抑制血管生成的方法

专利名称：抑制血管生成的方法
相关申请的交叉参考本申请是非临时申请，其要求在2001年5月23日提交的发明名称为“用于抑制血管生成的化合物和方法”的第60/292,947号美国临时专利申请的优先权。
STATEMENT REFEDERALLY SPONSOREDRESEARCH/DEVELOPMENT(Not Applicable)发明背景本发明提供了有效地抑制血管生成和消退已有血管的方法。更具体来说，本发明涉及在患有这类疾病的包括人在内的活体动物中治疗与病源性血管生成有关的疾病和递送抗血管生成活性的方法。
血管生成是由原有微血管生长出新血管。血管生成过程在创伤愈合、胎儿和胚胎发育以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成中是一个自然而有序的过程。这些过程对于健康和生长是至关重要的，并受到生长血管促进剂和抑制剂的良好调节。然而，在疾病状态下，这种调节可被绕过而导致病源性血管生成。病源性血管生成是不希望的血管生成，并且是治疗干预的目标。很多人类疾病其特点就在于多余血管生成。这些疾病包括癌症、糖尿病性视网膜病、老年黄斑变性、关节炎性淋巴结炎的形成和牛皮癣。
例如在癌症中，血管生成在肿瘤的存活和转移中起关键作用。肿瘤分泌促进内皮细胞分裂和迁移的血管生成因子，这就开始了血管生成过程。现已清楚，肿瘤需要形成血管来生长和转移。如果减少肿瘤的血液供应，肿瘤的生长就不会超过0.4mm。缺少足够的血液供应，肿瘤细胞最终会坏死和/或凋亡。因此，血管系统，特别是新的血管生长或血管生成是肿瘤生物学的一个重要方面。针对血管生成的治疗可以使这些疾病得到根除或减缓。
与眼病例如糖尿病性视网膜病和老年黄斑变性有关的发病机理和失明是多余血管生成的直接结果。在眼组织中，血管生成是失明的最主要原因。增生性糖尿病性视网膜病的特征是视网膜血管侵袭玻璃体。老年黄斑变性是黄斑疾病，并且由于脉络膜血管穿透脉络膜基底层向内生长而不同于干的形式。血管生成病理学也与早熟性视网膜病、角膜移植排斥、新血管性青光眼和晶状体后纤维组织形成有关。与视网膜/脉络膜新血管生成有关的疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病、黄斑变性、镰状细胞性贫血、肉样瘤、梅毒、弹力纤维性假黄瘤和佩吉特病。
发明概述一方面，本发明涉及抑制内皮细胞血管形成的方法，所述方法包括将具有内皮细胞的细胞、组织或器官与抗血管生成量的式I化合物接触。式I化合物具有下面通式式I 在式I中，R1和R2是官能团，包括但不限于羟基。
在式I中，R3是官能团，包括但不限于氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和COOCH3。
在式I中，R4是官能团，包括但不限于氢、C1-C6-烷氧基、葡萄糖、B-D-吡喃葡萄糖、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、卤素、NO2、NH3、碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂质。
在式I中，R5是官能团，包括但不限于氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和CH3。
在式I中，X1-X3是官能团，包括但不限于氧、硫、-CH2-或羧基，其可以是不同的但优选是相同的官能团。
在本发明优选的实施方案中，式I化合物是如在第十版默克索引第6709号专刊中所述的橄榄苦苷，其分子式是C25H32O13，并且结构如式II所示。
式II 可包括植物提取物x的任何乙醇、丙酮、无机和有机酸或碱和/或水提取物的植物提取物x含有橄榄苦苷-式II所示化合物。植物提取物x是从植物中得到的，所述植物包括但不限于洋橄榄属(Oleaeuropaea L.)橄榄树、女贞树、Ligustrum obtusifolium(木犀科)等的叶、芽、果实、木、树皮和根。
在另一方面，本发明涉及有效抑制组织或器官中的多余血管生成的方法，所述方法包括以足以抑制血管生成的量，将细胞与如下物质接触植物提取物x的乙醇、丙酮、无机和有机酸或碱和/或水溶液，或乙醇、丙酮、无机和有机酸或碱和/或水溶液的衍生物或其成分，所述溶液、溶液的衍生物或其成分含有橄榄苦苷-式II所示化合物或式I所示其衍生物或其水解产物，或其药物组合物，所述衍生物或水解产物包括但不限于橄榄苦苷苷元、洋橄榄酸(elenolic acid)、β-3，4-二羟基苯基乙基醇和甲基-o-甲基洋橄榄酸酯(elenolate)。在本发明优选的实施方案中，所述细胞是活体中的细胞。
在另一方面，本发明涉及治疗由不利且失控的血管生成介导或带来的血管生成相关疾病的方法，所述方法包括以足以抑制血管生成的剂量给活体动物施用如下物质的抗血管生成化合物提取物x的乙醇、丙酮、无机和有机酸或碱和/或水溶液，或乙醇、丙酮、无机和有机酸或碱和/或水溶液的衍生物或其成分，所述溶液、溶液的衍生物或其成分含有橄榄苦苷-式II所示化合物或式I所示其衍生物或其水解产物，所述衍生物或水解产物包括橄榄苦苷苷元、洋橄榄酸(elenolic acid)、β-3，4-二羟基苯基乙基醇和甲基-o-甲基洋橄榄酸酯(elenolate)，或其药物组合物。这类方法有助于改善特征在于异常或不需要的血管生成或内皮细胞增殖和/或迁移症状的影响。
