5)，该单糖峰在聚合物区域具有非常平坦的峰(保留时间为 9.22min处的峰2)。
[0506] 与图5中由AceeIIeraseK'「rio?所得的更高更宽的低聚物和聚合物峰相比，由纤 维素酶SC(下迹线）W及纤维素酶SC与化nisco Xylanase?联用（上迹线)所得的化CS水解产 物的典型的HPLC色谱图示出了葡萄糖峰、木糖峰和阿拉伯糖峰(见图6)。
[0507] 图5和图6示出纤维素酶SCW及纤维素酶SC与木聚糖酶联用生成的木糖峰值更低， 生成的葡萄糖峰值也更低。另一方面，在保留时间6.5至11.5min区域内，低聚物和聚合物的 含量较高。
[0508] 本发明人惊讶地发现，将水解产物用作饲料成分时(特别是用作单胃动物的饲料 成分时），降低木糖(及甚至葡萄糖)含量并增加低聚物和聚合物含量是有利的。
[0509] 本发明人发现，木糖不是单胃动物能量的有效来源，因为食用的木糖中有大约 50% W尿液形式排出。另一方面，低聚物和聚合物可被占据大肠的微生物群发酵成短链脂 肪酸，短链脂肪酸可被吸收进入血流并被动物用作能量来源。
[0510] 实例3的重量分析结果
[0511] 从下图7中根据酶反应之后所得残余生物质的重量减少可W看出，在纤维素酶SC 存在的情况下，内切木聚糖酶（例如Dan is CO Xy Ianas e?、Econase XT?、FoxXynA或 化巧yn6,或Danisco Xylanase?、Econase XT?的更高纯形式）的添加均增强了水解。图7中 示出的水解使用非工业加工条件W及更短时间进行，W适应小试规模测试的限制。因此，总 体水解程度是次优的，但仍然反映出当纤维素酶SC和内切木聚糖酶联用时水解得到改善。 [051引实例4对使用纤维素酶SC水解稀氨水处理的玉米賴杆化aCS) W及纤维素酶SC和内 切木聚糖酶(Danisco Xylanase?)剂量效应的进一步研究
[051引向表4列出的每个管中加入Ig DaCS,加入水和0.15ml IN肥1使容积达到12ml，混 匀。然后在50°C下加入50至20化1纤维素酶SC 118或50至20化1纤维素酶SC 118加上IOiil Danisco Xylanase?，开始反应，并W25化pm振荡40h。反应结束后，将管离屯、，并收集上清 液。分别使用4ml和3.5ml水通过重悬和离屯、洗涂沉淀两次。合并上清液，并通过添加额外的 水将体积调节至12ml。将合并的上清液(2ml)于100°C下放置IOmin使酶失活，然后离屯、并过 滤。使用HPLC分析滤液，进样量为1 Oiil。洗涂后的沉淀在80°C下干燥4她。
[0514]塾
[0516]实例4的重量分析结果
[0517] 从图8可W看出，DaCS的干物质含量为63.3% (左边第一列）。在50°C下，将DaCS在 使用HCl将抑调至5的水中溫育40h，16.0%干物质变为可溶（图9中左边第二列）。添加IOiil (93单位）内切木聚糖酶，使化CS的溶解度进一步增加至26.9%。单独添加纤维素酶SC118使 化CS的溶解度增加至41.7%。10山内切木聚糖酶与SOiil纤维素酶SC118组合，使化CS的溶解 度达到约51.7%，运表明木聚糖酶和纤维素酶SC具有加性效应。为达到由IOiil木聚糖酶与 SOiil纤维素酶SC联用得到的溶解度水平，需要单独添加3倍或更多的纤维素酶SC(150iil和 200iU)。结论是，对于化CS的增溶而言，5化1纤维素酶SC与IOiil内切木聚糖酶联用优于单独 添加50、100和15化1纤维素酶SC。对于干物质负荷为10% (w/v)的化CS,5化1纤维素酶SC加 上IOiil内切木聚糖酶是最佳的，因为100、150和20化1纤维素酶SC加上IOiil内切木聚糖酶不 会进一步增加溶解度。一般认为溶解度越高，体内消化率也越高。 巧引引 实例4的HPLC分析结果
[0519] 从图1〇可从看出，在未添加酶或添加10山（93单位)Danisco Xylanase?的情况下， DaCS的可溶性级分没有游离的葡萄糖。运表明由单独添加Danisco Xylanase?释放的 26.9%的可溶性物质大体上为低聚物和聚合物形式（图9)。向反应中添加剂量为50、100、 150至20化1纤维素酶SC,能够增加葡萄糖和木糖的释放，但增量与纤维素酶SC的剂量不成 线性关系（图10)。
