专利名称：人参皂甙Re作为制备治疗记忆障碍的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人参皂甙Re作为制备治疗记忆障碍的药物中的应用，具体地，本发明所述的人参皂甙Re不但能改善化学药物(东莨菪碱等)所致记忆障碍，而且具有改善自然衰老，Aβ等所致记忆障碍以及增强基础突触传递、促进LTP形成的作用。
背景技术：
现有技术已经公开了部分类型的人参皂苷的药物用途，例如CN99122651公开了“拟人参皂苷F11的医药用途，该文献指出，拟人参皂苷F11能显著地抑制吗啡引起的记忆障碍并具有较强的改善正常动物和药物所致的动物学习记忆障碍作用。
CN98102890公开了“人参皂甙Re的提取工艺及其新的药物用途，该文献指出，人参皂甙Re在制备治疗心率不齐、心肌缺血和再灌损伤药物中有着广泛的应用。
CN98103433公开了“20(S)-人参皂甙Rg3的半合成方法及其药物用途”，该文献指出，20(S)-人参皂甙Rg3特别适合在制备治疗肺癌、黑色素瘤、S180肉瘤、结肠癌及抗病毒的药物中应用。
CN99814933公开了“含有人参皂甙Rb1的脑细胞或神经细胞保护剂”，该文献指出，施用人参皂甙Rb1或其盐作为细胞保护剂的制剂特别适用于治疗、预防或处理脑和神经疾病。
CN01102117公开了“人参皂甙Rg2在制备治疗心、脑血管疾病药物中的应用”，该文献指出，从人参茎叶中提取分离的人参皂甙Rg2对多种休克、心衰、心肌缺血及脑缺血有明显的治疗作用，其作用优于已知的参麦注射液；用于治疗休克、心衰、冠心病、脑梗塞及老年性痴呆等疾病。
但是，以上这些公开文献都没有具体涉及到本发明所述的适应症或仅仅提出概念而没有具体的实验参数和效果参数。
发明内容
本发明的目的在于实现人参皂甙Re在药物上的应用，具体地讲，本发明的目的在于实现人参皂甙Re在制备改善自然衰老、Aβ等所致记忆障碍以及增强基础突触传递、促进LTP形成的药物上的应用。
由于人参皂甙Re的提取工艺和其他的一些药物用途在现有技术中已经公开，而本发明的主要技术内容是验证人参皂甙Re在本发明所述的适应症上的效果，因此，本发明的人参皂甙Re的提取工艺可参见CN98102890所公开的内容。本发明采用国际上常用的多种行为学方法和电生理方法，分别在成年、老年大鼠及多种记忆障碍模型上观察了人参皂甙Re的改善记忆作用，同时采用电生理学方法观察了Re对突触长时程增强(LTP)的作用，具体可见以下的实施例，通过实施例，可以进一步的理解本发明。
附图1是本发明中使用的小鼠水迷宫装置的示意图。
通过说明书附图并结合本发明的具体内容，可以清楚地理解本发明。
具体实施例方式
实施例1本实施例涉及的是人参皂甙Re促进自然衰老的小鼠和大鼠学习记忆作用的研究。
(1)人参皂甙Re在小鼠水迷宫中对抗自然衰老引起的记忆获得障碍的作用取SPF昆明种老年雄性小鼠64只，体重50±2g，随机分5组，正常老年对照组，人参皂甙Re组(12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)，脑复康组(500mg/kg)，并加一SPF昆明种小鼠正常年青对照组。正常老年和年青对照组灌服水。其余经口灌服给药，给药第11天到第15天进行小鼠水迷宫训练，迷宫的示意图参见附图1。
由附图1可见，水迷宫由一黑色有机玻璃长方体水槽(73×42×20cm)组成，其中有若干隔板组成迷宫；其中1、2、3、4为盲端，迷宫的一角有一组台阶为终点。实验时，迷宫中要灌水，水深10cm，水温24±1℃。
在训练第一天用隔板将A点与B点的通道阻断，小鼠首先被置于台阶上10秒，使其了解此安全区域的存在，然后将小鼠放于起点A，让其自由游泳，记录其进入盲端1的次数(即错误次数)以及爬上安全台阶的时间(即潜伏期)，如果在训练时间2min内尚未找到台阶者，将会被引导到安全台阶处，其潜伏期被记为2min。第一次训练后休息片刻按同样方法训练第二次。依次训练其它小鼠。
