专利名称：含有与含铂抗癌药物组合的去甲基斑蟊素的组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可抑制肿瘤细胞且含有去甲基斑蟊素(demethylcantharidin)的药物组合物，特别涉及可抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞且含有去甲基斑蟊素与铂类抗癌药物所成的组合物的药物组合物及其用途。
背景技术：
去甲基斑蟊素(DMC)是斑蟊素(cantharidin)经修饰的结构，其是“芫菁(blister beetles)”的活性组分。芫菁已被用作中药(TCM)来治疗肝、肺及消化道肿瘤。
顺铂及卡铂二者都是铂(Pt)基药物，并已在世界范围内用于在临床上治疗癌症。与这些药物有关的常见问题包括毒副作用及耐药性。然而，最近的发明(Au-Yeung等人，美国专利6,110,907，此处作为参考)表明具有结构I或II的去甲基斑蟊素铂配合物(参见Au-Yeung的美国专利6,110,907)具有体外抗肿瘤活性。本发明人最新研究表明此专利中含铂配合物具有良好的体内活性，并可防止对顺铂耐药性的发生，及对乳腺癌及肝癌具有选择性。后两种性质(防止耐药性及选择性)是由于包含DMC的缘故。
顺铂 卡铂
奥沙利铂公开在美国专利6,110,907中的去甲基斑蟊素铂配合物包括 结构I结构IIR＝H、C1-C10、或C3-C6的环；-A-A--NH2-(CH2)n-NH2-，n＝2-6 本发明人惊讶地发现DMC或其水解形不仅自身在抑制敏感的、对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长中具有良好活性，而且与含铂抗癌药物的组合物在抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长中具有良好的协同作用。因此提供本发明。
发明概述本发明提供去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形在抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长中的用途。
本发明提供一种抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将所述细胞与一定量的去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形接触。
本发明提供一种抑制个体体内对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将一定数量的去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形给药至所述个体，以有效地抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞的生长。
本发明提供一种含有去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物所成的组合物的药物组合物，此组合物具有可抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的协同作用。
本发明提供去甲基斑蟊素(DMC)在制备用于抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
本发明提供一种抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将细胞与去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物所成的组合物接触。
本发明提供一种抑制个体体内对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物的组合物给药至个体。
附图简要说明
图1表示顺铂+DMC在敏感的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图(isobologram)。