[0520] 从图10中也可W看出，由SOul纤维素酶SC加上10山Danisco Xylanase?释放的葡 萄糖含量高于由IOOyl纤维素酶SC单独释放的葡萄糖含量；IOOiU纤维素酶SC加上IOiU Danisco Xylanase?的效果大致上等于单独150]il纤维素酶SC,并且150山纤维素酶SC加上 IOlil Danisco Xylanase?的效果大致上等于单独200山纤维素酶SC。
[0521] 结论是，很明显对于葡萄糖和木糖的释放，Danisco Xylanase?和纤维素酶SC具有 协同效应，因为由50山纤维素酶SC加上10山Danisco X^anase?释放的葡萄糖含量高于仅 由IOlil Danisco X^anase?释放的葡萄糖含量(基本上没有葡萄糖释放似及仅由50]il纤 维素酶SC释放的葡萄糖含量的总和(图10)。
[0522] 图11示出化CS酶解、接着离屯、和洗涂之后所得的12ml上清液中总的可溶性糖的浓 度。可W看出水解后主要的糖是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，次要组分是半乳糖和甘露糖。
[0523] 缉逆
[0524] 研究了不同纤维素酶制剂的糖释放。对于动物营养而言，商业酶组合，特别是生物 乙醇行业中那些用于分解木质纤维素生物质的酶组合，用于动物营养中是不理想的，主要 因为该类组合物会生成大量木糖。我们已经发现，单胃动物不能有效地消化并利用木糖。
[0525] 酶组合物至少具有W下活性：内切葡聚糖酶活性、0-葡萄糖巧酶活性和内切木聚 糖酶活性，其中酶组合物中不存在、或基本上不存在W下酶活性中的一者或两者:e-木糖巧 酶活性和aA-阿拉伯巧喃糖酶活性，该酶组合物被认为是降解木质纤维素生物质的同时生 产最适于用作动物饲料组合物或用作饲料原料的产品的最有效组合物。 邮26] 实例5:木糖作为肉鸡的能量来源
[0527] 本研究共使用了 240只Ross 308品系的雄性肉鸡（1日龄）。在解化时将鸡逐一称 重，并分成12组，每组包括5只体重均衡的鸡。然后将每组鸡称重，并将每组鸡圈养在笼中的 电加热化tersime层架式育维器上。第一周，分别将育维器和室溫设置为32°C和29°C。此后， 关闭育维器的热供应，但在整个实验过程中室溫始终维持在29°C。研究持续21天，在此期间 喂给鸡W下四种处理剂中的一种：1:基础饮食(基于玉米豆巧的饮食)+玉米淀粉25%，D-木 糖O % ; 2:基础饮食+玉米淀粉20 %，D-木糖5 % ; 3:基础饮食+玉米淀粉10 %，D-木糖15 % ; W 及4:基础饮食+玉米淀粉0 %，D-木糖25 %。整个研究中，为所有鸡提供新鲜水和饲料，使其 自由采食。研究期间，每周监测饲料食用量和鸡体重用于计算体重增加、随意采食量W及饲 料转化率。
[0528] 研究持续21天，但是在处理的14天后，由于饲喂处理剂4的鸡死亡率较高并有疾病 症状而将它们从研究中去除。基础饮食是玉米豆巧饮食。
[0529] 在研究的前14天，与饲喂所有其它处理剂的鸡相比，饲喂饮食中包含25%木糖的 鸡的饲料进食量和增重显著降低(P<〇.〇5)(见图12)。研究的第14天，将饲喂处理剂4的所有 鸡从研究中移除。此时，处理组(25 %木糖）的死亡率已经达到10 %，而且更多的鸡显示出定 向障碍、失明和身体颤抖等症状。
[0530] 饲喂处理剂饮食21天之后，与饲喂饮食中包含25%淀粉和0%木糖的鸡相比，饲喂 饮食中包含10%玉米淀粉和15%木糖的鸡的增重显著降低且饲料效率明显更差(P<0.05) (参见图13和图14)。饲喂饮食中包含5%木糖和20%玉米淀粉的鸡的增重和FCR位于其它两 种处理剂所得增重和FCR之间，但与两者均无显著差异。
[0531] 结论是，将饮食中25%能量源替换为木糖对肉鸡健康是有害的。对生长性能产生 显著不利效应之前，肉鸡似乎能够耐受饮食中添加高达5 %的木糖，然而，与对照饮食相比， 即使在饮食中添加5 %木糖，生长性能在数值上也会降低。 巧53引实例6使用Accel].erase@l5〇〇TM和Ecormse^XT?水解稀氨水处理的玉米賴杆 (DaCS)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)