在训练的第二天，将隔板置于B点，小鼠的游泳起点为B点，分别记录2min内小鼠进入盲端1、2、3的错误次数，爬上安全台阶的潜伏期，每只小鼠连续训练2次。如果在2min内找不到台阶者，将被引导到终点，其潜伏期被记为2min。
训练第三到四天小鼠的游泳起点为C点，记录2min内小鼠进入盲端1、2、3、4的错误次数和找到安全台阶的潜伏期每只小鼠连续训练二次。
表1人参皂甙Re在小鼠水迷宫中对抗自然衰老引起的记忆获得障碍的作用
(2)人参皂甙Re在小鼠避暗实验中对抗自然衰老引起的记忆获得障碍的作用取SPF昆明种老年小鼠64只，体重50±2g，雄性，随机分5组，正常老年对照组，人参皂甙Re组(12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)，脑复康组(500mg/kg)，并加一正常年青对照组。正常老年和年青对照组灌服水。其余经口灌服给药，给药第16和第17天进行小鼠避暗训练。
实验装置为一条件反射箱，分为明暗两部分，两室中有一小孔洞使小鼠可自由通行，箱底有铜栅，其中暗室底部的铜栅通以36V电压。实验时将小鼠放入明室并背向暗室，因小鼠有喜暗及钻洞的习性，所以在实验训练期间会多次钻入暗室，当小鼠一走入暗室四足接触铜栅时就会受到电击，此行为即为错误，其正常反应为马上设法退出暗室。第一天训练时，记录小鼠在3分钟内进入暗室的次数及第一次进入暗箱的时间。24小时后再做实验，观察5分钟内小鼠首次进入暗箱的时间即潜伏期，小鼠进入暗箱的次数即错误次数。
从表2可见，低中高剂量的人参皂甙Re在潜伏期和错误次数方面均有显著性差异，以高剂量的人参皂甙Re更为显著。
表2人参皂甙Re在小鼠避暗实验中对抗自然衰老引起的记忆获得障碍的作用
(3)人参皂甙Re在大鼠Morris水迷宫测试中对抗自然衰老引起的记忆获得障碍的作用取SD老年大鼠雄性56只，左右随机分5组，正常老年对照组，人参皂甙Re组(6.25mg/kg、12.5mg/kg和25mg/kg)，脑复康组(250mg/kg)，并加一正常年青对照组。正常老年和年青对照组灌服水。其余经口灌服给药，给药第15天到第19天进行大鼠水迷宫训练。
Morris水迷宫主要由一不锈钢制成的园柱形水池和一可移动位置的平台组成。水池上空通过一摄像机与监视器和计算机相连接。当设定的训练时间已到或动物已爬上平台，计算机停止跟踪或停止记录，并记录下游泳轨迹和自动计算出动物在水池中所游过的路程，找到平台所需的时间(即潜伏期)及初始角度(入水瞬间大鼠身体长轴与入水点平台连线之间的夹角)。
预先在水池里注入清水，然后加入溶有1kg新鲜奶粉的水溶液，使池水成为不透明的乳白色，再注入清水使水面高出平台1cm，水湿控制在24±0.5℃，平台置于某一象限的中间，在其它三个象限中任选一入水点，实验每天训练二次，每次采用不同的入水点，每次训练1min的方案。若动物在1min之内尚未找到平台，则将动物拿到平台上并使它在上面停留15s，若大鼠在1min之内找到平台，也让其在平台停留15s，方结束一次训练。如此训练五天，分别记录每只动物的潜伏期，游过的路程。在训练的最后一天，将平台移走，每只大鼠只游1min，分别用秒表记录每只大鼠第一次经过平台的时间一也即潜伏期，并可记录每只大鼠在1min内经过平台的次数以及在平台所在象限(第一象限)内逗留的时间，如果某只大鼠的潜伏期越短而后两个指标越大，则说明这只大鼠越聪明。
表3人参皂甙Re在大鼠Morris水迷宫测试前五天中对抗自然衰老引起的记忆获得障碍的作用
表4人参皂甙Re在大鼠Morris水迷宫测试第八天对抗自然衰老引起的记忆获得障碍的作用