通过随后的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点和其优选实施方案将会变得显而易见。
附图简要描述通过参考附图，本发明的这些以及其它特征将会变得更加显而易见，其中图表1A.基于小鸡绒膜尿囊膜(CAM)中血管结节数目的橄榄苦苷抑制血管生长的图。柱状图代表平均和标准误差值。统计学显著性是用非配对的t检验获得的。
图表1B.基于CAM中血管末梢数目的橄榄苦苷抑制血管生长的图。柱状图代表平均和标准误差值。统计学显著性是用非配对的t检验获得的。
附

图1.表明橄榄苦苷水溶液抑制血管生成的代表照片。向三天大的小鸡胚胎中注射含有9.3μmol/卵橄榄苦苷的0.5cc溶液。把注射液直接注射到卵黄囊内。注射后将胚胎孵化4天。把卵弄破并用Kodakmds 100照相机给CAM拍照。
附图2.表明橄榄苦苷水溶液抑制血管生成的代表照片。向三天大的小鸡胚胎中注射含有9.3μmol/卵橄榄苦苷的0.5cc溶液。把注射液直接注射到卵黄囊内。注射后将胚胎孵化4天。把卵弄破并用Kodakmds 100照相机给CAM拍照。
附图3.表明对照中血管生成水平的代表照片。水溶液对血管生成的影响。向三天大的小鸡胚胎中注射0.5cc蒸馏水。把注射液直接注射到卵黄囊内。注射后将胚胎孵化4天。把卵弄破并用Kodak mds 100照相机给CAM拍照。
附图4.比较对照和试验的CAM的毛细血管床。结果显示用橄榄苦苷治疗的卵中毛细血管消失。
附图5.包括CAM的完整胚胎封固物。表明橄榄苦苷对于CAM的大小和随之对胚胎大小的影响。
附图6.表明橄榄叶提取物水溶液抑制血管生成的代表照片。照片(A)、(B)和(C)代表注射了水/生理盐水的对照胚胎的CAM。照片(D)、(E)和(F)代表注射了0.5cc橄榄叶提取物的小鸡胚胎。把注射液直接注射到卵黄囊内。注射后将胚胎孵化4天。把卵弄破并用Kodak mds 100照相机给CAM拍照。
附图7.表明橄榄苦苷水溶液抑制血管生成的对比照片。照片(A)显示的是没有被烧灼或未经任何处理的成年小鼠的耳朵。血管形成代表的是通常在成年小鼠耳朵中发现的血管形成。照片(B)代表通过氢氧化钠烧灼而诱发的血管生长。与未烧灼的耳朵相比，其产生了显著的血管生成反应。照片(C)显示了烧灼区域中更为详细的血管生成反应。可以看到，血管从已有血管萌发出来并向烧灼区域蔓延。照片(D)显示的是已被烧灼，但是新的血管生长由于腹膜内注射了橄榄苦苷而得到抑制的小鼠耳朵。
附图8.表明橄榄苦苷水溶液抑制血管生成的对比照片。照片(A)、(B)、(C)和(D)显示了如下所述已被氢氧化钠烧灼的成年小鼠耳朵。血管形成代表通过氢氧化钠烧灼而诱发的血管生长。与未烧灼的耳朵相比，其产生了显著的血管生成反应。照片(E)、(F)、(G)和(H)显示已被氢氧化钠烧灼，但用橄榄苦苷对小鼠进行了治疗的小鼠耳朵。通过橄榄苦苷治疗，血管生长被有效抑制。
发明详述下文给出的详细描述是为了描述本发明目前的优选实施方案，并不意味着其代表着可实施或利用本发明的唯一形式。该描述提出了实施本发明的步骤的功能和顺序。然而，应当理解，相同或等同的功能和顺序可以通过不同的实施方案来完成，并且等同的功能和顺序也意图包括在本发明范围内。
A.定义术语“动物”是指具有封闭的血管循环系统的生物体，包括鸟类、哺乳动物和鳄鱼。本文所用术语“动物”也包括人主体。
术语“血管生成”是指在细胞、组织、器官或肿瘤内产生新的血管。
术语“转移”是指肿瘤细胞扩散到身体远处部分的过程。该术语在本文中也用来指通过经由转移过程发展的肿瘤。
术语“接触”在本文中与下列术语可交互地使用组合、加到、混合、传给、与其培养、流过等。而且，本发明化合物能够用本文所述的各种常规方法例如非胃肠道、口服、局部和吸入途径来“给药”。
术语“可药用盐”是指保留了游离碱的生物有效性和性质的化合物的盐，其通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等反应来获得。可药用盐包括例如碱金属盐如钠盐和钾盐，碱土金属盐和铵盐。
“足够量”、“有效量”、“治疗有效量”、或“抗血管生成量”是指有效降低、抑止或抑制血管生成或导致与血管生成性疾病有关的症状得到改善的化合物或组合物的量。在接受剂量后，所需结果可以是症状的主观减轻，或者是客观上可辨认的好转，也就是临床医生或其他有资格的观察者注意到的内皮细胞血管形成的减少或血管生成速度的降低。
术语“治疗癌症”、“治疗”等一般是指患有癌症的哺乳动物的任何好转，其中好转可以归因于用本发明化合物的治疗。好转可以是主观的或者是客观的。例如，如果哺乳动物是人，患者就可以注意到精力或活力的增强或疼痛减轻，以作为主观上的症状好转或对治疗的反应。另一方面，临床医生可以基于身体检查、实验室参数、肿瘤标志物或放射照片结果而注意到肿瘤的减小或瘤重减轻。临床医生可以观察的对治疗产生反应的一些实验室征状指标包括试验标准化例如白血球数量、红血球数量、血小板数量、红血球沉降速度和各种酶的水平。此外，临床医生可以观察可检测的肿瘤标志物的减少。另一方面，其它试验也可以被用来评价客观的改善，如声象图、核磁共振检测以及正电子发射检测。
