专利名称：脂肪组织衍生的基质细胞的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于使体外培养的脂肪衍生的基质细胞定向分化成软骨细胞谱系的细胞的方法和组合物，且本发明特别涉及在将软骨细胞谱系的细胞植入受体或宿主之前或同时这类定向谱系用于治疗人体或其它物种中的疾病的诱导作用。
间充质干细胞(MSCs)是在能够分化成特异性类型的间充质或结缔组织包括脂肪、骨、软骨、弹性结缔组织、肌肉结缔组织和纤维结缔组织的骨髓、血液、真皮和骨外膜中发现的形成多能胚细胞或胚胎样细胞。这些细胞进入的特异性分化途径取决于来自机械性影响和/或由宿主组织确立的内源性生物活性因子诸如生长因子、细胞因子和/或局部微环境条件的各种影响。
在出生前的生物体中，可以充分确定MSCs分化成特定的结缔组织细胞；例如，胚胎鸡、鼠或人肢芽间充质细胞分化成软骨、骨和其它结缔组织(CaplanA I(1981):39th Annual Symposium of the Society for DevelopmentalBiology，由S.Subtelney和U.Abbott编辑，pp 3768,New York,Alan R LissInc.；Elmer等(1981)Teratology,24:215-223；Hauschka S.D.(1974)Developmental Biology(1974)37:345-368；Solursh等(1981)Developmental Biology,83:9-19；Swalla等(1986)DevelopmentalBiology,116:31-38)。此外，已经证实克隆鼠胎颅盖细胞系可分化成肌肉、脂肪、软骨和骨(Goshima等(1991)Clin.Orthop.Rel.Res.269:274-283)。还没有对出生后生物体中存在的MSCs进行目的在于证明胚后期细胞分化成几种中胚层表型的广泛研究。已经进行的少数研究包括由骨髓细胞在其在扩散室中套装(encasement)并在体内移植后形成骨和软骨(Ashton等(1980)Clin.Orthop.Rel.Res.151:294-307；Bruder等(1990)Bone Mineral,11:141-151,1990)。近来，已经从鸡骨外膜中分离出了细胞、将其平展在培养基中并且在体外高密度的条件下证实了它们可分化成软骨和骨(Nakahara等(1991)Exp.Cell Res.,195:492-503)。已经证实鼠骨髓衍生的间充质细胞在植入体内时具有分化成成骨细胞和软骨细胞的能力(Dennis等(1991)Cell Transpl.,1:2332；Goshima等(1991)Clin.Orthop.Rel.Res.269:274-283)。由Johnstone等在美国专利5,908,784中所做的工作证实了来源于皮肤的间充质细胞有分化成类似于软骨细胞的生物化学和表型细胞的能力。
成年人骨髓微环境是这些假拟间充质干细胞的潜在来源。自成年人骨髓分离的细胞有不同的名称包括基质细胞、基质干细胞、间充质干细胞(MSCs)、间充质成纤维细胞、网状-内皮细胞和Westen-Bainton细胞(Gimble等(1996年11月)Bone 19(5):421-8)。体外研究已经确定这些细胞可以沿多中胚层或间充质谱系途径分化。这些细胞包括但不限于脂肪细胞(Gimble等(1992)J.Cell Biochem.50:73-82)、软骨细胞(Caplan等(1998)J.Bone JointSurg.Am.80(12):1745-57)、造血支持细胞(Gimble等(1992)J.CellBiochem.50:73-82)、肌细胞(Prockop等(1999)J.Cell Biochem.72(4):570-85)、肌细胞(Charbord等(1999)Exp.Hematol.27(12):1782-95)、和成骨细胞(Beresford等(1993)J.Cell Physiol.154:317-328)。已经将骨髓用作再生骨、软骨、肌肉、脂肪组织和其它间充质衍生器官的基质干细胞的来源。对这些细胞的用途的主要限制在于进行骨髓活检过程时的困难和危险附属物、并且来自这种来源的干细胞的产率低。
脂肪组织为作为多能基质干细胞来源的骨髓提供了另一种选择。脂肪组织使用方便且在许多个体中蕴含丰富。在美国肥胖属于表皮部分的疾病，其中超过50％的成年人超过了根据其身高推荐的BMI。通过以门诊病人为主进行脂肪抽吸来收集脂肪细胞。对于广大患者来说，这是一种可接受的具有整容效果的相对非侵染性方法。已经有足够的资料证明脂肪细胞是一种可再充满的细胞群体。甚至在使用脂肪抽吸和其它过程的外科手术去除后，通常仍然可以观察到脂肪细胞在一段时间内在个体中再生。这提示脂肪组织中含有能够自我更新的基质干细胞。
病理性证据提示脂肪衍生的基质细胞能够沿多间充质谱系分化。大多数常见的软组织瘤(脂质肉瘤)是从脂肪细胞样细胞发展而来。混合来源的软组织瘤相对常见。它们可以包括脂肪组织、肌肉(平滑肌或骨骼肌)、软骨和/或骨的成分。在骨髓内仅作为骨成形细胞的细胞可以分化成脂肪细胞或脂肪的细胞，髓外脂肪细胞能够形成成骨细胞(Halvorsen WO 99/28444)。