潜伏期#这里实际记录的是撤平台后大鼠在1min内第一次游过平台位置的时间，也就相当于训练前五天的潜伏期。
第一象限时间##是指大鼠游泳时在第一象限中停留的时间总和，也就是在第一象限停留时问占总时间的比率。
在以上的大鼠水迷宫实验中，老年大鼠与青年大鼠相比在训练的第二天至最后一天在潜伏期方面，第二和第三天的游泳路程方面，在训练的第三天与最后一天在初始角度方面以及在训练的最后一天的过台次数方面均有显著性差异，说明此老年大鼠模型成立。脑复康组在训练的第三天与最后一天，高剂量的Re在训练的第四和第五天在潜伏期方面，脑复康组和高剂量的Re组在训练的第三天在游泳路程方面以及在初始角度方面，高剂量的Re在训练的最后一天在第一象限停留时间方面，中剂量的Re在训练的最后一天在潜伏期和过台次数方面与老年大鼠相比均有显著性差异。
实施例2本实施例涉及的是人参皂甙Re对Aβ25-35引起大鼠空间辨别障碍的改善作用。
老年痴呆以老年斑的沉积、神经纤维缠结的形成和神经元丢失为主要病理学特征并以记忆、认知功能障碍为主要的临床表现。β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)(由1-40个氨基酸组成)是老年斑的一个重要的组成成分，具有直接的神经毒性作用。由Aβ中的第25到35这11个氨基酸组成的肽链Aβ25-35也具有凝聚能力和神经毒性，我们利用侧脑室注射凝聚态的Aβ25-35造成空间学习记忆障碍并观察人参皂甙Re的改善作用。
雄性Wistar大鼠体重200g±，Aβ25-35购自Sigma公司，凝聚态的Aβ25-35的制备是将1mg的Aβ25-35溶于3.14ml灭菌的蒸馏水中，终浓度3mmol.L-1(15mmol/5μl)密封后置37℃培养箱中120h。
将48只大鼠分成四组，即手术对照组，模型组，25mg/kg Re组，12.5mg/kg Re组，动物以水合氯醛(150mg/kg)或乌拉坦(750mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立体定位仪上，剃毛并以75％洒精消毒皮肤后沿前后方向正中剪开颅顶皮肤约2cm，小心剥离皮下组织及骨膜，充分暴露颅骨，以电钻在定位坐标为A0.8，L1.8的位置，在右侧颅骨钻一直径1.5mm的小孔，清除骨屑后以尖头镊子小心挑破硬脑膜，随后在立体定位仪引导下，将外径0.8mm的小钢管插入脑室，将5μl Aβ25-35或等量无菌蒸馏水(对照)缓慢(3min)注入侧脑室2min后抽出小钢管并在小孔周围颅骨上酒少量青霉素粉，迅速缝合皮肤，术后次日开始每天灌胃一次，连续给药14天后进行Morris水迷宫训练，共训练5天，其中第5天撤去平台记录动物找到平台所需时间即潜伏期及撤去平台后动物在原放置平台的象限内停留的时间以及到达平台所采取的策略(直线式、趋向式、边缘式、随机式)。
Morris水迷宫装置及测试参见实施例1。
表5人参皂甙Re在Morris水迷宫试验中对Aβ25-35所致空间辨别障碍的改善作用
第5天测定结果表示撤去平台后动物在原放置平台象限内停留时间。
实施例3本实施例涉及人参皂甙Re在小鼠避暗实验、小鼠水迷宫、Morris水迷宫测试中对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用。
人参皂甙Re在小鼠避暗实验中对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用如下，取SPF昆明种小鼠72只，体重20±2g，雄性，随机分6组，正常对照组，东莨菪碱模型组，脑复康组，人参皂甙Re组(12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)，经口灌服给药9天，正常对照组和东莨菪碱模型组灌服水，给药第9和第10天进行小鼠避暗训练。所采用的测试方法同前。