“抑制肿瘤细胞生长”能用检测肿瘤细胞的生长是否减慢或消失的任何可接受的方法进行评价。这包括直接的观察和间接的评价，例如上面所述的主观症状或客观征状指标。
术语“烷基”在本文中用来指具有1-12个碳原子、优选1-6个碳原子的支链或非支链、饱和或非饱和一价烃基。当烷基具有1-6个碳原子时，其称为“低级烷基”。合适的烷基包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-丙烯基(或烯丙基)、正丁基、叔丁基、异丁基(或2-甲基丙基)等。如本文所用，该术语包括“取代的烷基。”“取代的烷基”是指刚才所述的烷基，其包括一个或多个官能团例如低级烷基、芳基、酰基、卤素(即卤代烷基，例如CF3)、羟基、氨基、烷氧基、烷基胺、酰基氨基、酰氧基、芳氧基、芳氧基烷基、巯基、饱和和不饱和环烃、杂环等。这些基团连接在烷基部分的任何碳原子上。
术语“S-烷基”在本文中用来指基团-SR，其中R是如本文所定义的低级烷基或取代的低级烷基。
术语“芳基”在本文中用来指芳香族取代基，其可以是单个芳环或稠合在一起、共价连接或连接到共有基团例如亚甲基或亚乙基部分上的多个芳环。共有连接基团也可以是羰基，例如在二苯甲酮中的羰基。芳环可包括苯基、萘基、联苯、二苯基甲基和二苯甲酮等。术语“芳基”包括“芳基烷基”。
“取代的芳基”是指如刚才所述的芳基，其包括一个或多个官能团例如低级烷基、酰基、卤素、卤代烷基(例如CF3)、羟基、氨基、烷氧基、烷基胺、酰基氨基、酰氧基、巯基以及稠合到芳环上、共价连接或连接在共有基团例如亚甲基或亚甲基部分上的饱和与非饱和环烃。连接基团也可以是羰基，例如在环己基苯基酮中的羰基。术语“取代的芳基”包括取代的芳基烷基”。
术语“卤素”在本文中用来指氟、溴、氯和碘原子。
术语“羟基”在本文中用来指基团-OH。
术语“氨基”用来指基团-NRR’，其中R和R’可独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代芳基或酰基。
术语“硝基”在本文中用来指基团-NO2。
术语“烷氧基”在本文中用来指-OR基团，其中R是低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基或取代的芳基烷基，其中所述烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基和取代的芳基烷基如本文所述。合适的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、苯氧基、取代的苯氧基、苄氧基、苯乙氧基、叔丁氧基等。
术语链烯基”在本文中用来指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链、直链或环状一价烃基。该基团可以是沿双键的顺式或反式构型。合适的链烯基包括例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、环丙烯基、丁烯基、异丁烯基、环丁烯基、叔丁烯基、戊烯基、己烯基等。
术语“炔基”在本文中用来指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链、直链或环状一价烃基。合适的炔基包括例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、戊炔基、己炔基等。
B. 化合物本发明涉及这样的发明，即式I化合物抑制血管生成并且可用于治疗血管生成性疾病。
式I化合物具有下面通式通式I
其中R1、R2、R3、R4、R5以及X1、X2和X3如上所定义。在本发明的优选实施方案中，式I化合物是如下面式II所示的橄榄苦苷通式II 橄榄苦苷-用于本发明的化合物可易于从植物中获得，所述植物包括但不限于洋橄榄属橄榄树和女贞树、Ligustrum obtusifolium(木犀科)。
用体外和体内筛分测定能够易于鉴定适用于本发明方法的化合物。这样的测定可以筛选特定化合物在体外和体内抑制血管生成或内皮细胞血管形成的能力。例如，下面更加详细描述的小鸡胚胎绒膜尿囊膜(CAM)测定能够用来鉴定所给化合物抑制血管形成的能力。在本发明所进行的绒膜尿囊膜分析中，给受精的小鸡胚胎在3或4天时注射化合物。注射后让胚胎孵育4天，然后把壳弄破并给绒膜尿囊膜拍照。根据存在于CAM中的血管结节和末梢数目就可以分析血管形成的情况。这种测定可用来评价本发明化合物的抗血管生成特性。对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的化合物可以单独、以可药用盐的形式和/或以药物组合物的形式给药。