图2表示顺铂+DMC在对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图3表示卡铂+DMC在敏感的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图4表示卡铂+DMC在对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图5表示奥沙利铂+DMC在敏感的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图6表示奥沙利铂+DMC在对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图7表示配合物1+DMC在敏感的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图8表示配合物1+DMC在对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图9表示配合物5+DMC在敏感的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图10表示配合物5+DMC在对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病中的代表性等分光测热自记图。
图11表示顺铂与DMC的组合物(1∶4.5)在对顺铂有耐药性的L1210中的Fa-CI曲线图。
发明详述本发明提供去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形在抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长中的用途。
本发明提供一种抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将所述细胞与有效量的去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形接触。
本发明提供一种抑制个体体内对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将一定数量的去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形给药至所述个体，以有效地抑制所述细胞生长。
此处使用的“水解形”指由DMC或其衍生物水解所得到的药物上可接受的形式，包括但不限于二元酸、一元酸、酯、盐。在一个实施方案中，水解形是DMC的二元酸。
上述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
“有效量”是可有效抑制个体体内肿瘤细胞生长的任何数量，个体通常包括动物或人。确定有效量的方法对于本领域所属技术人员是公知的，并取决于如下因素包括但不限于涉及的个体类型、接触的血样及使用的可检测标记的大小。
本发明使用的术语“给药”指对本领域所属技术人员是公知的任何标准给药方法，实例包括但不限于静脉内给药、腹膜内给药或肌内给药。
本发明提供一种含有去甲基斑蟊素或其水解形与铂类抗癌药物所成的组合物及药学可接受载体的药物组合物，此组合物具有可抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的协同作用。在此组合物中，去甲基斑蟊素或其水解形与铂类抗癌药物的比例覆盖所有对抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长可产生协同作用的比例。一般而言，DMC或其水解形与铂类抗癌药物的比例为55∶1-1∶100，优选为10∶1-1∶10，最优选为1∶1(除非特别指明，下文所述比例指摩尔比)。显而易见，本发明的药物组合物可含有一种或多种铂类抗癌药物。
组合两种或多种治疗药物的目的是为实现较低药物剂量、减少毒性、并最小化或延迟由靶细胞导致的耐药性的出现，并提供潜在的协同作用。本发明首次报道了去甲基斑蟊素与含铂抗肿癌药物的协同组合物，并证实此混合物在对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞系中具有抗肿瘤活性。不同的含铂抗癌药物与DMC以不同比例形成的组合物在化疗探测中是潜在的新候选药物。
用于本发明的铂类抗癌药物包括癌症治疗中已经使用或将被使用的任何含铂药物。在本发明中，此铂类抗癌药物优选选自顺铂、卡铂、奥沙利铂及所有在美国专利6,110,907中受保护的配合物。在美国专利6,110,907中的配合物，配合物1-5是优选的，其具有以下结构 配合物1-4 配合物5(在配合物1-4中，R分别是H、CH(CH3)2、CH3、C2H5)本发明提供去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形在制备用于抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途，并包括将DMC或其水解形与铂类抗癌药物及药物可接受载体的混合。混合DMC或其水解形与铂类抗癌药物及药物可接受载体的方法对于本领域所属技术人员是公知的。药物可接受载体对于本领域所属技术人员也是公知的，其可以为水溶液或非水溶液、悬浮液、乳状液或固体形。载体的实例是丙二醇、聚乙二醇、蔬菜油如橄榄油、水、盐水、葡萄糖、CaCO3以及玉米粉等。肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
