专利名称：一种天然人体细胞增殖活性促进剂的制备的制作方法
技术领域：
本发明是一种从葡萄中提取的天然植物多酚物质，具有促进和保护人体细胞增殖活性的作用，可以用于医药保健品、食品添加剂和实验用试剂方面。
葡多酚是存在于葡萄中的一种天然多酚物质，在葡萄的子和皮中行两含量丰富。其主要成分是不同数量的儿茶素和表儿茶素单体，以不同的空间结构聚合成的原花青素(Procyanidin)多酚类物质，本发明称之为葡多酚(Grape Procyanidin，GPC)。据国外研究报道，GPC具有抗病毒、抗肿瘤、抗微生物感染和抗氧化损伤等多种生物学活性。我国于1997年6月受理了美国小.L.J.罗曼兹耶克等人申报的以原花青素多酚为主要功效成分的“抗赘生物可可提取物及其制备方法和应用”的专利申请(公告号1168632)。1998年，国家专利局还公告了美国J.L.B.股份有限公司关于利用原花青素多酚“治疗和预防非病毒性微生物感染的方法”的专利申请(公告号1179104)。
但是，这些资料均未涉及到GPC可以作为一种具有促进和保护人体细胞增殖活性制剂而应用于医疗保健品、食品添加剂和实验试剂等方面，也未涉及到从葡萄中制备GPC制剂的具体技术和产品特点。
我们的实验结果表明在体外实验中，GPC对人体血管内皮细胞、成纤维细胞、血细胞、肝细胞等都表现出促进和保护细胞活性，增强细胞增殖的作用。同时，GPC可以直接有效地清除羟自由基、超氧阴离子自由基和脂类自由基等多种自由基。在动物实验也表明，GPC具有抗辐射、抗肿瘤、抗自由基损伤作用，在配合肿瘤的放、化疗中有很好的协同增效作用。另外，我们也研究了以葡萄籽为原料制备GPC方法和产品的特点本发明是提供一种从葡萄籽中提取GPC的方法，并提供一种以GPC为主要功效成分，具有促进和保护人体细胞增殖活性的制剂。该制剂不仅可促进正常细胞的增殖活性，对受到辐射、化学和某些生物性因素损伤的细胞的增殖活性也有良好的保护作用，可以应用于医疗保健品、食品添加剂和实验试剂等方面，并用GPC纯品或含有其他助剂，制备成具有不同剂型和不同医疗保健作用的制剂产品和实验试剂。
本发明的目的是这样实现的取新鲜未发酵的葡萄籽用丙酮脱蜡后粉碎成粗粒状物，再脱蜡，用1∶1丙酮溶液和8∶2甲醇水浸泡提取GPC。提取的GPC其中原花青素多酚的含量≥95％。原花青素多酚是由2-10个儿茶素和表儿茶素单体，以不同空间构成聚合而成(其二聚体结构见
图1)。GPC在甲醇水溶液中最大吸收峰位于波长270-290mm处，氧化后则位于515-535nm处。其高压液相(HPLC)分析测定图谱见图2。质谱测定GPC含有准分子离子为m/z291、404、579、889、1175、1467等物质(见图3)。
GPC为主要功效成分制备而成的一种具有促进和保护人体细胞增殖活性的制剂。该制剂可以是GPC纯品或加有某些辅助剂的组合物。其剂型包括散剂(粉剂)、胶囊(含微胶囊)、片剂、溶液和膏剂，可口服、局部和注射等方式应用，其应用剂量(以GPC计)，人体1-100mg/kg，动物1-500mg/kg，体外细胞培养1-1000mg/L.GPC的应用范围的制剂有1、活性氧自由基清除积(含抗氧化剂)；2、辐射损伤防护和治疗剂；3、接受放、化疗的肿瘤病人的辅助治疗剂；4、血液、肝脏、血管内皮、脑神经等组织细胞生长或修复促进剂；5、创伤、手术、溃疡修复促进剂；6、烟、酒及其他化学毒物的细胞毒性防护和保护剂；7、医学生物学实验(含动物实验及体外组织培养实验)用试剂。
实施例1以葡萄籽为原料提取GPC(1)、取新鲜未发酵的葡萄籽，用自来水冲洗3次后避光晾干。
(2)、将干燥的葡萄籽整粒用适量丙酮浸泡30分钟脱蜡。
(3)、将脱蜡葡萄籽粉碎成颗粒＜2mm的粉状物。
(4)、用＜4炭烃的食用油提取溶剂500-1000ml浸提12小时除脂肪。