C.使用本发明化合物如上所述，本发明涉及这样的发明，即式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物可用于抑制血管生成，并因此可用于治疗与多余血管生成有关的疾病。因此，在一个实施方案中，本发明提供了抑制细胞中多余血管生成的方法，所述方法包括将细胞与有效量，即抗血管生成量的式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物或其水解产物的水解产物接触。在另一实施方案中，本发明提供了抑制内皮细胞血管形成的方法，所述方法包括将含有内皮细胞的细胞、组织或器官与有效量的式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物接触。在本发明优选的实施方案中，细胞是在动物个体内。
本发明涉及治疗与不利且失控的血管生成有关的疾病的方法，所述方法包括给动物以足以抑制血管生成的量，即剂量施用式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物。式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物抑制血管生成和/或血管生成性疾病所需的特定剂量取决于疾病的严重程度、给药途径以及由主治医生所决定的相关因素。通常，可接受且有效的日剂量是足以有效抑制血管生成和/或血管生成性疾病的量。
本发明提供的治疗方法是这样实施的将有效抑制血管生成和/或血管生成性疾病剂量的式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物(或它们的可药用盐或溶剂化物)施用给有此需要的动物。本文所用术语“抑制”包括它的一般公认的含义，包括对有可能患血管生成和/或血管生成性疾病的人进行预防性治疗，以及控制和/或治疗已有的血管生成和/或血管生成性疾病。因此，按照需要，本发明包括医疗性和/或预防性治疗。
本发明方法可用于治疗各种各样的疾病。可以用本发明方法治疗的与角膜新血管形成有关的疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、角膜移植排斥、新血管性青光眼和晶状体后纤维增生、流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、隐形眼镜过度磨损、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干性角膜炎、斯耶格伦病、酒渣鼻、phylectenulosis、梅毒、分支杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、莫伦溃疡、Terrien′s边缘变性、边缘性角质层分离、创伤、类风湿性关节炎、全身性狼疮、多动脉炎、韦格纳肉样瘤病、巩膜炎、史蒂文斯-约翰逊疾病、periphigoid放射状角膜切开术和角膜移植排斥。
用本发明方法治疗的与视网膜/脉络膜新血管形成有关的疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病、黄斑变性、镰状细胞贫血、肉样瘤、梅毒、弹力纤维性假黄瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性眼色素层炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早熟视网膜病、伊尔斯病、Bechets病(白塞病)、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假定的眼组织胞浆菌病、Bests病、近视、视力凹陷(optic pits)、施塔加特病、pars planitis、慢性视网膜脱离、高粘滞性综合症、弓形体病、创伤和激光后并发症。其它疾病包括但不限于与潮红(角新血管生成)有关的疾病以及由维管组织或纤维组织异常增殖引起的疾病，包括与糖尿病有关或无关的各种形式的增殖性玻璃体视网膜病。
与慢性炎症有关的疾病也能够用本发明方法治疗。具有慢性炎症症状的疾病包括但不限于炎性肠病例如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎、牛皮癣、肉样瘤病和类风湿性关节炎。不利或失控的血管生成是这些慢性疾病所共同具有的重要特征。慢性炎症依赖于毛细血管萌发的连续形成来维持炎性细胞的涌入。由于炎性细胞的涌入和存在而产生肉芽肿，结果就保持了慢性炎症状态。用本发明组合物和方法抑制血管生成可防止肉芽肿的形成，从而使疾病得以减轻。
如上所述，本发明方法可以用于治疗患有炎性肠病例如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎的患者。局限性回肠炎是以最通常侵袭末端回肠和结肠的慢性透壁性炎症形式存在的，但也可以发生于从口至肛门和肛周区域的肠胃道的任何部分。患有局限性回肠炎的患者通常具有与腹痛、发热、食欲缺乏、体重减轻和腹涨有关的慢性腹泻。用本发明方法和组合物防止血管生成可抑制毛细血管萌芽的形成并阻止形成肉芽肿。溃疡性结肠炎也是慢性、非特异性炎性及出现慢性粘膜溃疡的疾病，并且以存在带血的腹泻为特征。
炎性肠病也会侵袭皮肤。皮肤损害以发炎和血管生成为特征，并且在除肠胃道以外的许多位置上都可以发生。通过阻止血管生成并因此减少炎性细胞的涌入和损害的形成，本发明组合物和方法也能够用于治疗这些损害。
