耐药性人类免疫缺陷性病毒感染的治疗的制作方法

专利名称：耐药性人类免疫缺陷性病毒感染的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染的方法。本发明尤其涉及由HIV变种引起的病毒性感染的治疗方法，该变种对抑制所述病毒复制的抗病毒剂已产生了耐药性。
磷酸甲酸盐(PFA或膦甲酸盐)是一种有效的抗病毒剂，因为其具有抑制病毒聚合酶作用的能力，例如，举例来说，DNA和RNA聚合酶和逆转录酶(Crumpacker，C.S.，1992 The Americal Journal ofMedicine 92(SA)3S-7S)。同样，已经证明磷酸甲酸盐能有效地抑制病毒的生长，例如单纯疱疹病毒、流感病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒如HIV-1(Bacigalup，等，1994骨髓移植(Bone Marrow Transplantation)13753-758；Verdonck，等，1993与上述文章出处相同11177-179；Wagstaff，等，1994 Drugs 48199-226)。
磷酸甲酸盐是焦磷酸酯的类似物，其中焦磷酸酯是核苷酸聚合反应中形成的副产物，由掺入的核苷三磷酸在整合到新生DNA链中的过程中断裂下来的β和γ磷酸组成。人们总是希望不要被公理束缚住手脚，所以认为PFA能够抑制逆转录病毒如HIV-1的复制，其通过与逆转录酶结合，阻止了下一个核苷三磷酸的结合，由此阻断了进一步的催化作用。先前已经描述过PFA用于治疗病毒感染的用途。例如，参见，Chrisp，等，Drugs，41104-129(1991)；Beadle，等，AntiviralChem Chemother，933-40(1997)；Beadle，等，Antiviral ChemChemother，933-40(1988)；Hostetler，等，Antiviral Res.3159-67(1996)；Hostetler等，Antiviral Chem Chemother，11213-220(2000)；Kini，等，Antiviral Res.3643-53(1997)；Kini，等，Antiviral Res.36115-124(1997)；Mellors，等，Mol.Pharmacol.4311-16(1992)；Nguyen，等，Antimicrob.Agents Chemother.，382409-2414(1994)。
虽然通过抗病毒剂的使用在艾滋病治疗上取得了进步，但是这种治疗的令人遗憾的结果在于同样的抗逆转录病毒剂把HIV-I置于产生突变的选择压力下，导致药物不敏感性和不良的治疗效果(Richman，科学美国人(Scientific American)，1988 27988)。病毒对用于治疗HIV感染的抗逆转录病毒药物形成耐药性是治疗失败的主要原因，从而限制了对可替代的抗逆转录病毒治疗方法的选择。已经对作用于HIV逆转录酶的所有核苷类抑制剂(NRTI)产生耐药性，这些核苷类抑制剂包括核苷类似物叠氮胸苷(AZT)、双脱氧肌苷(ddI)、双脱氧胞苷(ddC)、拉米夫定(3TC)、双脱氧胸苷(d4T)和阿波卡韦，同样地，也对非核苷酸类逆转录酶抑制剂(NNRTI)产生耐药性，例如尼威拉平、笛拉窝定、和依法韦恩茨(Hirsch，等，JAMA 1998 2791984-1991)。另外，已经对HIV-I蛋白酶抑制剂产生耐药性，例如杀昆那威、印笛那威、利同那威、胺瑞纳韦和DMP-450。
据此，在本领域对抗病毒剂存在一种需要，该抗病毒剂能有效地阻止HIV变种的复制，其中该变种已经对通过目前提供的抑制病毒复制的治疗方案产生了耐药性。
一方面，本发明提供了治疗由逆转录病毒引起的病毒感染的治疗方法。特别地，本发明提供了治疗由逆转录病毒引起的病毒感染的治疗方法，该逆转录病毒已经对对抗病毒剂及其类似物产生了耐药性，例如，举例来说，逆转录酶抑制剂。
另一方面，本发明提供了治疗病毒感染的方法，其包括给需要治疗的个体施用有效量的磷酸甲酸盐的脂类类似物，并联合使用叠氮胸苷(AZT)，其中叠氮胸苷(AZT)是一种HIV逆转录酶抑制剂。
发明详述根据本发明，对需要治疗的个体，本发明提供了治疗病毒感染的方法。适用于这些治疗干预的指标包括诸如人类免疫缺陷性病毒(HIV)的敏感病毒，其中所述病毒的逆转录酶已经变得对各种逆转录抑制剂具有耐药性，例如核苷类逆转录抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)和类似物。
本发明的方法包括给个体施用有效量的磷酸甲酸盐或硫代磷酸甲酸盐的脂类类似物，其中该脂类类似物具有如下的结构 其中R1和R1’是独立的-H，任意取代的-O(C1-C24)烷基，-O(C1-C24)链烯基，-S(C1-C24)烷基，-S(C1-C24)链烯基，-O(C1-C24)酰基，-S(C1-C24)酰基；其中R1和R1’冲至少有一个不是-H，其中所述的链烯基具有1到大约6个双键，所述的酰基任意地具有1到大约6个双键。
R2和R2’是独立的-H，任意取代的-O(C1-C7)烷基，-O(C1-C7)链烯基，-S(C1-C7)烷基，-S(C1-C7)链烯基，-O(C1-C7)酰基，-S(C1-C7)酰基，-N(C1-C7)酰基，-NH(C1-C7)烷基，-N((C1-C7)烷基)2，氧，卤素，-NH2，-OH，或-SH；R3是磷酸甲酸盐，通过它的羧基基团或它的膦酸酯基团，连接到任选的连接头L的功能基团上或Cα的可用氧原子上，其中当R3是通过其膦酸酯基团连接时，所述的磷酸甲酸盐的羧酸盐基团具有如下结构 其中Ry是-H或烷基，或Na+，K+，NH4+，或任何其它生理学上可接受的阳离子，X，当存在时，是 L，当存在时，是具有-J-(CR2)t-G-结构的双功能连接分子，其中t是从1到24之间的整数，J和G是独立的-O-，-S-，-C(O)O-，或-NH-，并且R是-H，烷基，或链烯基；m是从0到6的整数；和n是0或1。
