐或其酯存在的条件下,对用含有编码延伸酶、羟基化酶和乙酰转移酶活性的核苷酸序列的表达构建体转化的产黄青霉菌株进行发酵,由此产生N－酰化7－ACA化合物,N－脱酰化如此产生的N－酰化7－ACA化合物,和任选地,酰化游离氨基和/或采用适合形成头孢菌素抗生素的侧链取代3’乙酸基,其特征在于编码乙酰转移酶的核苷酸序列源自于产黄支顶孢并且起始于出现在所述核苷酸序列中的可读框的第二个ATG。
文档编号C12R1/82GK1331751SQ99814782
公开日2002年1月16日 申请日期1999年12月21日 优先权日1998年12月22日
发明者R·A·L·博文博格, R·科克曼, E·科汉 申请人:Dsm公司