肉样瘤病是另一种特征为多系统性肉芽肿病的慢性炎性疾病。这种疾病的肉芽肿可以在身体的任何地方形成，因此其症状取决于肉芽肿的位置及疾病是否活动。肉芽肿是由不断地提供炎性细胞的血管生成性毛细血管芽产生的。本发明化合物和方法可以用来治疗肉样瘤病。
本发明方法也可以用来治疗与牛皮癣有关的慢性炎症。作为一种皮肤病的牛皮癣是以不同大小的丘疹和斑块为特征的另一种慢性和复发性疾病。阻止为维持特征性损害所必需的新血管形成就可以使症状减轻。
可以用本发明方法治疗的另一种疾病是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是一种以外周关节的非特异性炎症为特征的慢性炎性疾病。据信关节滑膜层中的血管发生了血管生成。除了形成新的血管网络以外，内皮细胞释放导致血管翳生长和软骨破坏的因子和反应性氧物质。参与血管生成的因子可有效地促进和帮助维持类风湿性关节炎的慢性发炎状态。
可用本发明方法治疗的其它疾病是血管瘤、Osler-Weber-Rendu病或遗传性出血性毛细血管扩张病、实体或血液生成性肿瘤和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
本发明方法还有效抑制与恶性肿瘤生长有关的血管生成。其包括在细胞、组织和器官上的癌性肿瘤生长。本发明方法可用于治疗多种肿瘤细胞的生长和治疗多种癌症。这样的肿瘤细胞包括，例如但不限于肺、结肠、乳腺、卵巢、前列腺和肝脏肿瘤细胞以及鳞状细胞癌。这样的癌症包括，例如但不限于癌如咽癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌和膀胱癌；白血病；淋巴瘤；神经胶质瘤；视网膜神经胶质瘤；和肉瘤。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及将式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷与活性免疫治疗(例如肿瘤接种)联合进行的方法。
此外，按照以上方法，哺乳动物个体包括但不限于人、实验室动物、家庭宠物和农场动物。
D.药物制剂/给药途径在本发明方法中，式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物可以单独、以可药用盐的形式或以药物组合物的形式提供或施用给哺乳动物例如人类患者，其中在药物组合物中，化合物与合适的载体或赋形剂以治疗的有效量，例如有效降低、抑止或抑制血管生成或导致与血管生成性疾病有关的症状好转的剂量混合。
用于本发明方法的式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物可以掺入到各种用于治疗给药的制剂中。更具体地说，通过与适当的可药用载体或稀释剂结合，可以将式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、粒剂、糖锭剂、凝胶剂、糖浆剂、软膏剂、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。这样，化合物的给药可以以各种方法实现，包括口、颊、直肠、非胃肠道、腹膜内、真皮内、经皮、鞘内途径等给药。此外，可以将化合物以局部而不是全身方式给药，例如把化合物直接注射到实体瘤内，通常是在贮药库或持续释放制剂中。此外，可以将化合物在靶向药物递送系统中，例如在包被有肿瘤特异抗体的脂质体中给药。这样的脂质体将会选择性地靶向递送给肿瘤并被肿瘤吸收。
另外，可以将式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物与常用赋形剂、稀释剂或载体一起配制，并压制成片剂，或制成便于口服给药的酏剂或溶液，或通过肌内或静脉内途径给药。化合物可以经皮给药，并可以制成持续释放剂型等。
可以将式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物单独给药，彼此联合给药，或者将它们与其它已知的化合物(例如其它抗癌药物或其它药物如AZT、抗炎药、抗生素、皮质类固醇、维生素等)联合给药。例如，可以将式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物与其它已知的抗血管生成化学治疗剂或抗肿瘤剂(例如长春花属生物碱、抗生素、抗代谢药物、铂配位络合物等)一起用于联合治疗。例如，可以将式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物与下列药物用于联合治疗长春花属生物碱化合物，例如长春碱、长春新碱、紫杉醇等；抗生素，例如阿霉素(多柔比星)、放线菌素D(更生霉素D)、柔红霉素(道诺霉素、正定霉素)、博莱霉素、普卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)等；抗代谢药物，例如甲氨蝶呤、阿糖孢苷(AraC)、氮尿苷、阿扎立平、氟脱氧尿嘧啶核苷、脱氧考福霉素、巯基嘌呤等；或铂配位络合物，例如顺铂(顺-DDP)、卡铂等。另外，本领域技术人员将会理解，本发明化合物可以与其它已知的抗血管生成化疗或抗肿瘤化合物一起用于联合治疗。在药物剂型中，可以将化合物以其可药用盐的形式给药，或者也可将其单独或适当联合以及与其它可药用活性化合物联合使用。