在此所用，术语“烷基”是指具有1到24个碳原子的单价直链或支链基团或环状基团，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基和类似物。
在此所用，“取代的烷基”包括进一步含有一个或多个取代基的烷基，其中取代基选自羟基、烷氧基(低级烷基的)、巯基(低级烷基的)、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳基、取代的芳基、芳杂环基、取代的芳杂环基、芳氧基、取代的芳氧基、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、硝酮、胺基、酰氨基、-C(O)H，酰基、酰氧基、羧基、氨基甲酸酯、磺酰基、氨磺酰基、砜基和类似物。
在此所用，“链烯基”是指直链或支链的烃基，其含有一个或多个碳-碳双键，并且在大约2到24个碳原子的范围内，“取代的链烯基”是指进一步含有一个或多个如上所列的取代基的链烯基。
预期用于本发明实施中的磷酸甲酸盐包括，例如，1-十八烷基甘油醚加成化合物，1-O-十八烷基甘油基-3-PFA(B-PFA)，1-O-十八烷基-2-O-甲基甘油基-3-PFA(MB-PFA)，1-O-十八烷基-2-O-乙基甘油基-3-PFA(EB-PFA)，和在美国专利5,194,654、5,411,947、5,463,092、5,696,277、5,744,461和6,002,029中；以及在美国申请序号08/487,081和08/986,881中描述的化合物，此处全面地引入它们作为参考。
优选的脂类包括取代的甘油醇、丙二醇、丁二醇和乙二醇组。尤其优选的脂类包括甘油组分。
本发明优选的脂类类似物具有如下的结构 其中R1是O(C18烷基)，R1’和R2’每一个都是-H，R2是-OH、甲氧基或乙氧基，其中形成的脂类类似物分别称为B-PFA、MB-PFA或EB-PFA，并且Y是生理上可接受的阳离子，例如，举例来说，Na+、K+、NH4+和类似物。
本发明的方法对于治疗逆转录病毒引起的感染是尤其有效的，例如，举例来说，HIV-1和类似物。
在优选的实施例中，本发明的方法在治疗由哺乳动物免疫缺陷性病毒引起的感染中有用，例如，举例来说，HIV-1。本发明的方法对于治疗由HIV-1变种病毒引起的感染是尤其有效的，其已经对逆转录酶(RT)抑制剂产生了耐药性。举例来说，RT抑制剂包括核苷类似物，叠氮胸苷(AZT)、双脱氧肌苷(ddI)、双脱氧胞苷(ddC)、拉米夫定(3TC)、双脱氧胸苷(d4T)、阿波卡韦和类似物，以及非核苷类似物，例如尼威拉平、笛拉窝定、依法韦恩茨和类似物。
本发明的方法对治疗由HIV-1变种引起的感染也有效，该HIV-1变种对蛋白酶抑制剂具有耐药性，例如，举例来说，杀昆那威、印笛那威、利同那威、胺瑞纳韦、DMP-450和类似物。对需要治疗的个体，本发明进一步提供了预防或治疗由病毒感染引起的病理状态的方法，所述的方法包括对所述的个体施用有效量的磷酸甲酸盐的脂类类似物。
本发明进一步提供在哺乳动物身上治疗病毒感染的方法，所述的方法包括对需要治疗的个体施用有效量的磷酸甲酸盐的脂类类似物，并联合使用HIV逆转录酶抑制剂，例如，举例来说，热毒务定(AZT，叠氮胸苷)，其中热毒务定对突变体的选择使HIV变种对本发明所述PFA化合物变得敏感。相反地，本发明所述化合物对HIV RT突变体的选择则逆转或减少了AZT耐药性。
这里描述的脂类类似物已经表现出口服生物有效度(Beadle等，Antiviral chem.chemo.，1998 933-40)。感染HIV耐药株的艾滋病人优选通过口服施用这里描述的脂类类似物进行治疗。因此，本发明所述化合物能通过多种方法施用，例如，以片剂、胶囊、溶液剂、乳剂或混悬剂的形式，吸入性的液体或固体颗粒，微囊颗粒，作为喷雾剂，通过皮肤采用如透皮药膏的方式，通过直肠给药例如以栓剂的形式，和类似物。本发明的亲脂性衍生物尤其适用于透皮吸收性施用和传送系统，并且也可用于牙膏。给药也可以以注射溶液的形式在肠胃外进行，例如用于静脉内的、皮下的、腹膜内的、池内给药和类似形式。
在本发明的实施中所用的制药上的载体或稀释剂可以是传统的固体或液体载体。固体载体的例子有乳糖、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚。液体载体的例子有糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯或水。载体或稀释剂可以包括本领域共知的任何持续释放材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，可将其单独使用或与蜡混合使用。
如果固体载体用于口服给药，制剂可以是片剂或以粉末或小球的形式放在硬明胶胶囊中。固体载体的量可以非常广泛的变化，但是通常是大约25mg到大约1g。如果使用液体载体，制剂可以是糖浆，乳剂，软明胶胶囊，无菌注射液例如含水或无水液体混悬剂或溶液，和类似物。
片剂的制备通过将活性成分(即，本发明所述的一种或多种化合物)和制药上惰性的、无机或有机的载体、稀释剂和/或赋形剂混合来进行。这些可用于片剂制备的赋形剂的例子包括乳糖，玉米淀粉或其衍生物，滑石粉，硬脂酸或硬脂酸盐。用于明胶胶囊的适宜赋形剂的例子有植物油，蜡，脂肪，半固体，液体多羟基化合物。脂类类似物可以以微囊的形式制备。