软骨是一种多水结构，它具有的水含量占其重量的70％-80％。剩余的20％-30％包括Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖。胶原蛋白通常占软骨干重的70％(在“Pathology”(1988)中，Rubin和Farber编辑，J.B.Lippincott Company,PA.pp.1369-1371)。蛋白聚糖由从其中伸展多糖类长链的中央蛋白核心组成。这些称作糖胺聚糖类的多糖类包括软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐和硫酸角质素。软骨具有特征性结构组织，它由分散在内源性产生和分泌的胞外基质内的软骨形成细胞组成。含有软骨细胞的基质中的腔称作软骨腔隙。与骨不同，软骨既不受神经支配也不能被血管或淋巴系统透入(Clemente(1984)在“Gray’s Anatomy,30 sup.th Edit”中所述，Lea & Febiger)。
有三类软骨存在于哺乳动物中，包括透明软骨、纤维软骨和弹性软骨(Rubin和Farber，见上文)。透明软骨由带有坚固、弹性密度的软骨团组成，它是半透明的且显珠光蓝色。透明软骨主要在接合关节的接合表面上发现。在骺板、肋软骨、气管软骨、支气管软骨和鼻软骨中也可以发现它。纤维软骨除含有可增加软骨抗张强度的Ⅰ型胶原蛋白原纤维外，基本上与透明软骨相同。胶原纤维呈束状排列，在束间存在有软骨细胞。通常在椎间盘的纤维环、腱和韧带嵌入物、半月板、耻骨联合和关节囊嵌入物中发现纤维软骨。弹性软骨除含有弹性蛋白纤维外也类似于透明软骨。它比透明软骨更不透明且更柔韧和更易弯曲。由软骨基质中包埋的弹性纤维来部分地确定这些特征。一般来说，在耳部的耳廓、会厌和喉中存在弹性软骨。
哺乳动物关节中接合骨的表面被关节软骨覆盖。关节软骨可防止相对骨表面的直接接触并允许接合骨相互之间的接近无摩擦的运动(Clemente，上文)。通常在哺乳动物中观察到两类关节软骨的缺损，它们包括全厚度和部分厚度的缺损。两类缺损不仅在物理性损害的程度上而且在各类损害引起的修复反应的性质上不同。
全厚度关节软骨缺损包括对关节软骨、潜在的软骨下骨组织和位于关节软骨与软骨下骨之间的软骨钙化层的损害。全厚度缺损通常在严重的关节外伤过程中或在变性关节疾病的晚期阶段、例如骨关节炎过程中产生。由于软骨下骨组织受神经支配并血管化，所以对这种组织的损伤经常发生疼痛。由对软骨下骨损伤所诱发的修复反应通常导致在全厚度缺损部位处形成纤维软骨。然而，纤维软骨缺乏关节软骨的生物机械特性且不能够在关节中长时间持续存在。
部分厚度的关节软骨缺损受到软骨组织自身的限制。这些缺损通常包括软骨接合表面中的裂隙或裂口。部分厚度缺损由诱发关节内软骨组织磨损的关节的机械性排列所导致。在没有神经支配和血管系统的情况下，部分厚度缺损不会引起修复反应且因此不会趋向于愈合。尽管没有痛苦，但是部分厚度缺损经常变性成全厚度缺损。
根据本发明，本发明者已经观察到当人脂肪组织衍生的基质细胞与三维形式相关时，如果它们与某种软骨诱导剂或因子体外接触，它们则可以用于沿软骨形成途径分化。三维形式对于本发明的体外软骨形成来说是关键的，且细胞-优选聚在一起的，例如是作为压紧或沉淀的细胞团的形式或处于藻酸盐基质中。本发明提供了用于沿软骨细胞谱系分离、分化和表征成年人胞外脂肪组织基质细胞的方法和组合物的实例，及其用于治疗大量人体疾患和疾病的用途的概要。认为这一体外过程再现了体内发生的情况且可以将它用于促进哺乳动物体内软骨的修复。
本发明提供了用于将来源于皮下、乳房、生殖腺或网膜的脂肪组织的基质细胞持续和定量诱导成全功能性软骨细胞的方法和组合物。该方法包括下列步骤培养所分离的脂肪组织衍生的基质细胞、以500-20,000个细胞/cm2的密度在以化学方式确定的培养基中将其铺平板，该培养基含有下列成分或用下列成分进行了补充(1)能够激活可产生成熟软骨细胞表型的任何细胞转导途径的软骨诱导剂；(2)抗菌素；(3)营养补充剂诸如胎牛血清或马血清；(4)抗坏血酸或相关的维生素C类似物以及(5)糖皮质激素或能够激活细胞糖皮质激素受体的另一种化学剂。
本发明还提供了一种用于使脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的方法，即通过在诸如DMEM或α-MEM或RPMI 1640这样的培养基中沉淀基质细胞、并用下列成分补充所述培养基(1)能够激活可产生成熟软骨细胞表型的任何细胞转导途径的软骨诱导剂；(2)抗菌素；(3)营养补充剂诸如胎牛血清或马血清；(4)抗坏血酸或相关的维生素C类似物以及(5)糖皮质激素或能够激活细胞糖皮质激素受体的另一种化学剂。
本发明还提供了一种通过在海藻酸钙或能够以三维构造支撑软骨形成的其它生物相容性晶格或基质中悬浮细胞而使脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的方法。