本发明提供一种抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将细胞与去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物所成的组合物接触。
本发明也提供一种抑制个体体内对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物的组合物给药至个体。在组合物中去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物的摩尔比为55∶1-1∶100，优选为10∶1-1∶10，最优选为1∶1。
DMC或其水解形以及在美国专利6,110,907中公开的结构I及结构II的含铂配合物作为单一药物在各种如表1及表2所示的细胞系中具有良好的体外抗肿瘤活性。
表1DMC、其二元酸和斑蟊素的体外抗肿瘤活性IC50(μm)化合物DMC水解的DMC斑蟊素细胞L121013.98.327 38.9COLO320DM19.27 46.48 35.64MDA-MB-231 31.791 41.725 10.622SK-OV-3 53.799 46.620 4.978SK-Hep-1 11.475 7.203 3.338表2DMC和配合物1-5的生长-抑制活性(得自3-4个独立试验，IC50/μM±sd，n＝12-16)细胞系顺铂 卡铂1 23 4 5L1210小 0.51±0.1110.14± 2.71±0.40 12.08± 6.19±2.67 5.92±1.94 0.12±0.05鼠白血病3.71 2.35COLO0320-DM人结肠癌 11.90±188.03± 37.25±84.68± 48.92±48.46± 10.10±4.31.50 35.757.149.6810.519.95 8SK-Hep-1人肝癌54.15±500.56± 20.59±17.18±15.44±19.99± 2.97±0.459.81 86.57 5.898.07 6.045.52MDA-MB-231人乳腺癌 65.74±4.31082.66± 63.80±8.2 94.45±9.6 49.43±9.4 62.53± 36.53±
9 156. 81 8 1213.32 13.81NCIH460人肺癌 11.32±60.26± 21.14± 26.46± 3.44±1.98 3.91±2.65 3.14±0.254.9316.3710.65 8.09SK-OV-3人卵巢癌15.16±148.73± 40.75±77.65± 37.19± 62.61±41.93±11.75 34.1314.27 19.8113.3933.51 14.96NTERA-Scl D1人 0.19±0.10 2.75±1.13 0.36±0.25 1.44±0.41 0.84±0.20 0.60±0.24 0.15±0.09睾丸癌含铂抗癌药物与去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形组合物的协同作用实施例1顺铂与DMC的组合铂类抗癌药物与去甲基斑蟊素或其水解形(二元酸)不同比例的组合物对敏感的及对顺铂有耐药性的肿瘤细胞具有协同作用。例如作为协同的结果，当在敏感的L1210细胞系中与去甲基斑蟊素组合时(摩尔比不超过1∶10)时，达到抗肿瘤作用所需的顺铂剂量(与单独的顺铂相当)可减少两倍(表3)。对于可比较的顺铂与DMC比例而言，这种剂量减少在对顺铂在耐药性的L1210细胞系中基本上更加显著(对顺铂有40倍的耐药性)。即达到相同抗肿瘤作用所需顺铂的剂量减少6倍(顺铂∶DMC摩尔比为1∶1)到27倍(顺铂∶DMC摩尔比为1∶6)(表4)。
从表3和表4可看出，在对顺铂有耐药性的L1210中顺铂的剂量减少指数(DRI)通常大于对顺铂敏感的L1210细胞系中的剂量减少指数。这可解释组合DMC与顺铂并通过顺铂与DMC之间的协同作用(图1和图2)可潜在克服对顺铂耐药性的原因。
在抑制敏感的及对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病细胞系生长的72小时接触时间内顺铂、去甲基斑蟊素(DMC)及其组合物的剂量-效应关系*表3敏感的母体L1210小鼠白血病