参见表6，从实验结果可以看出，脑复康和人参皂甙Re在小鼠避暗实验中都具有对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用，其中以中剂量组的作用更为显著。
表6人参皂甙Re在小鼠避暗实验中对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用(n＝12)
与东莨菪碱模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01人参皂甙Re在小鼠水迷宫中对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用具体如下取SPF昆明种小鼠72只，体重20±2g，雄性，随机分6组，正常对照组，东莨菪碱模型组，脑复康组，人参皂甙Re组(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)，经口灌服给药17天，正常对照组和东莨菪碱模型组灌服水。给药第14天到第18天进行小鼠水迷宫训练。除了正常对照组外的其余五组在训练的前四天中每天在训练前20min腹腔注射东莨菪碱(5mg/kg)，在训练的五天前所有动物均不注射东莨菪碱。测试方法同前。
训练第三到五天小鼠的游泳起点为C点，记录2min内小鼠进入盲端1、2、3、4的错误次数和找到安全台阶的潜伏期每只小鼠训练2次。
从表7中可以看出，在训练的第四天只有正常对照组与东莨菪碱模型组在潜伏期及错误次数方面有显著差异，脑复康组与模型组相比只在潜伏期方面有差异。在训练的第五天正常对照组和脑复康组与东莨菪碱模型组在潜伏期及错误次数方面有显著差异，而与东莨菪碱模型组相比人参皂甙低剂量组在潜伏期及错误次数方面，中剂量组在潜伏期方面都有差异，可见正常对照组、脑复康组和人参皂甙低、中两个剂量组(25，50mg/kg)在小鼠水迷宫实验中有对抗东莨菪碱所造成的记忆障碍的作用。
表7人参皂甙Re在小鼠水迷宫实验中对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用(n＝12)
与东莨菪碱模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01Morris水迷宫测试，具体如下取SPF昆明种小鼠72只，体重20±2g，雄性，随机分6组，正常对照组，东莨菪碱模型组，脑复康组，人参皂甙Re组(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)，经口灌服给药17天，正常对照组和东莨菪碱模型组灌服水，给药第14天到第18天进行小鼠水迷宫训练。除了正常对照组外的其余五组在训练的前四天中每天在训练前20min腹腔注射东莨菪碱(5mg/kg)，在训练的前五天所有动物均不注射东莨菪碱。测试方法同前。
从表8中可以看出，在训练的第四天只有正常对照组与东莨菪碱模型组在潜伏期及找台路程方面有显著差异，人参皂甙Re低剂量组与模型组相比只在潜伏期方面有差异的趋势。在训练的第五天正常对照组与东莨菪碱模型组相比在潜伏期及找台路程方面有差异，而人参皂甙Re高剂量组在潜伏期方面与东莨菪碱模型组相比有差异，可见正常对照组和人参皂甙高剂量组在Morris水迷宫实验中有一定的对抗东莨菪碱所造成的记忆障碍的作用。
表8人参皂甙Re在小鼠Morris水迷宫实验中对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用(n＝12)