本文所述药物组合物可以用本领域技术人员已知的方法制备，即用常规的混合、溶解、制粒、包糖锭、磨细、乳化、装胶囊、包埋或冻干处理方法制得。下述方法和赋形剂仅是示例性而决非限制性的。
对于注射剂，可以通过将化合物溶解、悬浮或乳化在水或非水溶剂例如植物油或其它类似的油、合成的脂族酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中来将其制备成制剂；如果需要，还可使用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。优选地，将本发明化合物在水溶液中，优选在生理相容性缓冲液如Hanks溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液中配制。为透膜给药，在制剂中使用适合于要透过的屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域是通常已知的。
对于口服给药，式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物可通过与本领域众所周知的可药用载体组合在一起来容易地配制。这样的载体能够使化合物配制成供受治疗的患者口服摄取的片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、乳剂、亲脂或亲水性悬浮液、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮液等。用于口服的药物制剂可这样获得将化合物与固体赋形剂混合，任选将所得混合物磨碎，如果需要的话加入合适的辅助剂后，加工颗粒混合物以获得片剂或糖锭剂的核芯。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐如藻酸钠。
给糖锭剂核芯包上适当的包衣。为此，可使用浓的糖溶液，该溶液可任选含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。为了辨别或区别不同活性化合物的组合，可以将颜料或色素添加到片剂或糖锭剂包衣中。
可口服使用的药物制剂包括用明胶制成的推入配合型胶囊，以及用明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的软的密封的胶囊。推入配合型胶囊可含有活性成分与填充剂例如乳糖，粘合剂例如淀粉，和/或滑润剂例如滑石粉或硬脂酸镁，和任选稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于适宜的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可加入稳定剂。所有的口服制剂都应当具有适于这种给药的剂量。对于颊给药，组合物可以呈以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。
对于吸入给药，用于本发明的化合物是从使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体的加压包装或喷雾器中以气雾形式方便地喷出，或者是从不含推进剂的干粉吸入器中方便地喷出。在使用加压气雾剂的情况下，通过提供一个递送计量剂量的阀门来确定单位剂量。用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊和药筒可以配制成含有化合物与合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物的形式。
可以将化合物配制成用于经由注射例如快速浓注或连续输注来进行的非胃肠道给药的形式。注射制剂可以在单位剂型中提供，例如在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中提供。组合物可以呈在油或水载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制助剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于非胃肠道给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液制成适当的油注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以便制备高浓度溶液的物质。另一方面，活性成分可以呈在使用前用合适的载体例如不含热原的无菌水配制的粉末形式。
化合物也可以配制成直肠用组合物例如栓剂或保留灌肠剂，它们含有例如常规栓剂基质如椰子油、聚乙二醇或其它的甘油酯，所有这些物质都是在体温熔化而在室温凝固。
除了上述制剂以外，化合物也可以配制成贮药库制剂。这样的长效制剂可以经由植入(例如皮下或肌内植入)或肌内注射来给药。因此，例如，可用合适的聚合或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制化合物，或者将化合物制成难溶性衍生物，例如，制成难溶性盐。另一方面，也可以采用用于疏水性药物化合物的其它递送系统。脂质体和乳液是众所周知的递送疏水性药物的介质或载体。