[0533] 分别向8个容积为12ml的塑料管中加入Ig化CS和5ml MilliQ水，混匀。同样，向另 夕F8个容积为12ml的塑料管中加入Ig DLswg和5ml MilliQ水，混匀。将所有管于5°C下静置 过夜W确保化CS和化SWg良好水合。第二天加入15化1 IN肥1，将pH调至4.6至5.1。加入酶 (下表5中所列），开始反应。该反应于50°C、ISOrpm转速下振荡40h。收集反应时间化时的液 体样品（120iU)，使用12化1 MilliQ水稀释样品，保存于5°C下W备分析。酶反应结束时，在 收集的各样品中再加入24化lmilliQ水，然后在100°C水浴中加热5min，之后在10000Xg下 离屯、lOmin。随后过滤25化1上清液，并将IOiil滤液进样到HPLC中进行分析。过滤1 % (w/v)的 葡萄糖和木糖标准物，使用与"材料和方法"部分所述相同的条件和进样量进行HPLC分析。
[0534] 表 5
[0535]
[0537] Acccllerasc;" 1500是可得自化1113(3〇(现属于0证〇]11:)的商业酶，并且具有某些纤维 素酶活性例如内切葡聚糖酶活性、e-葡萄糖巧酶活性，W及某种半纤维素酶活性例如内切 木聚糖酶活性。
[053引 Ec0n:ase?XT 5P是可得自AB Vis化的商业酶，具有内切1-处木聚糖酶活性。
[0539] 结果
[0540] 结果表明向经稀氨水预处理的玉米賴杆和苛性脱木质化柳枝稷中添加 AccelIerase 1' 1 5 0 0 TM和Econase" X T 5 P对甸萄糖的释放具有协同效应，因为由 Accdlerase? i5〇〇?(〇.3ml/g)和Econ游e?XT 5P( 1.4mg/g DM)联用释放的葡萄糖多于由 每种酶单独释放的葡萄糖（表6)。在运一实例中，通过加入Aeeellerase" 1500?和 Eeomise'i^XT 5P而提供的内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性W及0-葡萄糖巧酶活性的 组合使得葡萄糖大量释放，运与加入Accelle化se? Tr i O?的结果类似。Accellerase? 1500?和5獻朋旅@乂了 5P的组合使得木糖释放显著减少，因为与Accenerase"Tri〇?相比， 该酶组合不存在大量〇寸-阿拉伯巧喃糖酶活性和0-木糖巧酶活性。 巧541 ]表6.使用Accell知锻e@hi〇?、Accellerase'K 1500?和Econa旅@XT 5P水解经稀 氨水预处理的玉米賴杆(DAcs)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)时木糖和葡萄糖的释放。
[0543] 1 DAcs-经稀氨水预处理的玉米賴杆
[0544] 2 DLswg-苛性脱木质化柳枝稷
[0545] n.d.-未检出 巧546]实例7使用 Cdluclast?、DaniscoXylanaseTM和AcceUerase?'BG?水解稀氨水处理 的玉米賴杆(DaCS)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)
[0547] 分别向12个容积为12ml的塑料管中加入Ig化CS和5ml MilliQ水，混匀。同样，向 另外12个容积为12ml的塑料管中加入Ig DLswg和5ml MilliQ水，混匀。将所有管于5°C下静 置过夜W确保化CS和化SWg良好水合。第二天加入15化1 IN HCl，将抑调至4.6至5.1。加入 酶（下表7中所列），开始反应。该反应于50°C、ISOrpm转速下振荡40h。收集反应时间化时的 液体样品（120iil)，使用12化1 MilliQ水稀释样品，保存于5°C下W备分析。酶反应结束时， 在收集的各样品中再加入24化lmilliQ水，然后在100°C水浴中加热5min，之后在10000Xg 下离屯、lOmin。随后过滤250iU上清液，并将10山滤液进样到HPLC中进行分析。过滤l%(w/v) 的葡萄糖和木糖标准物，使用与"材料和方法"部分所述相同的条件和进样量进行HPLC分 析。
[054引 表7.
[0549]
[0551] Celluclast?是可得自Sigma-Al化ich的商业酶(C2730)，具有某些纤维素酶活性， 例如内切葡聚糖酶活性和e-葡萄糖巧酶活性。