本发明提供了用于测定这些培养条件和试剂对于脂肪组织衍生的基质细胞分化和功能的能力、用于将携带调节基因的病毒载体转导入所述基质细胞、用于将携带调节基因的病毒载体转染入所述基质细胞、用于追踪和检测由这些基因编码的功能性蛋白、和用于开发重新将这些细胞引入生物有机体的生物机械性载体的方法。
本发明进一步提供了用于将这些软骨细胞引入用于修复的软骨缺损区域的方法。
本方法和组合物已经用于与分化细胞相关疾病状态和创伤损害有关的化合物和蛋白质的药物开发，所述的创伤损害包括但不限于前交叉韧带撕裂、全厚度关节软骨缺损、部分厚度关节软骨缺损。
附
图1表示来自单层培养物的人体脂基持细胞中Ⅱ型胶原蛋白的免疫检测。在上部一组实验对象中使用相差显微镜；在下部一组实验对象中使用免疫荧光。
附图2表示来自沉淀培养物的人体脂肪基质细胞中Ⅱ型胶原蛋白的免疫检测。在上部一组实验对象中使用相差显微镜；在下部一组实验对象中使用免疫荧光。
附图3表示来自藻酸盐培养物的人体脂肪基质细胞中Ⅱ型胶原蛋白的免疫检测。在上部一组实验对象中使用相差显微镜；在下部一组实验对象中使用免疫荧光。
附图4表示在不含β-TGF(对照)和含有β-TGF的藻酸盐基质中培养细胞2周时的Ⅵ型胶原蛋白的表达情况。
附图5表示当细胞作为单层或在藻酸盐悬浮液中生长时用于表达不同蛋白质包括Ⅵ型胶原蛋白、连接物、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原蛋白和肌动蛋白的蛋白质印迹结果。
本发明提供了用于将脂肪组织衍生的基质细胞分化和培养成软骨细胞的方法和组合物。由本发明方法生产的细胞用于提供治疗人体疾病和创伤损害修复的组织工程产品的研究、移植和开发的完全分化和功能性细胞的来源。因此，一方面，本发明提供了用于使脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的方法，该方法包括在含有能够支持基质细胞生长并分化成功能性软骨细胞的培养基的组合物中培养基质细胞的步骤。本发明进一步提供了用于将这些软骨细胞引入进行修复的软骨缺损区域的方法。
“脂肪基质细胞”指的是来源于脂肪组织的基质细胞。所谓“脂肪”指的是任何脂肪组织。脂肪组织可以是棕色或白色的脂肪组织，它来源于皮下、网膜/内脏、乳房、生殖腺或其它脂肪组织部位。优选的情况是，所述的脂肪组织是皮下白色脂肪组织。这类细胞可以含有原代细胞培养物或无限增殖化细胞系。所述的脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。优选的情况是，所述的脂肪组织是哺乳动物的脂肪组织；最优选的情况是，所述的脂肪组织是人体脂肪组织。脂肪组织的方便的来源是来自脂肪抽吸手术，然而，脂肪组织的来源或分离脂肪组织的方法对于本发明来说并不关键。如果需要基质细胞自身植入受试者，那么将从该受试者中分离脂肪组织。
“软骨细胞”(软骨的细胞)指的是能够表达软骨细胞的特征生物化学标记的细胞，其包括但不限于Ⅱ型胶原蛋白、硫酸软骨素、硫酸角质素和平滑肌的特征形态标记，这些细胞包括但不限于培养物中观察到的圆形形态的细胞；“软骨细胞”还指能够分泌Ⅱ型胶原蛋白的细胞，包括但不限于生成具有体外软骨的血液动力特性的组织或基质的细胞。
可以使用在组织培养物中能够支持基质细胞的任意培养基。支持成纤维细胞生长的培养基配方包括但不限于Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、α改进的极限必需培养基(αMEM)或Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI培养基1640)等。一般来说，将0-20％的胎牛血清(FBS)或1-20％的马血清加入到上述培养基中以便支持基质细胞和/或软骨细胞的生长。然而，如果鉴定用于基质细胞和软骨细胞的FBS中的必需生长因子、细胞因子和激素并在生长培养基中提供合适的浓度，那么可以使用所定义的培养基。用于本发明方法中的培养基可以含有一种或多种有意义的化合物，但不限于用于基质细胞的抗菌素、促有丝分裂或分化的化合物。使所述的细胞在31℃-37℃下在一种加湿培养箱中生长。将二氧化碳的含量维持在2％-20％的范围并将氧气含量维持在1％-22％的范围。细胞将在该环境中保持达4周的期限。
可以补充入所述培养基的抗菌素包括但不限于青霉素和链霉素。在以化学方式确定的培养基中青霉素的浓度约为10-约200单位/ml。以化学方式确定的培养基中链霉素的浓度约为10-约200μg/ml。
可以用于本发明的糖皮质激素包括但不限于氢化可的松和地塞米松。培养基中地塞米松的浓度约为1-约100nM。培养基中氢化可的松的浓度约为1-约100nM。