所有的CI值≤1，表示顺铂与DMC之间有协同作用表4对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病(对顺铂有约40倍的耐药性)
所有的CI值＜1，表示顺铂与DMC之间有协同作用*参数m、Dm与r分别是半数效应曲线图的斜率、x-轴截距的反对数及线性相关系数，表明剂量-效应曲线的形状、效价(IC50)以及数据与质量作用定律的一致性；进行了3组剂量-效应关系试验，每组重复6-8次。
#DRI(剂量减少指数)表示与单独每种药物剂量相比，对于给定程度的作用而言，在组合物中允许的剂量减少数量级(倍)。所有DRI值的计算以经典等分光测热自记图方程及假设为基础。
实施例2卡铂与DMC的组合铂类抗癌药物与去甲基斑蟊素或其水解形(二元酸)不同比例的组合物对敏感的及对顺铂有耐药性的肿瘤细胞具有协同作用。例如，作为协同的结果，当在敏感的L1210细胞系中与去甲基斑蟊素组合时，达到抗肿瘤作用所需的卡铂剂量(与单独的卡铂相当)可减少两倍(表5)。对于可比较的卡铂与DMC比例而言，这种剂量减少在对顺铂有耐药性的L1210细胞系中基本上更加显著(对顺铂有40倍的耐药性)。即达到相同抗肿瘤作用所需卡铂剂量减少17倍(卡铂∶DMC摩尔比为1∶1)到65倍(卡铂∶DMC摩尔比为1∶7)(表6)。
从表5和表6可看出，在对顺铂有耐药性的L1210中卡铂的剂量减少指数(DRI)通常大于对顺铂敏感的L1210细胞系中的剂量减少指数。这可解释组合DMC与卡铂并通过卡铂与DMC之间的协同作用(图3和图4)可潜在克服对顺铂耐药性的原因。
在抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感和对其有耐药性的L1210小鼠白血病细胞系生长的72小时接触时间内卡铂、去甲基斑蟊素(DMC)及其组合物的剂量-效应关系*表5敏感的母体L1210小鼠白血病
所有的CI值≤1，表示卡铂与DMC之间有协同作用表6对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病(对顺铂有约40倍的耐药性)
所有的CI值＜1，表示卡铂与DMC之间有协同作用*参数m、Dm与r分别是半数效应曲线图的斜率、x-轴截距的反对数及线性相关系数，表明剂量-效应曲线的形状、效价(IC50)以及数据与质量作用定律的一致性；进行了3组剂量-效应关系试验，每组重复6-8次。
#DRI(剂量减少指数)表示与单独每种药物剂量相比，对于给定程度的作用而言，在组合物中允许的剂量减少数量级(倍)。所有DRI值的计算以经典等分光测热自记图方程及假设为基础。
实施例3奥沙利铂与DMC的组合奥沙利铂与去甲基斑蟊素或其水解形(二元酸)不同比例的组合物对敏感的和对顺铂有耐药性的肿瘤细胞具有协同作用。例如，作为协同的结果，当在敏感的L1210细胞系中与去甲基斑蟊素组合时，达到抗肿瘤作用所需的奥沙利铂剂量(与单独的奥沙利铂相当)可减少大约两倍(表7)。这种剂量减少对顺铂有耐药性的L1210细胞系中基本上更加显著(对顺铂有40倍耐药性)，即达到相同抗肿瘤作用所需奥沙利铂剂量可减少4倍(表8)。
在抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感和对其有耐药性的L1210小鼠白血病细胞系生长的72接触时间小时内奥沙利铂、去甲基斑蟊素(DMC)及其组合物的剂量-效应关系*表7敏感的母体L1210小鼠白血病
所有的CI值＜1，表示奥沙利铂与DMC之间有协同作用表8对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病(对顺铂有约40倍的耐药性)
所有的CI值＜1，表示奥沙利铂与DMC之间有协同作用*参数m、Dm与r分别是半数效应曲线图的斜率、x-轴截距的反对数及线性相关系数，表明剂量-效应曲线的形状、效价(IC50)以及数据与质量作用定律的一致性；进行了3组剂量-效应关系试验，每组重复6-8次。
#DRI(剂量减少指数)表示与单独每种药物剂量相比，对于给定程度的作用而言，在组合物中允许的剂量减少数量级(倍)。所有DRI值的计算以经典等分光测热自记图方程及假设为基础。
实施例4DMC-Pt配合物1与DMC的组合配合物1与去甲基斑蟊素或其水解形(二元酸)不同比例的组合物对敏感的和对顺铂有耐药性的肿瘤细胞具有协同作用。例如，作为协同的结果，当在敏感的L1210细胞系中与去甲基斑蟊素组合时，达到抗肿瘤作用所需的配合物1的剂量(与单独的配合物1相当)可减少3-5倍(表9)。对于可比较的配合物1与DMC比例而言，这种剂量减少在对顺铂有耐药性的L1210细胞系中基本上更加显著(对顺铂有40倍的耐药性)。即达到相同抗肿瘤作用所需配合物1的剂量减少4倍(配合物1∶DMC摩尔比为1∶1)到17倍(配合物1∶DMC摩尔为1∶5)(表10)。