[0552] Danisco Xylanase?是得自化nsico(现属于D证ont)的商业酶并且具有内切木聚 糖酶活性。
[0巧3] Accel Ierase'、BG?是可得自Dani SCO (现属于DuF*ont)的商业酶并且具有0-葡萄糖 巧酶活性。
[0554] ^
[055引结果显示向经稀氨水预处理的玉米賴杆和苛性脱木质化柳枝稷中添加 仁eUuekst?、.Danisco Xylanase?和A妨elle樹S:e?BG?对葡萄糖的释放具有协同效应，因 为由 Celluclast" (O.lml/g DM)'Danisco Xylanase?(3.5iil/g DM)和 Accellerase@BG? (0.15ml/g DM)的组合所释放的葡萄糖多于由每种酶单独释放的葡萄糖或仅由两种酶组合 所释放的葡萄糖（表8)。在运一实例中，通过加入Celluciast'i9、Danisco Xylanase?和 Aeeellerase?BG?而提供的内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性W及(6-葡萄糖吉^活性 的组合得到了与Aee.础erase? T r i O T M类似的葡萄糖释放。G过IucJ as护、.D a n i S C O X}danase?和Accellerase^^G?的组合使得木糖释放显著减少，因为与Accellerase@hi0? 相比，该酶组合中不存在大量0寸-阿拉伯巧喃糖酶活性和e-木糖巧酶活性。
[0 巧 6] 表8 使用 Accellerase" TripTM、Celluclast'、、Pan i sco Xy lanase^^l^^ Accellerase k'BG?水解经稀氨水预处理的玉米賴杆(DAcs)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg) 时木糖和葡萄糖的释放。
[0巧引1 DAcs-经稀氨水预处理的玉米賴杆
[0559] 2 DLswg-苛性脱木质化柳枝稷
[0560] n.d.-未检出
[056。 实例8使用来自黑曲霉的纤维素酶（Sigma C1184)和Accellerase'"BG?水解经稀 氨水处理的玉米賴杆(DaCS)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)
[0562] 分别向6个容积为12ml的塑料管中加入Ig化CS和5ml MilliQ水，混匀。同样，向另 夕F8个容积为12ml的塑料管中加入Ig DLswg和5ml MilliQ水，混匀。将所有管于5°C下静置 过夜W确保化CS和化SWg良好水合。第二天加入15化1 IN肥1，将pH调至4.6至5.1。加入酶 (下表9中所列），开始反应。该反应于50°C、ISOrpm转速下振荡40h。收集反应时间化时的液 体样品（120iU)，使用12化1 MilliQ水稀释样品，保存于5°C下W备分析。酶反应结束时，在 收集的各样品中再加入24化lmilliQ水，然后在100°C水浴中加热5min，之后在10000Xg下 离屯、lOmin。随后过滤25化1上清液，并将IOiil滤液进样到HPLC中进行分析。过滤1 % (w/v)的 葡萄糖和木糖标准物，使用与"材料和方法"部分所述相同的条件和进样量进行HPLC分析。
[0563]塾
[0566] 来自黑曲霉的纤维素酶是可得自Sigma-Aldrich的商业酶(C1184)，并具有某些纤 维素酶活性，例如内切葡聚糖酶活性，W及内切木聚糖酶活性。
[0567] Acc谢eras:e?BG?是可得自化ni SCO (现属于D证ont)的商业酶并且具有0-葡萄糖巧 酶活性。
[0568] 缉里
[0569] 结果表明向经稀氨水预处理的玉米賴杆和苛性脱木质化柳枝稷中添加来自黑曲 霉的纤维素酶和A(xellerase?BG?对葡萄糖的释放具有协同效应，因为由来自黑曲霉的纤 维素酶和Aeeellerase?BG?联用释放的葡萄糖多于由每种酶单独释放的葡萄糖(表10)。在 运一实例中，通过加入来自黑曲霉的纤维素酶和Aee过leras:e?BG?而提供的内切葡聚糖酶 活性、内切木聚糖酶活性W及e-葡萄糖巧酶活性的组合得到了与Aeedlerase?Tri〇?类似 的葡萄糖释放。来自黑曲霉的纤维素酶和Aeeellerase'KBG?的组合使得木糖释放显著减 少，因为与Aee如erase?Tri〇?相比，该酶组合中不存在大量〇-心阿拉伯巧喃糖酶活性和 0-木糖巧酶活性。