对于鼻腔给药，制剂可以含有溶解或悬浮于液体载体中的本发明所述化合物，尤其是一种应用气雾剂的含水载体。载体可以含有助溶剂，例如丙稀，乙二醇，表面活性剂，吸收促进剂例如卵磷脂或环糊精，或防腐剂。
本发明包括用于含有药效学上可接受的无菌含水或无水液体，分散剂，混悬剂或乳剂的药效学组分的使用，同样也包括用于在非肠道注射之前补进无菌注射溶剂或分散剂的无菌粉末。含有本发明所述化合物的药效学制剂能通过通常的技术制备，例如，在雷明顿药效学科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，1985中描述的技术。
用于溶剂和糖浆制剂的适宜的赋形剂是水、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、脂质体和类似物。用于注射溶液制剂的赋形剂是水、乙醇、多元醇、甘油、植物油和类似物。
药物上的产品可以另外含有任何的各种添加成分，例如，举例来说，防腐剂、助溶剂、稳定剂、湿润剂、乳剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、缓冲剂、包衣剂、抗氧化剂、稀释剂和类似物。
可选择地，本发明也包括含有此处所述的脂类类似物与一种或多种表现不同活性的化合物，例如抗生素或别的药理上的活性化合物，混合而成的药效学组合物。这样的混合物及其用途包括在本发明的范围之内。
应用于本发明所述脂类类似物时，术语“有效量”是指能阻止或逆转伴随上述病毒感染的疾病的用量。“有效量”是参考抗病毒母体化合物的推荐剂量决定的。选择的剂量依据所选化合物的活性，给药的途径，治疗状况的严重程度，和被治疗病人的状况和先前的药物史而变化。然而，在本领域的技术中，这些化合物的开始剂量是低于要求达到的期望有效治疗效果的水平，并逐渐增加剂量直到达到满意效果。如果需要，有效的每日剂量可以分成多次剂量以便达到给药目的，例如，每天两次或四次。这是可以理解的，然而，对于任何特定病人，特定的剂量水平依赖于各种因素，包括体重、通常的健康状况、饮食、时间和给药的途径以及和其他药物的联合运用，和治疗疾病的严重程度。
通常，本发明所述化合物以单位剂量形式进行分散，其中含有1％到100％的活性成分。作为药物，当对患者给药时，例如人类，治疗剂量的范围是从大约0.01到1000mg/kg/天，其中优选从大约0.10mg/kg/天到100mg/kg/天。在本发明所述药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便对特定病人施用一定量的活性化合物，有效地实现期望的治疗反应。
通过参考下面的非限制性实施例，下面对本发明作更详细的描述。
细胞MT-2细胞(AIDS研究和参考试剂目录，国立过敏和感染疾病研究所，国立健康研究所)保存在添加10％小牛血清(FBS；JRHBiosciences，Lenexa，KS)，10mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液，50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中。
病毒 原种病毒的制备通过电穿孔方法(BIO-RAD Gene Pulse，Hercules，CA)，将5-10μg编码HIV-1LAI前病毒克隆的质粒DNA转染MT-2细胞(1.3×107个细胞)(参见Nguyen，等，Antimicrob.AgentsChemother.382409-2414，和Peden，等，Virology 185661-672.)。达到最大细胞病变效应时(一般在转染后5-7天)，收集培养液的上清液，并于-80℃储存。病毒感染滴度使用MT-2细胞进行三重终点稀释试验测定(每个稀释浓度6个孔)。50％组织培养感染剂量(TCID50)用Reed & Muench方程计算(参见Reed，等，Am.J.Hyg.27493-496).
抗病毒敏感性试验 每种化合物的抗病毒活性通过在感染复数(MOI)为0.01 TCID50/细胞下用HIV-1LAI病毒接种MT-2细胞，接着在三重连续药物稀释浓度(每个稀释浓度3个孔)下培养而后进行测定(参见Mellor，等，Antimicrob.Agents Chemother.391087-1092)。感染5或7天后，收集培养液的上清部分，用0.5％曲通-X 100(triton-X100)进行细胞裂解，并用商业化酶联免疫吸附(ELISA)测定法(DuPont，NEN Products，Wilmington，Del.)测定p24抗原浓度。所述化合物的抗病毒活性以IC50表示，即抑制50％p24抗原生成的浓度。受试病毒的抗耐药性倍数以受试病毒的IC50除以HIV-1LAI对照病毒的IC50计算。
耐药性病毒育种 育种是以在MOI为0.1下，用质粒衍生HIV-1LAI接种1.0×106MT-2细胞开始的，其已经在没有化合物的MT-2细胞中作为无细胞病毒传代10次(参见Bazmi，等，AntimicrobialAgents and Chemotherapy 441783-1788)。细胞在接种病毒前用药物预处理两小时。对于每次育种，开始的浓度是该化合物的IC50值，选择压力(即，药物浓度)是每经过三次传代即行加倍。对于细胞病变效应(CPE)，每天进行监测。在2+CPE(每100×视野中合胞体≥2)时，收集无细胞的上清，并用于在新鲜的MT-2细胞中开始新一轮的感染。通过测量相对于未传代HIV-1LAI的EC50，定期监测传代病毒对这些化合物敏感性的减少(Mellor，等，Antimicro.Agents Chemother.391087-1092)。