本文所用的术语“软骨诱导剂”或“软骨诱导因子”指的是天然或合成的有机或无机化学或生物化学化合物或化合物的组合物或混合物，或可施用于人体脂肪组织衍生的基质细胞以便使其在体外产生软骨形成诱导作用或产生软骨细胞的任何机械或其它物理的装置、容器、影响或力量。该软骨诱导剂优选分别或以混合方式选自下列物质组成的组(ⅰ)糖皮质激素诸如地塞米松；(ⅱ)β-转化生长因子超家族中的一个成分诸如骨形态发生蛋白(优选BMP-2或BMP-4)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFBF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFBF)、肝细胞生长因子(HGF)、角膜细胞生长因子(KGF)、成骨蛋白(OP-1、OP-2、和OP-3)、抑制素A和软骨形成刺激活性因子(CSA)；(ⅲ)胶原胞外基质的成分诸如胶原蛋白Ⅰ(特别是凝胶形式)；和(ⅵ)维生素A类似物诸如视黄酸；以及(ⅴ)抗坏血酸或其它相关维生素C类似物。
β-转化生长因子的浓度约为1-约100ng/ml。视黄酸的浓度约为0.1-约1μg/ml。
属于基质细胞促细胞分裂剂化合物的实例包括但不限于β-转化生长因子；成纤维细胞生长因子；骨形态发生蛋白和基质细胞分化因子包括但不限于地塞米松、氢化可的松、β-转化生长因子、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白等。
优选的情况是，从引入最终分化细胞的受试者的脂肪组织中分离脂肪组织衍生的基质细胞。然而，也可以从作为受试者的相同或不同物种的任何生物体中分离所述的基质细胞。具有脂肪组织的任何生物体可以是潜在的候选者。优选的情况是，所述的生物体是哺乳动物，最优选所述的生物体是人。
本发明还提供了一种用于通过在能够以三维构造支撑软骨形成的海藻酸钙或另一种生物相容性晶格或基质中悬浮细胞而使脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的方法。晶格物质的实例包括(1)海藻酸钙、它是一种交联的L-葡糖醛酸和D-甘露糖醛酸的多糖、浓度为1％-4％；(2)纤维蛋白；(3)Ⅱ型胶原蛋白；或(4)琼脂糖凝胶。将含有细胞的晶格或基质转入培养皿中，所述的培养皿中含有(1)可以激活产生成熟软骨细胞表型的任何细胞转导途径的软骨诱导剂；(2)抗菌素；(3)营养补充剂诸如胎牛血清或马血清；(4)抗坏血酸或相关维生素C类似物；和(5)糖皮质激素或能够激活细胞糖皮质激素受体的另一种化学剂。
可以使用质粒、病毒或可选择戴体的策略，用一种有意义的核酸稳定或暂时性地转染或转导脂肪组织衍生的基质细胞。有意义的核酸包括但不限于那些促进软骨中发现的胞外基质成分产生的编码基因产物；实例包括β-转化生长因子、骨形态发生蛋白、活化素和胰岛素样生长因子。
可以用由氯化铯显带法或其它按10∶1-2000∶1多重性感染(病毒单位细胞)的方法纯化的病毒载体(腺病毒、反录病毒、与腺相关的病毒或其它载体)来进行将携带调节基因的病毒载体转导入所述基质细胞的过程。使细胞在没有或有阳离子去污剂诸如聚乙烯亚胺或LipofectamineTM存在的情况下、在不含血清或含有血清的培养基中与病毒接触1小时至24小时的期限(Byk等(1998)Human Gene Therapy 9:2493-2502；Sommer B.等(1999)Calcif.Tissue Int.64:45-49)。
通过使用磷酸钙DNA沉淀法或阳离子去污剂法(LipofectamineTM,DOTAP)可以将携带调节基因的质粒载体转染入单层培养物中的细胞或通过直接将质粒DNA载体加入生物相容性聚合物中而将携带调节基因的质粒载体转染入三维培养物中(Bonadio J.等(1999)Nat.Med.5:753-759)。
为了追踪和检测由这些基因编码的功能性蛋白质，病毒或质粒DNA载体将含有易于检测的标记基因诸如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶，两者均可以用组织化学方法追踪。
对于开发用于将基质细胞重新引入生物体的生物机械性载体来说，所述的载体包括但不限于海藻酸钙、琼脂糖、Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型或其它胶原蛋白同种型、纤维蛋白、聚-乳酸/聚-乙醇酸、透明质酸盐衍生物或其它物质(Perka C.等(2000)J.Biomed.Mater.Res.49:305-311；Sechriest VF.等(2000)J.Biomed.Mater.Res.49:534-541；Chu CR.等(1995)J.Biomed.Mater.Res.29:1147-1154；Hendrickson DA.等(1994)Orthop.Res.12:485-497)。
本发明的另一个目的是提供用于鉴定和研究可促进脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的化合物。促进分化的化合物在治疗部分或完全软骨缺损、骨关节炎、外伤性软骨、包括腭裂或隔膜偏离在内的先天性缺损的整容手术中是有价值的。方法包括但不限于开发体外三维培养物，该培养物可维持脂肪组织衍生的基质细胞作为软骨细胞，这些细胞随后可与有价值的新型化合物接触。