[0570] 表10使用Ac:cellemse@hi〇?、来自黑曲霉的纤维素酶和Accellerase'K 1犯?水解 经稀氨水预处理的玉米賴杆(DAcs)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)时木糖和葡萄糖的释 莖。
[0573] 1 DAcs-经稀氨水预处理的玉米賴杆
[0574] 2 DLswg-苛性脱木质化柳枝稷
[0575] W上说明书中提到的所有出版物W引用的方式并入本文。本领域的技术人员应当 能够理解，可在不脱离本发明的范围和精神的前提下，对本发明所述方法和体系进行不同 修改和更改。虽然已结合特定的优选实施例对本发明进行了描述，但应该理解，所要求保护 的本发明不应不当地局限于运些特定的实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关 领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的不同修改形式也应该在W下权 利要求书范围内。
【主权项】
1. 一种制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括： a. 用物理和/或化学和/或生物方法预处理木质纤维素生物质； b. 将经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质与酶组合物混合，其 中所述酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖 酶活性，并且其中所述酶组合物不具有、或基本上不具有木糖苷酶活性，并且/或者不具 有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性； c. 将所述木质纤维素生物质与所述酶组合物的混合物温育至少约3至120小时； d. 以及任选地进行干燥和/或任选地进行包装。2. -种酶组合物的用途，其中在制造用于提高木质纤维素生物质对动物的营养价值的 饲料添加剂组合物的过程中，所述酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、葡萄 糖苷酶活性以及内切木聚糖酶活性，并且其中所述酶组合物不具有、或基本上不具有木 糖苷酶活性，并且/或者不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法或用途，其中所述酶组合物还具有以下酶活 性中的一者或两者:纤维二糖水解酶I活性和纤维二糖水解酶II活性。4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述酶组合物还具有溶解性多 糖单加氧酶活性。5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述方法还包括给动物饲喂所 述饲料添加剂组合物。6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述木质纤维素生物质为任意 纤维素或木质纤维素材料，例如农业残余物、生物能作物、工业固体废物、市政固体废物、来 自造纸的淤渣、庭院废物、木材废物、林业废物以及它们的组合。7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述木质纤维素生物质选自玉 米棒、作物残余物诸如玉米皮、玉米秸杆、草、甜菜浆、小麦秸杆、小麦壳、燕麦秸杆、小麦次 粉(wheat middlings)、小麦粉头(wheat shorts)、米糠、稻壳、小麦糠、燕麦壳、棕榈仁、柑 橘渣、棉花、木质素、大麦秸杆、干草、稻杆、稻壳、柳枝稷、芒草、大米草、草芦、纸废弃物、甘 蔗渣、高粱蔗渣、饲用高粱、高粱秸杆、大豆秸杆、大豆、粉碎树木获得的组分、树枝、根、叶、 木肩、锯末、灌木和灌木丛、蔬菜、水果和花。