遗传学分析 以25000xg离心1小时，使病毒体从培养液上清中沉淀下来。使用TRIZOL试剂(Gibco BRL，Grand Island，NY)从病毒体沉淀物中提取总RNA，并将其重悬于经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌水中。在进行cDNA合成后，使用PCR方法扩增RT的全长编码区(参见Bazmi，等，Antimicrobial Agents and Chemotherapy441783-1788)。然后使用可经商品化提供的试剂盒(WizardPCRPurification System，Promega，Madison，WI)纯化大部分PCR产物，并用自动测序仪(PE Biosciences，San Francisco，CA)测序。
突变体重组HIV-1病毒的生成 含所需突变的HIV-1病毒通过寡核苷酸介导的诱导突变法(Altered Sites II，Promega)生成，正如以前在(Mellors，等，Molecular Pharm.41446-451)中描述的。在突变诱导形成后，使用位于RT的5’端和3’端的沉默的XmaI和XbaI限制性位点将突变体RT亚克隆入pxxHIV-1LAI克隆载体。克隆可经DNA测序以确定所需突变的存在，并经上文所述的电穿孔方法转染入MT-2细胞生成具有感染性的突变体重组HIV-1病毒。
重组子HIV-1的增殖按照引用的参考文献Mellors，等和Nguyen，等中的描述进行，将其引入此处作为参考。
RT突变体经寡核苷酸介导的诱导突变法生成，并整合进pxxHIV-1LAI克隆载体。pxxHIV-1LAIRT的5’端和3’端的两个沉默限制性位点(分别为XmaI和XbaI)的存在促进克隆进行。将突变的pxxHIV-1LAI克隆经电穿孔转染入MT-2细胞就可生成具有感染性的突变体重组子HIV-1病毒。可经DNA测序确定所需突变的存在。
对多种药物具有耐药性的HIV-1病毒株，11163pl和11588pl，正是具有所述RT突变的人类临床病毒分离株。用本发明的脂类类似物处理的HIV-1病毒株包括野生型，例如xxLAI及其类似病毒株；单突变的，如xxLAI M184V(对3TC表现耐药性)，xxLAI L74V(对ddI和ddC表现耐药性)，xxLAI K65R(对ddI，ddC，DAPD，DXG，泰诺福韦和阿的福韦表现耐药性)，xxLAI T215Y(对AZT表现耐药性)，和类似病毒株；和双突变的，如xxLAI M41L/T215Y(对AZT表现耐药性)，xxLAI M184V/T215Y(对3TC和AZT表现耐药性)，和类似病毒株；和多突变的，如xxLAI 4XAZT((D67N，K70R，T215Y，K219Q)，对AZT表现耐药性)，xxLAI 4XAZT/M1 84V((D67N，K70R，M184V，T215Y，K219Q)，对AZT和3TC表现耐药性)，xxLAI M5456-12(对AZT和NNRTI表现耐药性D67N，K70R，K103N，T215Y)，xxLAIG2-3g(对AZT和3TC表现共耐药性M41L，D67N，M184V，H208Y，L210W，R211K，L214F，T215Y，I293V，E297A)，11163(多核苷酸耐药性病毒株M41L，A62V，V75I，F77L，K103N，F116Y，Q151M，Y181C，M184V)，11588(多核苷酸耐药性病毒株A62V，K65R，K70R，V75I，F77L，F116Y，Q151M，M184V，K219Q)，和类似的病毒株。
体外PFA和PFA脂类类似物的选择性指数是在MT-2细胞中测定，结果如下化合物选择性指数PFA(膦甲酸盐)137B-PFA781MB-PFA 953EB-PFA 1905这表明PFA的脂类类似物的选择性指数((50％细胞毒性剂量/50％有效剂量)×100)远大于PFA自身的选择性指数。既然其脂类类似物与PFA本身相比有很高的口服吸收，那么PFA脂类类似物可口服单独给药或与其它抗病毒药联合用于控制耐药性HIV病毒的复制。在与PFA脂类类似物联合用药中特别优选AZT。
表1 B-PFA，MB-PFA和EB-PFA对一组耐药性HIV-1病毒株的抗病毒活性EC50，μM病毒 PFA B-PFA MB-PFA EB-PFAHIV-1LAI(对照) 18.31.90.35 0.22K65R 57.317.7 1.24 3.22L74V 37.44.25 0.52 1.34M184V 15.72.29 0.48 0.58T215Y nd 0.84 0.27 0.14M14L/T215Y16.21.25 0.13 0.41M184V/T215Y nd 1.49 0.54 0.484xAZT 8.821.25 0.46 0.33AZT/K103N 18.62.72 0.50 0.804xAZT/M1 84V 15.72.29 0.48 0.58G2-3g 7.6 1.47 0.26 0.32*p24减少试验是在用0.01MOI感染的MT-2细胞中进行。nd＝没有测定。病毒突变缩写单突变或双突变是以先给出标准的氨基酸字母代码，跟着为HIV RT中突变发生的位置，跟着为替代氨基酸的字母代码的方式表示；对于有多位点突变的多位点突变病毒株，4xAZT＝D67N，K70R，T215Y，K219Q；G2-3g＝M41L，D67N，M184V，H208Y，L210W，R211K，L214F，T214Y，I293V，E297A。