可以检测任意化合物的影响脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的能力。与所试验化合物相容的合适载体对于本领域技术人员来说是公知的且可以在最新版本的《Remington’s药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)(1995,Mack Publishing Co.,Easton,PA)中找到，将该文献的内容引入本文作为参考。
参照下列实施例可以更清楚地理解本发明的特征和优点，这些实施例不用来限定本发明。实验部分脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞实施例1使用地塞米松的体外软骨形成按照于1999年1月29日提交的顺序号为09/240,029号申请“人体前脂肪细胞分化成软骨细胞的方法和组合物”中所述的方法从人体皮下脂肪组织中分离基质细胞。以500-20,000个细胞/cm2的密度将这些细胞铺平板。本发明关注的是体外生成的前软骨凝聚作用促进了来源于人体脂肪组织的间充质远祖细胞内的软骨形成。通过下列方法来完成上述过程，所述的方法包括但不限于(1)使用开发的含有分离的生长平板细胞的沉淀培养物系统，(Kato等(1988)PNAS 85:9552-9556；Ballock & Reddi,J.Cell Biol.(1994)126(5):1311-1318)且已经将该系统用于维持放入培养物中的软骨细胞的软骨表型的表达(Solursh(1999)J.Cell Biochem.45:258-260)。
(2)藻酸盐悬浮法，其中将细胞维持在海藻酸钙悬浮液中以便防止细胞-细胞接触并维持圆形形态特征，从而促进软骨细胞表型的维护和获取。
如上所述分离人体脂肪组织衍生的细胞。对于沉淀培养物来说，将等份的200,000个细胞在无菌的15ml圆锥形聚丙烯试管内的DMEM中以500g离心10分钟，所述的DMEM中含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗坏血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)；然后在37℃下和5％CO2培养箱中培养达3周。对于藻酸盐培养物来说，以每ml 1百万个细胞的密度将细胞悬浮在1.2％海藻酸钙中并维持在含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗坏血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)的DMEM中，然后在37℃下和5％CO2培养箱中培养达3周。2-4周后，将细胞分离、固定并通过免疫组织化学法使用合适的抗体试剂或通过用甲苯胺蓝染色以检测胞外基质中存在的硫酸化蛋白聚糖来分析软骨细胞谱系的标记。
使用检测有代表性的软骨细胞标记蛋白(胶原蛋白Ⅱ)的抗体获得的结果如附图1-3中所示。维持在沉淀培养物(附图2)或海藻酸钙(附图3)中的细胞经胞内存在的胶原蛋白Ⅱ蛋白质的免疫荧光染色为阳性。这些结果与对在附图1中所示单层培养物中维持3周的脂肪组织衍生的细胞的相同分析相反；此处，无论如何也没有观察到染色。使用检测软骨细胞标记蛋白(胶原蛋白Ⅵ)的抗体试剂的免疫组织化学结果如附图4中所示。将脂肪组织衍生的基质细胞维持在1.2％海藻酸钙中，并在没有或有β-转化生长因子(10ng/ml)存在的情况下维持在含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗坏血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)的DMEM中，然后在37℃下和5％CO2培养箱中培养达2周。免疫组织化学揭示了在有(而不是没有)β-转化生长因子存在的情况下维持的那些细胞周围的胶原蛋白Ⅵ蛋白质的沉积密度。
检测有代表性的与软骨形成相关的基因标记的聚合酶链反应结果如附图5中所示。将脂肪组织衍生的基质细胞维持在1.2％海藻酸钙(Alg)中或单层(Mono)培养物中、并在没有(TGFβ-)或有(TGFβ+)β-转化生长因子(10ng/ml)存在的情况下维持在含有10％胎牛血清、50ng/ml的抗坏血酸-2-磷酸、100nM地塞米松(DEX)的DMEM中达4周的期限。从各个培养物中分离出总RNA并用于采用对Ⅰ或Ⅵ型胶原蛋白、蛋白聚糖连接(连接物)蛋白、聚集蛋白聚糖或肌动蛋白有特异性的引物的聚合酶链反应。在所有生长条件下检测胶原蛋白标记和肌动蛋白。然而，在藻酸盐悬浮条件下连接物mRNAs最为丰富、且在有TGFβ存在的情况下在藻酸盐条件下仅存在聚集蛋白聚糖。
这些结果证明通过将生成体外细胞聚集体和加入合适的允许因子结合起来，我们能够表达符合来自皮下脂肪组织细胞中软骨形成的软骨细胞标记。实施例2合成软骨膜片的制备在增殖后，可以以一种不依赖贴壁方式即在带有细胞接触的孔(细胞粘附表面)中培养仍具有软骨形成潜能的软骨形成细胞以便刺激软骨特异性胞外基质成分的分泌。