另外，可以使用对异常肿瘤血管系统上的标识物的靶向递送。当与毒性药物或放射同位素偶联时，靶向部分将使药物集中于需要它的位置上。也可以采用用于肿瘤相关血管标识物的配体。例如，可以使用与肿瘤血管表面标识物结合的细胞粘附分子。也可以使用脂质体和其它药物递送系统，尤其是，如果它们的表面含有将载体优先指向肿瘤血管系统的配体时更是如此。脂质体提供的附加优点是将药物掩盖起来，使其不作用于大部分正常组织，由此降低了许多化合物的固有毒性。当用聚乙二醇(PEG)(即秘密脂质体)(为了将吞噬细胞的摄取减至最小)和肿瘤血管特异性靶向部分包衣时，与非靶向药物相比，脂质体提供了更长的血浆半衰期、更低的非靶向组织毒性和提高的效力。其它靶向手段包括但不限于ADEPT(抗体定向的酶前药治疗)、GDEPT (基因定向的EPT)和VDEPT(病毒定向的EPT)。在ADEPT中，没有活性的前药对于肿瘤实体的靶向是通过抗肿瘤相关标识物的抗体来实现的。肿瘤中或周围的酶环境将前药转化成有活性的毒性剂，然后作用于肿瘤组织。类似地，可使用在肿瘤位点上的差别的基因表达或病毒靶向来分别将GDEPT和VDEPT中的前药活化成其有活性的毒性形式。其它手段包括靶向差别表达的基因、酶或在肿瘤相关血管系统上的表面标识物，以控制肿瘤生长。使用上述方法，式I化合物或其优选实施方案的橄榄苦苷或其水解产物可被靶向递送到用以控制肿瘤发展的肿瘤血管系统或其它感兴趣位点(例如内皮细胞)上。
也可以使用一些有机溶剂例如二甲亚砜。另外，可以用持续释放系统，例如含有治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质来递送化合物。各种类型的持续释放材料已经确立，并且是本领域的技术人员众所周知的。根据它们的化学性质，持续释放胶囊可以释放药物长达几周至100天以上。
药物组合物还可以包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
适用于本发明的药物组合物包括其中活性成分以治疗有效量存在的组合物。组合物的给药量当然要取决于所治疗的个体、个体的体重、疾病的严重程度、给药方式和主治医生所做的判断。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是在借助于本文所提供的详细描述时。
目前预计在实施本发明所使用的本发明化合物的治疗有效量可含有大约0.030g-20.000g化合物/千克个体体重。
F.实施例通过具体的实施例来更详细地描述本发明。提供下面实施例是为了举例说明，而决不是以任何方式限制本发明。本领域技术人员会会很容易认识到，可以改变或变更各种非关键性参数来产生实质上相同的结果。
实施例1本实施例在小鸡绒膜尿囊中测定(CAM)中证实了橄榄苦苷的抗血管生成特性。CAM测定的最后目标是定量测定绒膜尿囊膜中血管的支点数目和末梢数目。这样定量测定将说明绒膜尿囊膜发育中血管的复杂性。作为使用橄榄苦苷的结果，绒膜尿囊膜的血管复杂性减轻了，这表明了它的抗血管生成特性。
A.方法因为新血管生长正在进行，所以发育中的小鸡胚胎的CAM是研究抗血管生成的优良体内系统。CAM测定涉及监测活的小鸡胚胎发育中绒膜尿囊膜的血管系统。已经开发出了各种CAM测定方法。这些方法包括在特定无菌条件下将活的小鸡胚胎放在陪替氏培养皿中培养。另一个方法是在受精卵的壳上切开一个窗口，用滤纸将欲研究的化合物直接施加到窗口中。我们使用CAM测定的改进方法，其包括引入化合物橄榄苦苷的侵袭性较轻的方法。在发育的第三天对着光检查受精卵。对血管系统和卵黄进行鉴定。在壳上做一个1mm的小孔。将携带0.4ml在生理盐水/水中稀释的橄榄苦苷的小规格针头直接插进卵黄囊内。用胶带把孔封上，并把卵放回培养箱中进一步培育。三天后取出卵，在白色皿中将其弄破，给绒膜尿囊膜拍照。给对照卵注射生理盐水/水。
B.材料受精卵由Country Farm Eggs，Los Angeles，CA.提供。PBS从Sigma-Aldrich Chemical Co.，St.Louis，Mo.获得。橄榄苦苷从Indofinechemical company，Inc.，Somerville，NJ.获得。针头和柳叶刀从ExpressPharmacy Services，Pittsburgh，Pa.获得。解剖学显微镜购自Microscope World，Encinitas，CA.。台式TX7培养箱从Lyons ElectricCompany Inc.Chula Vista，CA.获得。柯达MDS100照相机购自theEastman Kodak company，New Haven，CT.。