与东莨菪碱模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01从本实施例3可以得出如下结论小鼠经口灌服人参皂甙Re低剂量(12.5mg/kg)，中剂量(25mg/kg)和高剂量(50mg/kg)，在小鼠避暗实验中能明显对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍；在小鼠水迷宫实验中25，50mg/kg剂量的人参皂甙Re有对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用，在小鼠水迷宫实验中，50mg/kg剂量的人参皂甙Re可能有对抗东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用。
实施例4本实施例涉及的是人参皂甙Re对小鼠暂时性脑缺血引起记忆障碍的作用，具体如下取昆明种小鼠雄性，体重18-22克，动物称重后，戊巴比妥纳60mg/kg腹腔注射麻醉，进行手术。术后24小时将动物随机分成5组，分别灌胃给予Re，剂量6.25，12.5，25mg/kg体重。对照组和模型组给予溶剂。此后，每日给药一次至行为学试验结束。术后48小时后完全阻断两侧颈总动脉，于动物出现翻正反射消失后恢复血供。24小时后进行行为学实验。
暂时性脑缺血模型制备动物麻醉后取仰卧位。颈部正中剪开皮肤约7mm，分离两侧颈总动脉，于左侧动脉下置0号白丝线，右侧动脉下置0号黑丝线，供阻断血流用。各线两端燕齐，将四终端通过一段长约5mm PE50塑料管。由颈背部正中穿出皮肤，塑料管埋于皮肤内。用另一黑色丝线穿过黑白两线套住血管的环部，该线的两端由颈下部切口处引出皮肤，缝合切口。缺血时用一镊子轻按颈背部皮肤，拉紧黑白四根线终端，并以动脉夹将四线与皮肤固定，造成大脑缺血状态。缺血结束，松开动脉夹，轻拉颈下引线，即可使颈动脉完全恢复血液再灌注。
避暗实验实验前将小鼠置于避暗箱内适应3min。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，动物穿过洞口进入暗室受到电击，1分钟后取出小鼠。24小时后重作测验，记录进入暗室动物的潜伏期和5min内的电击次数。
水迷宫实验 记录动物从起步区到达目标区所须时间以及在这段时间内动物进入盲端的错误次数，以这两项指标作为学习和记忆成绩。动物每天训练一次，每次2min，连续训练4天。
数据处理数据以mean±s表示，进行组间t检验。
表9人参皂甙Re在避暗实验中对脑缺血再灌注引起的学习记忆功能障碍的影响
表10人参皂甙Re在水迷宫实验中对脑缺血再灌注引起的学习记忆功能障碍的影响
*P＜0.05**P＜0.01在避暗试验中，假手术组与模型组相比，在潜伏期与错误次数等行为学指标上均有显著性差异，模型成立。Re12.5mg/kg、25mg/kg可减少错误次数。
在水迷宫试验中，第四天游泳潜伏期假手术组与模型组相比，显著缩短。25mg/kg组与模型组相比有极显著差异，6.25mg/kg，12.5mg/kg组潜伏期短于模型组，但未有显著性差异。
实施例5本实施例涉及的是人参皂甙Re对麻醉大鼠海马齿状回基础突触传递活动的影响，目前对促智药的研究，不但要提供行为学研究证据，也要采用电生理学技术来证明它对神经突触可塑性的影响，主要观察对突触长时程增强(LTP)的作用，它被认为是中枢神经系统学习记忆的细胞模型。
具体实验是，Wistar大鼠用20％乌拉坦1.0g/kg腹腔注射麻醉后，固定于立体定位仪上。在定位坐标为AP0.8，L1.8，H3.5处植一篓管于侧脑室内，在AO3.8，L2.5，H3.5处植一记录电极于海马齿状回颗粒细胞层，在AP7.5，L4.2，H3.5-4.0处植一刺激电极于内嗅区穿质通路(perforant path，PP)。调整刺激电极的位置，找到固定刺激强度下可记录到最大群峰电位振幅(population spike amplitude，PSA)时的位置，固定不动。