迄今为止，已经观察到以依赖贴壁方式增殖扩增的软骨形成细胞通常分化并失去其分泌软骨特异性Ⅱ型胶原蛋白和硫酸化蛋白聚糖的能力(Mayne等(1984)Exp.Cell.Res.151(1):171-82；Mayne等(1976)PNAS 73(5):1674-8；Okayama等(1976)PNAS 73(9):3224-8；Pacifici等(1981)J.Biol.Chem.256(2):1029-37；Pacifici等(1980)Cancer Res.40(7):2461-4；Pacifici等(1977)Cell 4:891-9；von der Mark等(1977)Nature 267(5611):531-2；West等(1979)Cell 17(3):491-501；Oegama等(1981)J.Biol.Chem.256(2):1015-22；Benya等(1982)Cell 30(1):215-24)。
已经发现当将未分化软骨形成细胞接种入具有阻碍细胞粘附于细胞接触表面的细胞接触表面的孔中并在其中培养时，所述的细胞重新分化并开始分泌软骨特异性胶原蛋白和硫酸化蛋白聚糖，由此形成体外合成软骨膜片(美国专利5,902,741和5,723,331)。
此外，已经发现在预定形状的孔中培养细胞能够将其制成预定厚度和体积的合成软骨膜片。然而，发现所得软骨膜片的体积不仅取决于孔的体积而且取决于接种入孔的软骨形成细胞的数量。通过经改变上述参数之一或上述两种参数的常规实验可以制备最佳预定体积的软骨。A．预定形状孔的制备。
可得到几种手段来制备具有细胞接触、细胞粘附表面的预定形状的孔。
可以用阻碍软骨形成细胞粘附于细胞接触表面的分子包覆细胞接触表面。优选的包被试剂包括基于硅的试剂即二氯二甲基甲硅烷或基于聚四氟乙烯的试剂即Teflon.RTM。用基于硅的试剂特别是二氯二甲基甲硅烷包被材料的方法在本领域中是众所周知的。参见，例如，Sambrook等(1989)“分子克隆实验室手册”，冷泉港实验室出版，将该文献的公开内容引入本文作为参考。发现可以将可防止细胞与孔表面附着的其它生物相容性试剂用于实施本发明。
另一方面，可以由自身不允许细胞附着的柔韧或可模塑的生物相容性材料来模塑成孔。可防止这种细胞附着的优选的材料包括但不限于琼脂糖、玻璃、未处理的细胞培养物塑料和聚四氟乙烯即Teflon.RTM。未处理的细胞培养物塑料即未用带有静电电荷的物质处理的塑料或由这类物质构成的塑料，它们从市售可得且可以商购自例如Falcon Labware,Becton-Dickinson,LincolnPark,N.J.。然而，并不意味着上述材料是限定性的。应理解为可以将本来就阻碍软骨形成细胞附着的任何其它柔韧或可模塑性生物相容性材料用于实施本发明。
根据所修复的关节软骨缺损的大小和形状可以确定孔的大小和形状。例如，要求孔可以具有25cm2的截面表面积。这是成年人股骨软骨截面表面积的平均值。因此，预计按照本发明可以制成单片合成软骨以便重修完整的股骨软骨表面。孔的深度优选大于约0.3cm且优选约0.6cm的深度。成年人接合关节中天然关节软骨的厚度通常约为0.3cm。因此，孔的深度应足够大以便使得约0.3cm的软骨膜片形成。然而，孔也应足够深以便其中含有覆盖软骨膜片的生长培养基。
还希望可以将按照本发明制备的大片软骨“修整”成外科医师能够进行外科手术修复受损害软骨的预选的大小和形状。借助于锋利的切割器具即手术刀、剪刀或装有切割边的关节镜检查装置、使用本领域众所周知的方法可以进行修整过程。
在无菌条件下预定形状的孔优选是在大块琼脂糖凝胶中模塑。琼脂糖是一种可用于快速和方便地模塑预定形状孔的经济、生物相容性、柔韧和可模塑性的物质。如上所述，孔的大小可以取决于得到的所需软骨填充物的大小。
通过将熔化的LT琼脂糖(BioRad,Richmond,CA)热溶液倾入含有圆筒的组织培养皿中可以制成预定形状的孔。所述的圆筒具有反映所形成孔的形状的大小。孔的大小和形状由本领域技术人员来选择且可以取决于所修复关节软骨缺损的形状。一旦琼脂糖冷却并在圆筒周围固化，则用镊子将圆筒小心地取出。用熔化的琼脂糖覆盖经取出圆筒而暴露的组织培养皿的表面。这样可密封孔的底部并在孔的基底部产生细胞粘附表面。当新近添加的熔化LT琼脂糖冷却并固化时，所得的预定形状的孔适合于培养并刺激增殖的软骨形成细胞的再分化。然而，发现另一种方法可用于制备用于实施本发明的预定形状的孔。B．软骨膜片的生长可以将增殖的软骨形成细胞悬浮液接种入预定形状的孔并在其中培养。可以通过添加细胞培养基而将细胞稀释成每ml约1×105-1×109个软骨形成细胞的细胞密度。优选的细胞培养基中含有用10％胎牛血清补充了的DMEM。
在将软骨形成细胞接种入孔的大约4小时内，所述的细胞可以合生成细胞粘性填充物。在约4-10天后，细胞开始分泌软骨特异性硫酸化蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白。在延长培养期限后，由孔中软骨形成细胞表达的胶原蛋白主要是Ⅱ型胶原蛋白。然而，发现可以将4小时内形成的细胞粘性填充物从孔中取出并以外科手术方式植入软骨缺损处。预计未分化的软骨形成细胞随后可以在原位重新分化，由此形成关节内的合成软骨。