从表9和表10可看出，在对顺铂有耐药性的L1210中配合物1的剂量减少指数(DRI)通常大于对顺铂敏感的L1210细胞系中的剂量减少指数。这可解释组合DMC与配合物1并通过配合物1与DMC之间的协同作用(图7和图8)可潜在克服对顺铂耐药性的原因。
在抑制敏感的和对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病细胞系生长的72小时接触时间内，配合物1、去甲基斑蟊素(DMC)及其组合物的剂量-效应关系*表9敏感的母体L1210小鼠白血病
所有的CI值＜1，表示配合物1与DMC之间有协同作用表10对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病(对顺铂有约40倍的耐药性)
所有的CI值＜1，表示配合物1与DMC之间有协同作用*参数m、Dm与r分别是半数效应曲线图的斜率、x-轴截距的反对数及线性相关系数，表明剂量-效应曲线的形状、效价(IC50)以及数据与质量作用定律的一致性；n是进行剂量-效应关系试验的组数。
#DRI(剂量减少指数)表示与单独每种药物剂量相比，对于给定程度的作用而言，在组合物中允许的剂量减少数量级(倍)。所有DRI值的计算以经典等分光测热自记图方程及假设为基础。
实施例5DMC-Pt配合物5与DMC的组合配合物5与去甲基斑蟊素或其水解形(二元酸)不同比例的组合物对敏感的和对顺铂有耐药性的肿瘤细胞具有温和的协同作用(图9与图10)。
从表11和表12可看出，在对顺铂有耐药性的L1210中配合物1的剂量减少指数(DRI)与对顺铂敏感的L1210细胞系中的剂量减少指数几乎相同。观察到即使在高比例的DMC时，配合物5的DRI仍然较小，这不同于所观察到的顺铂(实施例1)和卡铂(实施例2)的结果。这意味着配合物5在肿瘤细胞中可单独克服顺铂诱导的耐药性，并且单独的配合物5<p>实施例1-4组合物的稳定性与对照物的稳定性作了比较。样品在常温(25℃，40℃或50℃，如所指明的)贮存4-8周。注意任何轻微分层。测量分层相的高度，各份之和为总组合物高度，100％。
实施例8实施例1-6的组合物显示了安全化作用(通过在常规剂量下减少联吡啶鎓盐与身体组织接触，在兔子体内测定)，该作用与EP 0467529的实施例5组合物的基本相同。明显优于不含三硅酸镁或藻酸盐胶凝剂的相应组合物。
实施例9制备具有以下组成的本发明组合物<p>含铂抗癌药物对顺铂的交叉耐药性总结表13在抑制敏感的及对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病细胞系生长的72接触时间小时内含铂抗癌药物和去甲基斑蟊素(DMC)的剂量-效应关系*#
*参数m、Dm与r分别是半数效应曲线图的斜率、x-轴截距的反对数及线性相关系数，表明剂量-效应曲线的形状、效价(IC50)以及数据与质量作用定律的一致性；进行了3组剂量-效应关系试验，每组重复6-8次。
#使用半数效应曲线分析在fa＝50％时的参数。
所得到的耐药性细胞系对顺铂有约40倍的耐药性，对卡铂有约15倍的交叉耐药性。奥沙利铂与配合物1也表现出不同程度的交叉耐药性。然而，配合物5与去甲基斑蟊素(DMC)表现出可以忽略的交叉耐药性。
对含铂抗癌药物的剂量减少指数(DRI)的总结表14在抑制敏感的及对顺铂有耐药性的L1210小鼠白血病细胞系生长的72小时接触时间内各种铂化合物和去甲基斑蟊素(DMC)的组合物(摩尔比约为1∶1)的剂量-效应关系*#
*参数m、Dm与r分别是半数效应曲线图的斜率、x-轴截距的反对数及线性相关系数，表明剂量-效应曲线的形状、效价(IC50)以及数据与质量作用定律的一致性；进行了3组剂量-效应关系试验，每组重复6-8次。
#使用半数效应曲线分析在fa＝50％时的参数。
对顺铂表现出交叉耐药性的化合物[顺铂(40倍)、卡铂(15倍)、配合物1(8倍)]而言，在对顺铂有耐药性的细胞系中的CI通常低于母体细胞系中的CI，而在对顺铂有耐药性的细胞系中的DRI通常大于在母体细胞系中的DRI。这些数据表明DMC优选指向有耐药性的机制。
实验细节水解DMC的制备将1份DMC溶解在2份1M氢氧化钠中，得到的溶液真空干燥，通过FT-IR及NMR表征所形成的白色固体。
体外抗肿瘤药物筛选使用噻唑蓝微量培养分析方法筛选试验配合物1-5、DMC、水解的DMC、斑蟊素以及对照的顺铂及卡铂，测定其对一系列人癌细胞系及小鼠白血病L1210的体外抗肿瘤活性。
药物将欲被检测的药物以两倍于欲使用的最高浓度溶解在完全培养基中，然后过滤(0.22μm)杀菌。使用完全培养基由每种药物溶液制成一系列对数稀释液。所有药物溶液是在加入到细胞之前的10分钟内制备的。