当针对一组耐药性HIV-1病毒进行检测时，本发明中所述化合物，B-PFA、MB-PFA和EB-PFA，具有的抗病毒EC50值全部都低于膦甲酸盐(PFA)。除K65R病毒株外，与具有单突变、双突变和多突变的HIV病毒株在7.6-37.4μM之间的EC50值相比，ODG-PFA的EC50值在0.84-4.25μM之间。MB-PFA和EB-PFA对耐药性HIV病毒十分有效，其EC50值一般在小于1μM的范围内。在一种少见的ddI耐药性突变体K65R中，记录到与野生型相比具有低水平耐药性(3.5-14.6倍)。注意多数耐药性HIV病毒株(表1)是在感染复数(MOI)为0.01的情况下进行研究的。
表2 B-PFA，MB-PFA和EB-PFA对具有多种药物耐药性的HIV-1病毒株的抗病毒活性EC50，μM病毒 PFA B-PFA MB-PFA EB-PFAHIV-1LAI(对照) 20.1 3.01 1.04 0.7611163pl24.4 3.48 1.95 1.2311588pl23.5 9.31 1.16 0.73p24减少试验是在用0.01MOI感染的MT-2细胞中进行。如表1进行缩写，在多种药物耐药性HIV-1中存在的RT突变体11163p1＝M41L，A62V，V75I，F77L，K103N，F116Y，Q151M，Y181C，M184V；11588p1＝A62V，K65R，K70R，V75I，F77L，F16Y，Q151M，M184V，K219Q。
如上所示，MB-PFA和EB-PFA甚至在多种药物耐药性HIV-1病毒株中表现出高活性，如临床分离病毒株11163pI和11588pI，甚至在感染复数提高到5倍的情况下，其EC50值在0.73-1.95μM之间。
本发明中还评价了这三种化合物对一组具有针对NRTI表现出耐药性的HIV-1变体的活性(参见实施例3-5)。由HIV-1LAI组成的多种对NRTI表现耐药性的病毒组衍生出含有对多种NRTI具有耐药性突变的重组病毒，包括几种对多种NRTI具有耐药性的变体(表3-5)。
b 平均值±标准方差至少由3个独立实验算出。
c 耐药性倍数相对野生型病毒而言。
d 编码所指耐药性突变的HIV-1LAI。
在所检测的病毒中，只有含K65R的病毒株(对ddI和DXG表现耐药性)对本发明中的化合物和未经修饰的(单体)PFA表现出了显著的耐药性，其耐药性倍数的值在3.3-8.2之间(EC50值在1.66-14.68μM之间)。3TC和ddI/ddC耐药性病毒(分别含有M184V和L74V耐药性突变)对发明化合物PFA和未修饰的PFA均表现出敏感性(耐药性倍数的值＜3.0)(表3)。
表4 多核苷耐药性HIV-1对PFA发明化合物的敏感性EC50a，b(μM)(耐药性倍数)cHIV-1变体 B-PFA MB-PFA EB-PFA PFA单体HIV-1LAId1.8±0.81 0.5±0.48 0.7±0.36 17.7±10.12NL4-3d2.6±1.52.3±1.90.2±0.2 15.1±6.111163p3e1.1±0.53(0.6) 1.4±0.28(0.9) 0.5±0.06(0.8) 15.5±5.04(0.9)Kf4.2(1.6)2.0±0.6(0.87) 0.9±0.7(4.5) 21.4±15.6(0.7)9GCg4.1±1.2(1.6) 2.3±0.5(0) 0.2±0.3(0)13.2±12.8(1.1)a EC50值通过测量在MT-2细胞中的p24抗原生成的抑制作用来评价b 平均值±标准方差至少由3个独立实验算出c 耐药性倍数是相对野生型病毒而言d 野生型病毒e 一种具有A62V，V75I，F77L，K103N，F116Y，Q151M，Y181C，M184V突变的多核苷耐药性临床分离株f 一种具有V75I，F77L，F116Y，Q151M，突变的多核苷耐药性重组病毒g 一种具有D67E，S68T，T69S[SA插入]，T215Y突变的多核苷耐药性重组病毒MNR病毒组包括一种含有V75I、F77L、F116Y和Q151M突变的病毒，一种含有T69S[SA插入]的病毒，和一种携带经典MNR基因型(62V/75I/77L/116Y/151M)的临床分离病毒株。每种发明化合物PFA都具有抑制这些病毒的效能，并且耐药性倍数值＜2。唯一的例外是含有75I/77L/116Y/151M的病毒，其对EB-PFA表现出4.5倍的耐药性倍数。实施例5AZT耐药性病毒包括具有双突变(M41L/T215Y)和四突变(D67N，K70R，T215Y，K219Q)的从HIV-1LAI病毒衍生来的重组体(表5)。这些AZT耐药性病毒对发明化合物和未修饰的PFA都敏感。
表5 AZT耐药性HIV-1对发明化合物PFA的敏感性EC50a，b(μM)(耐药性倍数)cHIV-1变种dB-PFAMB-PFA EB-PFA PFA单体野生型 1.79±0.81 0.50±0.48 0.65±0.36 17.66±10.12M41L/T215Y 0.94±1.08(0.5) 0.18±0.11(0.4) 0.30±0.35(0.5)13.86±4.14(0.8)4XAZTe1.47±0.63(0.8) 0.58±0.22(1.2) 0.34±0.24(0.5)12.7±8.07(0.7)4XAZT/M184V 2.29±1.59(1.3) 0.59±0.36(1.2) 0.56±0.08(0.9)22.74±15.81(1.3)4XAZT/K103N 3.87±2.36(2.2) 0.60±0.38(1.2) 0.88±0.14(1.4)19.22±8.85(1.1)G2-3gf1.67±0.95(0.9) 0.40±0.26(0.8) 0.30±0.04(0.5)8.85±3.49(0.5)a EC50值通过测量在MT-2细胞中的p24抗原生成的抑制作用来评价b 平均值±标准方差至少由3个独立实验算出c 耐药性倍数是相对野生型病毒而言d 编码所指耐药性突变的HIV-1LAIe 4XZTT＝D67N，K70R，T215Y，K219Qf 对AZT和3TC具有共同耐药性的一种分子克隆分离株；M41L，D67N，M184V，H208Y，L210W，R211K，L214F，T215Y，I293V，E297A与野生型病毒相比，含有M41L和T215Y突变的病毒一致对每种发明化合物都表现出增加了的敏感性EC50的倍数变化值在0.4到0.53之间(EC50值在0.18-0.94μM之间)。