观察到可以将软骨细胞分化或刺激因子添加到预定形状的孔中的软骨形成细胞中以便促进或刺激关节软骨特异性蛋白聚糖和/或胶原蛋白的产生(Luyten& Reddi(1992):“Biological Regulation of the Chondrocytes”,CRC Press,Boca Raton,Ann Arbor,London，和Tokyo,p.p.227-236)。优选的生长因子包括但不限于β-转化生长因子(TGF-β)；胰岛素样生长因子(IGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；表皮生长因子(EGF)；酸性成纤维细胞生长因子(aFBF)；碱性成纤维细胞生长因子(bFBF)；肝细胞生长因子(HGF)；角膜细胞生长因子(KGF)；骨形态发生因子(BMPs)即BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5和BMP-6以及成骨蛋白(OPs)即OP-1、OP-2和0P-3。TGF-β、IGF、PDGF、EGF、aFBF、bFBF、HGF和KGF的优选浓度在约1-100ng/ml的范围。BMP’s和OP’s的优选浓度在约1-约500ng/ml的范围。
然而，这些特定的生长因子不是限定性的。可以将能够刺激或诱导软骨特异性蛋白聚糖和胶原蛋白的产生的任何多肽生长因子用于实施本发明。
此外，观察到可以将抗坏血酸添加到预定形状孔的软骨形成细胞中以便促进或刺激软骨特异性蛋白聚糖和胶原蛋白的产生。抗坏血酸的优选浓度在约1-约1000μg/ml的范围。实施例3关节软骨缺损的手术修复哺乳动物中的软骨缺损在关节镜检查过程中或在关节的开放式手术过程中是容易目测辨认的。理论上也可以通过使用计算机辅助断层照相(CAT扫描)、X-射线检查、磁共振成象(MRI)、滑液或血清标记分析或通过本领域中公知的任意其它方法来鉴定软骨缺损。在关节镜检查或开放式手术过程中使用本文所公开的方法和组合物可以有效地治疗这种缺损。
因此，一旦鉴定了这种缺损，则可以通过下列步骤来治疗这种缺损(1)以手术方式在预定部位移植一片由本文所述方法制备的合成关节软骨；并(2)使所述合成关节软骨整合到预定部位。
合成的软骨膜片最好具有这样的大小和形状，使得当将该膜片植入缺损时，植入组织的边缘直接与缺损边缘接触。此外，可以将合成的软骨膜片在手术过程中在原位固定。这可以通过用可生物降解的缝合线即(Ethicon,Johnson和Johnson)以手术方式将膜片固定入缺损、和/或通过将生物粘合剂用于接触膜片和缺损的区域而实现。优选的生物粘合剂包括但不限于类似于法国专利2,448,900、法国专利2,448,901和欧洲专利序列号(EP.S.N.)88401961.3中所述的纤维蛋白-凝血酶胶粘物以及类似于美国专利5,197,973中所述的合成生物粘合剂。然而，发现可以将另一种类型的缝合线和生物相容性胶粘物用于实施本发明。
在某些情况中，在移植合成软骨膜片前可以以手术方式切下受损的关节软骨。另外，可以通过用转谷氨酰胺酶处理缺损部位来促进合成软骨膜片与关节软骨缺损的粘合(Ichinose等(1990)J.Biol.Chem.265(3):13411-13414；Najjar等(1984):“Transglutaminases”,Boston,Martinuse-Nijhoff)。最初，例如通过使用棉花样物质(cottonoid)将软骨缺损干燥并充满转谷氨酰胺酶溶液。随后例如通过抽吸除去该溶液，从而遗留下在软骨上含有转谷氨酰胺酶的薄膜。接着通过上述方法将合成软骨膜片植入缺损部位。
此外，可以将合成的软骨用于修复人体关节软骨缺损。因此，可以将软骨形成细胞与人体脂肪组织衍生的基质细胞即人体皮下脂肪组织区分开来。
用于进行关节软骨缺损修复的手术过程在本领域中是众所周知的。参见，例如Luyten和Reddi(1992)“软骨细胞的生物调节”，CRC出版，BocaRaton,Ann Arbor,London，和Tokyo,p.p.227-236，将该文献的公开内容引入本文作为参考。
上述结果证明在培养系统中，人体脂肪组织衍生的基质细胞分化成肥大软骨细胞。由于所有成分是确定的，所以可以将该系统用于研究生长因子等对软骨形成进展的作用。我们和其他人已经使用了体外系统以证实这些细胞群体具有成骨和成脂肪的潜能。我们在本文中证明该群体具有软骨形成潜能。这对于软骨修复来说具有临床实用性。
本发明还提供了一种用于通过将这类细胞体外与软骨诱导剂接触而在人体脂肪组织衍生的基质细胞中诱导软骨形成的方法，其中所涉及的基质细胞是三维形式。
本发明还提供了一种将脂肪衍生的基质细胞的体外分化软骨细胞用于修复包括人在内的哺乳动物的软骨组织的方法。
在上述方法中，优选在以化学方式确定的环境中将基质细胞分离、将人体脂肪组织衍生的基质细胞进行培养扩增，并聚集成密集的邻近体，诸如三维细胞团例如压紧的细胞或离心细胞沉淀的形式。此外，接触过程优选包括在以化学方式确定的培养基中培养人体脂肪组织衍生的基质细胞沉淀的步骤，所述的培养基中包括含有10％血清、50ng/ml的抗坏血酸-2-磷酸、10-7M地塞米松的DMEM。然后将分化的细胞导入手术部位以便修复软骨。由于该系统中的所有成分已经确定，所以可以将该系统在包括人和马在内的哺乳动物中用作软骨修复的产品。
权利要求