测试刺激是波宽0.2ms的方波，频率为1/30Hz，刺激强度为引起最大PSA所需刺激强度的1/3-1/2。Re用0.01％的DMSO溶解并稀释至不同浓度，通过植入侧脑室的篓管给予，对照组给0.01％DMSO。记录给约前30min的PSA，然后在5min内将5μl的待测物缓慢注射入侧脑室，记录给药后60min内的PSA，取15min、30min、60min三点进行统计。取给药前PSA的平均值代表给药前的基础突触传递水平，再用此均值去除给药后15min、30min、60min各点的PSA，得出各点PSA相对值(％)。组内求均值及标准偏差，组间作t检验。
从表11可以看出，侧脑室注射Re可使海马齿状回基础突触传递反应增强。Re浓度为10-5M时增加不很明显，在60min时才达到了135±20.6％；随着Re浓度的降低，PSA的增幅逐渐加大，10-6M在30min就达到了138.9±10.6％；以10- 7M浓度增幅最大，给药后15min达到了138.4±18.0％，并持续增加，到60min时达189.6±63.0％。可视为最适剂量；10-8M的PSA增幅较10-7M又有所下降，但也在30min达到152.2±32.4％。10-6M、10-7M、10-8M三个剂量组PSA增幅均超过了30。
表11 人参皂甙Re对大鼠海马LTP形成的影响
P＜0.05，*P＜0.01，***P＜0.01 vs control突触传递的长时程增强(long-term potentiation，LTP)认为是中枢神经系统学习记忆的细胞学模型，成为学习记忆的细胞学模型，成为学习记忆过程中神经元生理活动的客观指标。本实验发现人参皂甙Re在10-6M、10-7M、10-8M剂量下侧脑室给药对麻醉大鼠海马齿状回基础突触传递有增强作用，且能形成LTP形象，此结果为人参的促智作用研究丰富了新的内容。
人参皂甙Re是人参中的一个重要化学成分，它能改善化学药物(东莨菪碱等)所致记忆障碍，以及改善自然衰老，Aβ等所致记忆障碍以及增强基础突触传递、促进LTP形成的作用属首次发现，为把人参皂甙Re开发成一个促智药提供了较充分的实验依据。
权利要求
1.一种人参皂甙Re作为制备治疗老年性痴呆、记忆障碍的药物中的应用。
2.一种人参皂甙Re作为制备改善β-淀粉样肽引起的空间辨别障碍的药物中的应用。
3.一种人参皂甙Re作为制备改善自然衰老引起的记忆障碍的药物中的应用。
4.一种人参皂甙Re作为制备治疗东莨菪碱所致记忆障碍的药物中的应用。
5.一种人参皂甙Re作为制备增强基础突触传递、促进LTP形成的药物中的应用。
6.一种人参皂甙Re作为制备治疗脑缺血引起的记忆障碍的药物中的应用。
7.根据权利要求1至5任何一项权利要求所述的应用，其特征在于所述的人参皂甙Re的用量为12.5-50mg/kg。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的人参皂甙Re的用量优选为25-50mg/kg。
全文摘要
本发明涉及的是一种人参皂甙Re的药物应用，具体地，本发明涉及的是人参皂甙Re作为制备治疗记忆障碍的药物中的应用，本发明的研究人员采用多种行为学方法，分别在成年、老年大鼠及多种记忆障碍模型上观察了人参皂甙Re的改善记忆作用，同时采用电生理学方法观察了Re对突触长时程增强(LTP)的作用，得出的结论是人参皂甙Re不但能改善化学药物(东莨菪碱等)所致记忆障碍，而且具有改善自然衰老，Aβ等所致记忆障碍以及增强基础突触传递、促进LTP形成的作用。
文档编号A61P25/00GK1498621SQ02149320
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月7日 优先权日2002年11月7日
发明者张均田, 李平亚, 赵文杰 申请人:北京鑫利恒医药科技发展有限公司