含有四个AZT耐药性突变及3TC耐药性突变M184V(HIV4XAZT/M184V)的病毒或含有四个AZT耐药性突变及非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)突变K103N(HIV4XAZT/K103N)的病毒也对本发明化合物表现出敏感性(耐药性倍数值＜3.0)。另外，对AZT和3TC具有共同耐药性的分子克隆临床分离病毒株对本发明化合物也敏感，其耐药性倍数值＜1.0(EC50值在0.30-1.67μM之间)。
表6 体外选择的对本发明化合物表现出耐药性的HIV-1的突变和敏感性的改变化合物 病毒传代EC50a耐药性倍数b密码子ΔcAAΔcDB-PFA 0 0.83 -18 8.97 10.8 TCA→ACAS117TCTT→TTTL214FMB-PFA 0 0.07 -15 2.16 30.9 GTA→TTAV75LATG→ATAM164ICTT→TTTL214FEB-PFA 0 0.09 -15 3.70 41.1 TGG→GGGW88GCTT→TTTL214FPFA 0 5.27 -17 122.323.2 TGG→GGGW88G15 122.223.2 TCA→ACAS117Ta EC50值通过测量在MT-2细胞中的p24抗原生成的抑制作用来评价b 耐药性倍数相对于基线病毒而言(HIV-1LAI的0传代)c 变化相对于基线病毒而言(HIV-1LAI的0传代)在15轮无细胞病毒传代后，分离出对MB-PFA表现27倍耐药性的病毒。对MB-PFA耐药性病毒的RT基因(氨基酸(AA)1-350)的DNA测序鉴定出3处突变V75L，M164I和L214F。构建编码V75L，M164I和L214F突变的重组病毒体，并检测其对MB-PFA的敏感性。含有M164I和L214F的病毒表现出9.3倍的耐药性(EC50＝8.1μM)。V75L突变单独或与L214F或与M164I组合并没有对MB-PFA产生显著的耐药性(耐药性倍数＜3)。重复筛选对MB-PFA具有耐药性的病毒；经15轮传代后，筛选出的病毒对MB-PFA表现出对MB-PFA的耐药性是31倍，并编码M164I和L214F突变而无V75L突变。
经18轮无细胞传代后，分离出对DB-PFA的耐药性为10.8倍的病毒。DNA测序在RT中鉴定出2处突变S117T和L214F。编码S117T的重组病毒对DB-PFA表现出10.0倍的耐药性(EC50＝9.0μM)。对于编码S117T的病毒再出现L214F突变不会增强对DB-PFA的耐药性水平(耐药性倍数值为9.7)。
经15轮无细胞传代后，分离到对EB-PFA具有41倍耐药性、并有W88G和L214F突变的病毒。编码W88G突变的重组病毒表现出9.4倍的耐药性，当再出现L214F突变时病毒的耐药性倍数值增加到15.5倍(EC50＝9.1μM)。重复15轮传代后又筛选对EB-PFA具有耐药性的病毒。这些病毒同样含有W88G和L214F突变。
HIV-1LAI作为本发明化合物筛选实验的对照，分别在含有和不含有未修饰PFA的条件下传代。在两个独立的筛选实验中分别经15轮和17轮无细胞传代后得到对PFA表现出23倍耐药性的病毒。这些PFA耐药性病毒的RT的DNA序列分析鉴定出RT中的单突变W88G(第一次筛选)和S117T(第二次筛选)。各自含有W88G和S117T突变的重组病毒分别对PFA表现出6.2倍的耐药性和4.7倍的耐药性。经本发明化合物或PFA单体筛选出的突变在无外加药物的对照组传代病毒中均未检测到。
表7 对PFA和PFA/AZT具有耐药性的HIV-1对发明化合物的敏感性EC50a，b(μM)(耐药性倍数)cHIV-1变种dB-PFAMB-PFA EB-PFA PFA单体野生型1.74±0.79 0.77±0.33 0.90±0.73 13.06±5.59W88G ＞30(＞17.2) 5.88±4.42(7.6)6.8±0.64(7.6 ) 152.24±14.28(11.7)W88S 20.7±1.20(11.9) 2.49±0.12(3.2)2.39±0.15(2.7) 67.09±6.76(5.1)E89G ＞30(＞17.2) ＞30(＞39.0) ＞26.11(＞29.0) 241.25±54.1(18.5)E89K ＞30(＞17.2) 7.21±0.12(9.4)5.21±0.16(5.8) 90.2±46.24(6.9)Q161L ＞30(＞17.2) 8.78±1.58(11.4) 6.73±0.04(7.5) 114.6±14.14(8.8)Q161L/H208Y ＞30(＞17.2) 12.84±9.00(17.7) 7.02±1.82(7.8) 126.4±33.09(9.7)4XAZTe1.47±0.63(0.8) 0.58±0.22(1.2)0.34±0.24(0.5) 12.7±8.07(0.7)4XAZTW88G 16.37±6.1(6.2) 2.46±0.11(2.9)3.31±1.30(4.2) 86.2±12.16(4.9)4XAZT/W88S4.09±1.84(1.6) 1.54±0.81(1.8)1.51±0.21(1.9) 18.44±10.40(1.0)4XAZT E89K17.39±14.9(6.6) 9.28±9.20(11.1) 4.39±4.59(5.6) 133.75±122.72(7.6)4XAZTQ161L6.64±2.10(2.5) 1.87±0.33(2.2)1.18±0.61(1.5) 39.93±9.40(2.3)4XAZTQ161L/H208Y6.2±0.85(2.4) 2.3±0.14(2.7) 2.02±0.54(2.6) 43.13±17.50(2.4)a EC50值通过测量在MT-2细胞中的p24抗原生成的抑制作用来评价