1．一种用于使脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的培养基，它包括以化学方式确定的培养基，该培养基含有下列成分或用下列成分进行了补充(ⅰ)能够激活可产生成熟软骨细胞表型的任何细胞转导途径的软骨诱导剂；(ⅱ)抗菌素；(ⅲ)营养补充剂诸如1-20％的胎牛血清或1-20％的马血清或任意其它生物或合成的等效蛋白质混合物；(ⅳ)抗坏血酸或相关的维生素C类似物以及(ⅴ)糖皮质激素或其它能够激活细胞糖皮质激素受体的化学剂。
2．权利要求1的培养基，其中所述的软骨诱导剂或基质细胞促细胞分裂剂分别或以混合方式选自下列物质组成的组糖皮质激素；β-转化生长因子超家族中的一个成分；胶原胞外基质分子；和维生素A类似物。
3．权利要求1的培养基，其中所述的抗菌素是青霉素。
4．权利要求1的培养基，其中所述的抗菌素是链霉素。
5．权利要求3的培养基，其中所述的青霉素的浓度约为10单位/ml-约200单位/ml。
6．权利要求4的培养基，其中所述的链霉素的浓度约为10μg/ml-约200μg/ml。
7．权利要求2的培养基，其中所述的糖皮质激素是氢化可的松。
8．权利要求2的培养基，其中所述的糖皮质激素是地塞米松。
9．权利要求8的培养基，其中所述的地塞米松的浓度约为1nM-约100nM。
10．权利要求7的培养基，其中所述的氢化可的松的浓度约为1nM-约100nM。
11．权利要求2的培养基，其中所述的β-转化生长因子选自下列物质组成的组骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-4、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IGF、PDGF、EGF、aFBF、bFBF、HGF、KGF、抑制素A和软骨形成刺激因子。
12．权利要求11的培养基，其中所述的β-转化生长因子的浓度约为1ng/ml-约100ng/ml。
13．根据权利要求11所述的培养基，进一步包括约1ng/ml-约10ng/ml浓度的TGF-β1。
14．权利要求2的培养基，其中所述的胶原胞外基质分子是胶原蛋白I。
15．权利要求2的培养基，其中所述的维生素A类似物是视黄酸。
16．权利要求15的培养基，其中所述的视黄酸的浓度约为0.1ng/ml-约1μg/ml。
17．一种用于使脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的方法，该方法包括下列步骤a)通过在500Xg将无菌试管内的50,000-5百万个细胞离心2-20分钟来沉淀所述的基质细胞，所述的无菌试管中含有一种培养基诸如Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)或α改进的极限必需培养基(αMEM)或Roswell ParkMemorial Institute培养基1640(RPMI培养基1640)；b)以500-20,000个细胞/cm2的密度将所分离的基质细胞在分化培养基中铺平板；c)用下列成分补充所述的培养基(ⅰ)能够激活可产生成熟软骨细胞表型的任何细胞信号转导途径的软骨诱导剂；(ⅱ)抗菌素；(ⅲ)用1-20％的胎牛血清或1-20％的马血清或任意其它生物或合成的等效蛋白质混合物补充的营养物；(ⅳ)抗坏血酸或相关的维生素C类似物；(ⅴ)糖皮质激素或能够激活细胞糖皮质激素受体的其它化学剂；以及d)在一种具有5％CO2和1％-20％氧气的培养箱中将所述的细胞在约31℃-37℃下培养约3-4周。
18．一种用于使脂肪组织衍生的基质细胞分化成软骨细胞的方法，该方法包括下列步骤a)在海藻酸钙或以三维构造支撑软骨形成的任意其它生物相容性晶格或基质中以50万-1千万个细胞/ml的浓度悬浮基质细胞；b)将细胞转移至35mm培养皿中、并以500-20,000个细胞/cm2的密度将细胞在分化培养基中铺平板，该分化培养基中含有以化学方式确定的培养基，所述的培养基具有下列成分或用下列成分进行了补充(ⅰ)能够激活可产生成熟软骨细胞表型的任何细胞转导途径的软骨诱导剂；(ⅱ)抗菌素；(ⅲ)用1-20％的胎牛血清或1-20％的马血清或任意其它生物或合成的等效蛋白质混合物补充的营养物；(ⅳ)抗坏血酸或相关的维生素C类似物；(ⅴ)糖皮质激素或能够激活细胞糖皮质激素受体的其它化学剂；以及c)在一种具有5％CO2和1％-20％氧气的培养箱中将所述的细胞在约31℃-37℃下培养约3-4周。
全文摘要
本发明公开了用于使体外培养的脂肪衍生的基质细胞定向分化成软骨细胞谱系的细胞的方法和组合物。本发明进一步提供了可以单独或以与其它营养成分混合的方式用于诱导培养单层形式或三维构造的生物相容性晶格或基质形式的脂肪衍生的基质细胞中软骨形成的各种软骨诱导剂。本发明还公开了分化的软骨细胞用于治疗包括体外软骨修复在内的大量人体疾患和疾病的用途。
文档编号A61K35/12GK1306085SQ0012898
公开日2001年8月1日 申请日期2000年8月21日 优先权日1999年8月19日
发明者Y－D·C·霍尔沃森, W·O·威尔克森, J·金贝尔 申请人:泽恩比奥公司