细胞美国模式培养物保藏所(ATCC)获得，MDA-MB-231(人乳腺)、SK-OV-3(人卵巢)、SK-Hep-1(人肝)、COLO320DM(人结肠)、L1210(小鼠白血病)、NCIH460(人肺)及NTERA-Sc1-D1(人睾丸)。
体外药物接触对于每种欲被检测的药物将完全培养基中的胰蛋白酶化细胞浓度调整为2×105细胞/ml，并将0.1ml的细胞悬浮液加入到96孔微量培养板中24个孔中的每个孔中。然后将此培养板在标准条件下培养24小时以使细胞贴到孔的底部并重新开始指数级生长。在对照培养基和药物/浓度组合物的每个孔中分别加入0.1ml完全培养基与药物溶液。每个药物/浓度组合物重复4次，而对照培养基重复12次。将含有0.2ml完全培养基的12次重复空白样放置一旁以用于计算本底。将培养基再培养72小时。所有试验在不同情况下至少重复3次。
MTT分析使用MTT(噻唑蓝)分析确定不同药物的生长-抑制作用。在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中制备5mg/ml的MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基溴化四唑)溶液，过滤(0.22μm)除菌，并在-20℃下储存。向每个孔中加入0.02ml的MTT溶液，并将培养板在标准条件下培养4小时。然后除去每个孔中的培养基，再向每个孔中加入0.1ml的DMSO(二甲基亚砜)以溶解由MTT代谢减少所生成的着色染料。通过分光光度方法(570nm)确定减少的MTT数量。
数据分析确定所有12个对照孔的平均OD。对于每种药物的每一浓度而言，确定4个孔的平均OD。从空白中减去所有平均OD以计算本底。确定“对照百分数”并绘制曲线。使用Prism 3.0软件通过将此图调整成S型的剂量效应曲线来确定可导致50％生长抑制(IC50)的药物浓度。
在L1210小鼠白细胞中对顺铂耐药性的诱导通过将L1210/0细胞与浓度逐步增加的药物相接触达1年以上(表14)而发展对顺铂有耐药性的L1210细胞系。
铂类抗癌药物与去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形二元酸组合物的协同作用单独评价铂化合物及与去甲基斑蟊素(DMC)组合的铂化合物的细胞毒作用。通过如上所述的MTT分析确定这些化合物的细胞毒性。使用Chou及Talalay的半数效应规则和组合-指数等分光测热自记图方法确定顺铂、DMC、或其不同组合比例混合物的剂量-效应参数。在细胞毒分析中，每种药物或混合物经连续稀释3倍以生成剂量-效应关系。
协同作用分析细节如下使用参考文献1-4中Chou与Talalay的半数效应曲线和组合-指数等分光测热自记图方法分析顺铂和DMC组合物的协同作用、附加作用或拮抗作用。
这种方法包括使用半数效应方程[3，6]对多倍稀释浓度的每种药物及其组合物所绘制的剂量-效应曲线fa/fu＝(D/Dm)m其中fa是受影响的细胞所占的分数(即被杀死的细胞所占的分数)，fu是未受影响的分数(即存活细胞所占的分数；fa＝1-fu)，D是药物剂量，Dm是引起半数效应的剂量。
在参考文献3、5和6中参数m、Dm与r分别是半数效应曲线图的斜率、x-轴截距的反对数及线性相关系数，表明剂量-效应曲线的形状、效价(IC50)以及数据与质量作用定律的一致性。Dm及m值用于计算组合指数(CI)值。
CI＜1、CI＝1及CI＞1分别表示协同作用、附加作用及拮抗作用。以经典的等分光测热自记图方程为基础，可由方程计算CICI＝[(D)1/(Dx)1]+[(D)2/(Dx)2]+[α(D)1(D)2]/[(Dx)1/(Dx)2]其中(D)1为药物1的剂量，(D)2为药物2的剂量，及(Dx)为产生半数效应所需的剂量(＝Dm[fa/(1-fa)]1/m)α＝0为具有相互排斥作用机制的药物，α＝1为具有相互非排斥作用机制的药物。
分析按Chou与Chou(参考文献7)所定义的相互非排斥与相互排斥药物的相互作用。由于在这两个假设的数据间没有实质性的差异，所以仅给出相互排斥假设所提供的数据。
为排除假阳性结果，使用经典的等分光测热自记曲线示踪以确定在合理的分数细胞毒效应(fa＝50％)时的协同作用。
以上所引用的参考文献1.Chou TC，Talalay P.A simple generalized equation for the analysisof multiple inhibitions of Michaelis-Menten kinetics systems.J Biol Chem1977，252，6438-42.