b 平均值±标准方差至少由3个独立实验算出c 耐药性倍数相对野生型病毒而言d 编码所指耐药性突变的HIV-1LAIe 4XZTT＝D67N，K70R，T215Y，K219Q回顾表7中的数据，表明PFA耐药性病毒对PFA发明化合物也表现出相似水平的耐药性。含E89G突变的病毒对本发明化合物最不敏感，其耐药性倍数值在＞17.2倍到＞39.0倍之间。也针对一组含有PFA和AZT耐药性突变的衍生自HIV-1LAI病毒的重组病毒测试了本发明化合物。正如前述，该病毒也对未修饰PFA和PFA发明化合物表现出相似水平的交叉耐药性。一般来说，AZT耐药性突变的存在降低了对PFA发明物的交叉耐药性水平。在AZT耐药性的遗传背景中，RT的89位密码子突变(G或K)赋予了对未修饰PFA和PFA发明化合物最大程度的耐药性，其耐药性倍数值在5.6到11.1之间。
表8突变体重组HIV-1LAI对AZT的敏感性HIV-1变种aAZT EC50b，c(μM) 耐药性倍数d野生型 0.021±0.008L214F 0.035±0.033 1.7S117T 0.017±0.007 0.8S117/L214F 0.022±0.010 1.1M164I 0.012±0.004 0.6M164I/L214F0.008±0.003 0.4W88G 0.019±0.013 0.9W88G/L214F 0.015±0.015 0.74XAZTe0.290±0.114 7.3S117T/4XAZT0.040±0.006 1.4M164I/4XAZT0.043±0.022 1.1W88G/4XAZT 0.060±0.018 1.5a 编码所指耐药性突变的HIV-1LAIb EC50值通过测量在MT-2细胞中的p24抗原生成的抑制作用来评价c 平均值±标准方差至少由3个独立实验算出
d 耐药性倍数相对野生型病毒而言e 4XAZT＝D67N，K70R，T215Y，K219Q发明化合物筛选出的突变，包括L214F，都不能降低对AZT的敏感性。M164I突变与对AZT敏感性增强相关(与野生型相比，耐药性倍数为0.6倍)。经PFA发明化合物筛选出的耐药性突变也被引入AZT耐药性背景(D67N/K70R/T215Y/K219Q)中以评价它们对AZT耐药性的影响。S117T，M164I和W88G都抑制AZT耐药性，使7.3倍的耐药性分别降低为1.4倍，1.1倍和1.5倍。
为了清楚和易于明白，虽然前述发明已经用通过图表和实施例的方式进行了一定程度的描述，但是对于本领域的那些普通技术人员来说，显而易见在本发明的指导下，可以在其上做一定的变化和修正，并不脱离本权利要求的精神和范围。
权利要求
1.一种在需要治疗的个体上对耐药性人类免疫缺陷病毒感染进行治疗的方法，所述的方法包括给予所述的个体有效量的含有磷酸甲酸盐的药物活性化合物的脂类类似物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂类类似物具有如下的结构 其中R1和R1’是独立的-H，任意被取代的-O(C1-C24)烷基，-O(C1-C24)链烯基，-S(C1-C24)烷基，-S(C1-C24)链烯基，-O(C1-C24)酰基，-S(C1-C24)酰基；其中R1和R2中至少有一个不是-H；其中所述的链烯基具有1到大约6个双键，所述的酰基任意地具有1到大约6个双键。R2和R2’是独立的-H，任意被取代的-O(C1-C7)烷基，-O(C1-C7)链烯基，-S(C1-C7)烷基，-S(C1-C7)链烯基，-O(C1-C7)酰基，-S(C1-C7)酰基，-N(C1-C7)酰基，-NH(C1-C7)烷基，-N((C1-C7)烷基)2，氧，卤素，-NH2，-OH，或-SH；R3是一个磷酸甲酸盐，其通过它的羰基或它的膦酸酯基团，连接到可选择的连接头L上的一个功能基上或在Cα上可用的氧原子上，其中当R3是通过膦酸酯基团连接时，所述磷酸甲酸盐的羧酸酯具有如下的结构 其中Ry是-H或烷基，或Na+，K+，NH4+，或任何其它生理学上可接受的阳离子，X，当存在时，是 L，当存在时，是具有如下结构-J-(CR2)t-G-的双功能连接分子，其中t是从1到24之间的整数，J和G是独立的-O-，-S-，-C(O)O-，或-NH-，并且R是-H，烷基，或链烯基；m是从0到6之间的整数；和n是0或1。
3.如权利要求2所述的方法，其中m是0、1或2。
4.如权利要求3所述的方法，其中m是1。
5.如权利要求4所述的方法，其中，R1是-O(C18)烷基和R1’是H，R2是-OH，甲氧基，或乙氧基，并且R2’是-H，在Cα上的R2是R2’，每一个都是-H，R3是磷酸甲酸盐，和N是0。
6.如权利要求5所述的方法，其中，R2是-OH。
7.如权利要求5所述的方法，其中，R2是甲氧基。