8. -种饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物能够通过根据权利要求1至7中任一 项所述的方法或用途获得(例如，已获得）。9. 一种饲料添加剂组合物或饲料成分，所述饲料添加剂组合物或饲料成分包含由酶组 合物水解的经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质，其中所述酶组合 物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且不 具有、或基本上不具有木糖苷酶活性，并且/或者不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋 喃糖酶活性。10. -种饲料或饲料原料，所述饲料或饲料原料包含根据权利要求9所述的饲料添加剂 组合物或饲料成分，或者能够通过权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(优选地 已获得)的饲料添加剂组合物。11. 一种预混物，所述预混物包含根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物或饲料成 分、或者能够通过权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(优选地已获得)的饲料添 加剂组合物、以及至少一种矿物质和/或至少一种维生素。12. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途还包括使饲 料组分与所述饲料添加剂组合物接触的步骤。13. -种制备饲料原料的方法，所述方法包括使饲料组分与根据权利要求9所述的饲料 添加剂组合物或饲料成分，或者能够通过权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得 (优选地已获得)的饲料添加剂组合物接触。14. 一种用于改善动物的生物物理特性的方法，所述方法包括将能够通过权利要求1至 7中任一项所述的方法或用途获得(例如，已获得)的饲料添加剂组合物、或者根据权利要求 9所述的饲料添加剂组合物、或者根据权利要求11所述的预混物、或者根据权利要求10所述 的饲料原料、或者能够通过根据权利要求13所述的方法获得(例如，已获得）的饲料原料施 用于动物。15. 能够通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(例如，已获得）的饲 料添加剂组合物、或者根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物、或者根据权利要求11所述 的预混物、或者根据权利要求10所述的饲料原料、或者能够通过权利要求1所述的方法获得 (例如，已获得)的饲料原料用于改善动物的生物物理特性的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括：(a)用物理和/或化学和/或生物方法预处理木质纤维素生物质；(b)将经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质与酶组合物混合，其中所述酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且其中所述酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性，并且/或者不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性；(c)将所述木质纤维素生物质与酶组合物的混合物温育至少约3至120小时；(d)以及任选地进行干燥和/或任选地进行包装。
【IPC分类】A23K20/189, A23K10/10, A23K10/32
【公开号】CN105517450
【申请号】CN201480045781
【发明人】米兰 L·F·罗密欧, S·于, M·沃尔什, S·兰茨, C·米奇森, B·鲍尔, S·阿伦特
【申请人】杜邦营养生物科学有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年6月19日
【公告号】EP3013155A1, WO2014202716A1