2.Chou TC，Talalay P.Generalized equations for the analysis ofinhibitions of Michaelis-Menten and higher-order kinetics systems with twoor more mutually exclusive and nonexclusive inhibitors.Eur J Biochem1981，115，207-16.
3.Chou TC，Talalay P.Quantitative analysis of dose-effectrelationshipsthe combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv Enzyme Regul 1984，2227-55.
4.Chou TC，Talalay P.Applications of the median-effect principle forthe assessment of low-dose risk of carcinogens and for the quantitation ofsynergism and antagonism of chemotherapeutic agents.In New Avenues inDevelopment Cancer Chemotherapy，Bristol-Myers Symposium series(Harrap KR，Connors TA，eds).New YorkAcademic Press，1987，pp 37-64.
5.Chou TC.Derivation and properties of Michaelis-Menton type andHill type equations for reference ligands.J Theor Biol 1976，59，253-76.
6.Chou TC.The median-effect principle and the combination index forquantitation of synergism and antagonism，chap 2.In Synergism andAntagonism in Chemotherapy(Chou TC，Rideout DC，eds)New YorkAcademic Press，1991，pp 61-102.
7.Chou J，Chou TC.Dose-effect analysis with microcomputersquantitation of ED50，LD50，synergism，antagonism，low dose risk，receptor-ligand and enzyme kinetics.Eur J Biochem.Manual and Software，Biosoft，Cambridge，UK，1987.
剂量减少指数在1988年(Chou和Chou，1988年)首次引入术语“剂量减少指数”或DRI，在1989年将其用于计算机辅助分析(Berman等人，1989年)。DRI说明了在给定程度的作用(即抑制％)与给定组合的比例时，在协同组合物中可允许多少倍的剂量减少。
CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2＝1/(DRI)1+1/(DRL)2
其中(D)1是组合物中药物1的剂量，(D)2是组合物中药物2的剂量，及(Dx)是产生半数效应所需的剂量(仅含药物)(＝Dm[fa/(1-fa)]1/m)。
因此，例如在敏感的L1210中，顺铂∶DMC(1∶1.49)CI＝0.523/0.603+0.779/11.185＝0.936↓↓1/DRI顺铂1/DRIDMC即DRI顺铂＝1.15；DRIDMC＝14.36在对顺铂有耐药性的L1210中，顺铂∶DMC(1∶1.67)CI＝3.836/24.602+6.407/11.969＝0.6915↓ ↓1/DRI顺铂1/DRIDMC即DRI顺铂＝6.42；DRIDMC＝1.87顺铂在耐药性的细胞系中的DRI比在敏感的母体细胞系中的DRI约高5.5倍。这可以解释组合DMC与顺铂可潜在克服对顺铂有耐药性的原因。
以上所引用的参考文献●Chou J.，Chou T.-C.Computerized simulation of dose reductionindex(DRI)in synergistic drug combinations.Pharmacologist 1988；30Abstract A231.
●Berman E.，Duigou-Osterndorf R.，Krown S.E.，Fanucchi M.P.，ChouJ.，Hirsch M.S.，Clarkson B.D.，Chou T.-C. Synergistic cytotoxic effect ofazidothymidine and recombinant interferon alpha on normal human bonemarrow progenitor cells.Blood 1989；741281-6.