(5)、脱脂粉状物用1∶1丙酮水溶液浸提GPC12小时，收集提取液。
(6)、将(5)提取后的残渣加入8∶2甲醇水溶液浸提GPC12小时，收集提取液。
(7)、将(5)和(6)的提取液分布于45C减压蒸馏回收丙酮和甲醇，并将水相合并，加入1/5体积的CHCL3萃取后分离水相。
(8)、将水相用10N NaOH调节pH值为10后，加入5倍量乙醇，充分沉淀并收集沉淀物。
(9)、用适量酸性水(HCL调pH值至4)溶解沉淀物至近饱和溶液。过滤除去不溶物，收集滤液并将5倍于柱容积的滤液加入苯基Sepharose柱中。
(10)、用2-3倍柱容积的水和10％的乙醇溶液分布洗柱，弃洗液。
(11)、用3倍柱体积的适当浓度的(50-80％)的乙醇溶液加入柱中的洗脱2-3次。
(12)、收集合并洗脱液，回收乙醇，余液经喷雾干燥后得高纯度的GPC粉状物9.2克。
实施例2血管内皮细胞株体外培养调件下，加入浓度为10mg/L的GPC，用MTT法测定细胞增殖活性程度。结果可见GPC能增强正常细胞的增殖活性，并降低浓度为20mg/L的阿霉素和10mg/L的Fenten试剂对细胞活性的损伤。当GPC剂量为100mg/L时，受损伤细胞的增殖活性已高于只加培养液的空白对照细胞。
实施例3给小鼠转移性S180肉瘤局部放射治疗，并同时口服GPC50mg/kg和100mg/kg。同单纯放射治疗比较，其肿瘤抑制率提高而血液中白细胞减少程度降低。
发明效果(1)、本发明提供的GPC制取方法可制得高纯度GPC原花青素含量≥95％。
(2)、本发明提供的GPC制剂对自由基有直接清除作用，具有良好的促进和保护细胞增殖活性作用，可使正常细胞的增殖活性提高20％以上，并可保护和促进修复辐射、化学和某些生物性因素对细胞增殖活性的损伤。
(3)、GPC可制成不同剂型和不同作用特点的制剂，在医药保健品、食品添加剂和实验试剂等方面有广泛应用前景。
权利要求
1.一种天然人体细胞增殖活性促进剂的制备，其特征在于从葡萄籽中提取的天然植物多酚物质，具有促进和保护人体细胞增殖活性的作用，可以用于医药保健品、食品添加剂和实验用试剂。
2.按照权利要求1所述，用溶剂浸提法提取原花青素含量≥95％的粉状多酚类化合物--葡多酚。
3.按照权利要求1所述的葡多酚中的原花青素是指以儿茶素和表儿茶素单体，并以不同空间结构聚合而成的多聚体的多酚类物质。其甲醇水溶液最大吸收峰为270-290nm，氧化后则位于515-535nm处。
4.按照权利要求1所述的葡多酚，可以是葡多酚纯品，也可以加入其他助剂的组合物，制做成散剂、胶囊(含微胶囊)、粉剂、溶剂和膏剂。
5.按照权利要求4所述的葡多酚可以制成包括以下全部或单一作用，用于不同范围和对象的制剂①、活性氧自由基清除剂(含抗氧化剂)；②、辐射损伤防护和治疗剂；③、接受放、化疗的肿瘤病人的辅助治疗剂；④、血液、肝脏、血管内皮、脑神经等组织细胞生长或修复促进剂；⑤、创伤、手术、溃疡修复促进剂；⑥、烟、酒及其他化学毒物的细胞毒性防护和保护剂；⑦、医学生物学实验(含动物实验及体外组织培养实验)用试剂。
6.按照权利要求1所述，葡多酚的应用剂量人体为1-100mg/kg；动物为1-500mg/kg；体外实验为1-1000mg/L。
全文摘要
本发明公开并要求保护的是用从葡萄籽中提取原花青素含量高于95%的多酚物质(即葡多酚)的方法,以及以葡多酚为主要功效成分制备的具有促进和保护细胞增殖活性的制剂,也包括了以GPC纯品或加入其他助剂而制成的不同剂型产品在医药保健品、食品添加剂和实验试剂方面的应用。
文档编号A61P43/00GK1357325SQ0012939
公开日2002年7月10日 申请日期2000年12月8日 优先权日2000年12月8日
发明者钟进义 申请人:青岛大学, 亚邁生物科技股份有限公司