8.如权利要求5所述的方法，其中，R2是乙氧基。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述的HIV-1对逆转录酶(RT)抑制剂表现出耐药性。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述的逆转录酶抑制剂是核苷类似物。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述的核苷类似物是叠氮胸苷(AZT)，双脱氧肌苷(ddI)，双脱氧胞苷(ddC)，这些核苷类抑制剂包括核苷类似物叠氮胸苷(AZT)、双脱氧肌苷(ddI)、双脱氧胞苷(ddC)、拉米夫定(3TC)、双脱氧胸苷(d4T)，emirivine(FTC)，DAPD，DXG，泰诺福韦，阿的福韦，阿波卡韦。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述的核苷类似物是叠氮胸苷(AZT)，双脱氧肌苷(ddI)，双脱氧胞苷(ddC)，拉米夫定(3TC)。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述的核苷类似物是叠氮胸苷(AZT)。
14.如权利要求9所述的方法，其中，所述的逆转录酶抑制剂是非核苷类似物。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述的非核苷类似物是尼威拉平、笛拉窝定、和依法韦恩茨。
16.如权利要求1所述的方法，其中，所述的HIV-1对蛋白酶抑制剂表现出耐药性。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述的蛋白酶抑制剂是杀昆那威、印笛那威、利同那威、胺瑞纳韦和DMP-450。
18.一种治疗由HIV的AZT耐药性病毒株引起的病毒感染的方法，所述的方法包括给需要这种治疗的个体施用有效量的含有磷酸甲酸盐的药物活性化合物的脂类类似物。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述脂类类似物具有如下的结构 其中R1和R1’是独立的-H，任意被取代的-O(C1-C24)烷基，-O(C1-C24)链烯基，-S(C1-C24)烷基，-S(C1-C24)链烯基，-O(C1-C24)酰基，-S(C1-C24)酰基取代；其中R1和R2中至少有一个不是-H；其中所述的链烯基具有1到大约6个双键；所述的酰基任意地具有1到大约6个双键。R2和R2’是独立的-H，任意被取代的-O(C1-C7)烷基，-O(C1-C7)链烯基，-S(C1-C7)烷基，-S(C1-C7)链烯基，-O(C1-C7)酰基，-S(C1-C7)酰基，-N(C1-C7)酰基，-NH(C1-C7)烷基，-N((C1-C7)烷基)2，氧，卤素，-NH2，-OH，或-SH；R3是一个磷酸甲酸盐，通过它的羰基或它的膦酸酯基团，连接到可选择的连接头L上的功能基上或Cα上可用的氧原子上；其中当R3是通过它的膦酸酯基团连接时，所述的磷酸甲酸盐的羧酸酯基团具有如下的结构 其中Ry是-H或烷基，或Na+，K+，NH4+，或任何其它生理学上可接受的阳离子，X，当存在时，是 L，当存在时，是有如下结构-J-(CR2)t-G-的双功能基连接分子，其中t是从1到24之间的整数，J和G是独立的-O-，-S-，-C(O)O-，或-NH-，并且R是-H，烷基，或链烯基；m是从0到6之间的整数；和n是0或1。
20.一种治疗哺乳动物病毒感染的方法，所述的方法包括给所述个体施用有效量的含有磷酸甲酸盐的药物活性化合物的脂类类似物并联合使用AZT。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的脂类类似物具有如下的结构 其中R1和R1’是独立的-H，任意被取代的-O(C1-C24)烷基，-O(C1-C24)链烯基，-S(C1-C24)烷基，-S(C1-C24)链烯基，-O(C1-C24)酰基，-S(C1-C24)酰基；其中R1和R2中至少有一个不是-H；其中所述的链烯基具有1到大约6个双键，所述的酰基任意地具有1到大约6个双键。R2和R2’是独立的-H，任意地被取代的-O(C1-C7)烷基，-O(C1-C7)链烯基，-S(C1-C7)烷基，-S(C1-C7)链烯基，-O(C1-C7)酰基，-S(C1-C7)酰基，-N(C1-C7)酰基，-NH(C1-C7)烷基，-N((C1-C7)烷基)2，氧，卤素，-NH2，-OH，或-SH；R3是一个磷酸甲酸盐，通过它的羰基或它的膦酸酯基团，连接到可选择的连接头L上的功能基团或Cα上可用的氧原子上，其中当R3是通过膦酸酯基团连接时，所述磷酸甲酸盐的羧酸酯基团具有如下的结构 其中Ry是-H或烷基，或Na+，K+，NH4+，或任何其它生理学上可接受的阳离子，X，当存在时，是 L，当存在时，是具有如下结构-J-(CR2)t-G-的双功能基连接分子，其中t是从1到24之间的整数，J和G是独立的-O-，-S-，-C(O)O-，或-NH-，并且R是-H，烷基，或链烯基；m是从0到6之间的整数；和n是0或1。
全文摘要
对需要治疗的个体，本发明提供了治疗人类免疫缺陷性病毒感染的方法，其包括含有磷酸甲酸盐为药物活性化合物的脂类类似物。认为可能用于本发明实施中的脂类类似物包括通过共价键(直接连接或通过连接分子间接连接)连接到取代的或未取代的烷基甘油、烷基丙二醇、烷基乙二醇、或相关的组分上的磷酸甲酸盐。特别是，本发明提供了用于治疗由对现有抗病毒剂产生了耐药性的病毒引起的病毒感染的治疗方法，也提供了包括含有本发明化合物和叠氮胸苷联合使用、以达到在治疗的过程中对耐药性HIV变种的选择最小化的方法。
文档编号A61K45/06GK1414857SQ00818037
公开日2003年4月30日 申请日期2000年12月22日 优先权日1999年12月29日
发明者K·Y·霍斯泰特勒, J·W·梅勒斯 申请人:加利福尼亚大学董事会