Fa-CI曲线图也可建立fa-CI曲线图(图11)以说明连续被稀释的(即沿着整个抑制曲线)混合物中不同作用水平的两种药物的协同作用或拮抗作用。当制成几种混合物时，从曲线中推测最大协同作用的最佳组合比例是可能的。不同作用水平通常给出不同程度的协同作用或拮抗作用。CI＜1、＝1、＞1分别表示协同作用、附加作用或拮抗作用。对于抗肿瘤化疗而言，高作用水平的协同作用与低作用水平的协同作用相比在临床上更相关。
尽管以上已描述了本发明，但根据前述本发明的详细描述对本发明进行的变化和修饰对于本领域所属技术人员是显而易见的。所有这些变化、修饰及其等同物都应包括在所附的权利要求的范围之内。
权利要求
1.去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形在抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
3.一种抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，所述的方法包括将所述细胞与一定量的去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形接触。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
5.一种抑制个体体内对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，所述的方法包括将一定数量的去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形给药至所述个体，以有效地抑制所述细胞的生长。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
7.一种含有去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物所成的组合物及药学可接受载体的药物组合物，所述的组合物具有可抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的协同作用。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
9.如权利要求7所述的组合物，其中去甲基斑蟊素或其水解形与铂类抗癌药物的摩尔比为55∶1-1∶100。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述的摩尔比为10∶1-1∶10。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述的摩尔比为1∶1。
12.如权利要求7-11任一项所述的组合物，其中所述的铂类抗癌药物选自具有下面结构的至少一种配合物 结构I 结构II其中R＝H、C1-C10、或C3-C6的环；-A-A--NH2-(CH2)n-NH2-，n＝2-6
13.如权利要求12所述的组合物，其中R选自H、CH(CH3)2、CH3、C2H5，-A-A-是。
14.如权利要求7-11任一项所述的组合物，其中所述的铂类抗癌药物是顺铂。
15.如权利要求7-11任一项所述的组合物，其中所述的铂类抗癌药物是卡铂。
16.如权利要求7-11任一项所述的组合物，其中所述的铂类抗癌药物是奥沙利铂。
17.去甲基斑蟊素(DMC)在制备用于抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
19.一种抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将细胞与去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物所成的组合物接触。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
21.如权利要求19所述的方法，其中去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物的摩尔比为55∶1-1∶100。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述的摩尔比为10∶1-1∶10。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述的摩尔比为1∶1。
24.如权利要求19-23任一项所述的方法，其中所述的铂类抗癌药物选自具有下面结构的至少一种配合物 结构I 结构II其中R＝H、C1-C10、或C3-C6的环；-A-A--NH2-(CH2)n-NH2-，n＝2-6
25.如权利要求24所述的方法，其中R选自H、CH(CH3)2、CH3、C2H5，-A-A-是
26.如权利要求19-23任一项所述的方法，其中所述的铂类抗癌药物是顺铂。
27.如权利要求19-23任一项所述的方法，其中所述的铂类抗癌药物是卡铂。
28.如权利要求19-23任一项所述的方法，其中所述的铂类抗癌药物是奥沙利铂。
29.一种抑制个体体内对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括将去甲基斑蟊素(DMC)或其水解形与铂类抗癌药物的组合物给药至个体。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述的肿瘤细胞来源于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或鼻咽癌。
全文摘要
本发明提供可抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞且含有去甲基斑蟊素与铂类抗癌药物所成的组合物的药物组合物及其用途。本发明还公开了去甲基斑蟊素或其药物可接受的衍生物与含铂抗癌药物的组合物在抑制对顺铂、卡铂或奥沙利铂敏感的和对其有耐药性的肿瘤细胞中的协同作用。
文档编号A61P35/00GK1499966SQ01823140
公开日2004年5月26日 申请日期2001年5月31日 优先权日2001年5月31日
发明者欧阳植勋, K W 杜, 肯尼斯K·W·杜, 何绮萍 申请人:香港中文大学