C.用于测定血管生成抑制的CAM培养将新鲜的受精卵在标准卵培养箱中孵育三天。使温度和湿度分别恒定保持在100°F和65％。在第三天，用警用闪光灯将卵对着光检查。鉴定胚胎和卵黄。用酒精拭子清洁卵壳。用柳叶刀钻刺卵壳，制作一个1mm的孔。用针头抽出0.5ml卵黄。将0.5ml注射剂直接施用给卵黄囊。以前试验表明，如果在我们的试验和对照注射剂中具有相同稠度，注射的墨水在注射后数秒内就会扩散卵黄囊中。给试验卵注射0.1％和1.0％浓度的橄榄苦苷。给对照卵注射等量的水。注射后，将孔用胶带封盖，并放回培养箱进一步孵育。在第三天时将卵取出并对着光检查。把卵在白色皿上用黄油刀轻轻弄破。把胚胎和CAM小心地摊开以便观察和拍照。使用具有连接在立体显微镜上的柯达mds-100照相机的实况电视记录胚胎的心脏跳动。记录胚胎的形态，并用柯达mds 100照相机给胚胎拍照。同样地，将CAM中的血管系统用固定在立体显微镜上的柯达mds 100照相机拍照。
E.结果表1显示了橄榄苦苷对于小鸡胚胎CAM的抗血管生成效果。该结果用总共17个卵、以102个用于分析的拍照区域对两个不同试验进行了概括。橄榄苦苷表现出统计学显著的对CAM血管生成的抑制作用。与对照相比，0.93μmol/卵的橄榄苦苷注射液产生了73％的血管生长抑制。与对照相比，9.3umol/卵的橄榄苦苷注射液产生了84％的血管生长抑制。这两个试验的结果表明，橄榄苦苷是有效的血管生成抑制剂。应当理解，上面所用的浓度是举例说明，而非限制性的。
表1在小鸡胚胎测定中橄榄苦苷对血管生成的抑制效果数目剂量 结节+末梢化合物 (μmole/卵) (平均±S.E.)抑制％橄榄苦苷 9.3 44±5a840.9372±11b73对照 —271±25 —
a与对照相比显著降低，P＜0.0001b与对照相比显著降低，P＜0.0001试验结束时所拍摄的CAM的代表照片清楚地表明了橄榄苦苷抑制血管生成的实例。附图1显示了用9.3μmol/卵的橄榄苦苷处理的卵CAM的代表照片。与附图3所示的对照相比，在这些CAM中，血管的数目明显减少，并且分支的复杂程度降低。不但毛细血管床没有了，而且中等大小甚至大的血管也已经分解或正处于分解过程中。与对照CAM(附图3)的大范围血管网络相比，甚至0.93μmol/卵的橄榄苦苷也能有效的抑制CAM血管系统(附图2)。在毛细血管床更紧密地观察到，接近CAM的边缘处发生了大部分气体交换，这表明与对照卵(附图4)相比，在用橄榄苦苷治疗的卵中大范围的毛细血管网络消失了。
在CAM测定中，也观察到作为橄榄苦苷处理结果的CAM和胚胎的收缩(附图5)。传统上CAM测定被用来鉴定各种化合物的抗血管生成特性。这些化合物通常施用于在卵壳表面所开的小窗口上，并且在整体上对CAM或胚胎不造成影响。在本实施例中，我们使用了改进的CAM测定来鉴定橄榄苦苷对整体CAM以及随之对胚胎大小产生的影响。在动物发育过程中，胚胎经历迅速的细胞分裂以及细胞分化和形态形成。在发育的小鸡胚胎中的迅速细胞分裂和生长与肿瘤细胞的迅速细胞分裂和生长之间可以得出相似性。两个实例中的生长都依赖于血液供应。小鸡胚胎需要高度血管化的CAM来维持细胞分裂和生长。以非常相同的方式，肿瘤也需要高度血管化来维持细胞分裂和生长。限制血液供应会使胚胎收缩并且可以推论对肿瘤也是如此。在此改进的CAM测定中，橄榄苦苷显著减少血管生长，并观察到随之而来的胚胎收缩(附图5)。附图5中所示的说明性实例表明，在CAM大小与胚胎大小之间具有直接的相关性。在直径上，橄榄苦苷处理的CAM的直径比对照CAM小约50％。橄榄苦苷处理的胚胎在大小上比未处理的对照胚胎小约60％。较高剂量的橄榄苦苷虽然显著影响CAM的大小和胚胎的大小，但却不影响胚胎的发育能力。
实施例2本实施例在小鸡绒膜尿囊中测定(CAM)中证实了橄榄叶提取物的抗血管生成特性。CAM测定的最后目标是直接显现出绒膜尿囊膜中血管的结点数目和末梢数目。这样的直接显现将说明绒膜尿囊膜发育中血管的复杂性。作为使用橄榄叶提取物的结果，绒膜尿囊膜的血管复杂性减轻了，这表明了它的抗血管生成特性。
A.方法如实施例1所述，使用CAM试验来鉴定橄榄叶提取物的抗血管生成特性。
B.材料受精卵由Country Farm Eggs，Los Angeles，CA.提供。PBS从Sigma-Aldrich Chemical Co.，St.Louis，Mo.获得。橄榄叶提取物得自橄榄叶。针头和柳叶刀从Express Pharmacy Services，Pittsburgh，Pa.获得。解剖学显微镜购自Microscope World，Encinitas，CA.。台式TX7培养箱从Lyons Electric Company Inc.Chula Vista，CA.获得。柯达MDS100照相机购自the Eastman Kodak company，New Haven，CT.。
C.用于测定血管生成抑制的CAM培养将新鲜的受精卵在标准卵培养箱中孵育三天。使温度和湿度分别恒定保持在100°F和65％。在第三天，用警用闪光灯将卵对着光检查。鉴定胚胎和卵黄。用酒精拭子清洁卵壳。用柳叶刀钻刺卵壳，制作一个1mm的孔。用针头抽出0.5ml卵黄。将0.5ml注射剂直接施用给卵黄囊。以前试验表明，如果在我们的试验和对照注射剂中具有相同稠度，注射的墨水在注射后数秒内就会扩散卵黄囊中。给试验卵注射含有橄榄叶提取物的水。给对照卵注射等量的水。在试验中使用提取物之前，把10ml沸水加到半茶匙粉碎的橄榄叶中，并进行2小时的提取。注射后，将孔用一小块胶带封盖，并放回培养箱进一步孵育。在注射后的第四天，将卵从培养箱中取出，在白色皿上用黄油刀轻轻弄破。把胚胎和CAM小心地摊开以便观察和拍照。使用具有连接在立体显微镜上的柯达mds-100照相机的实况电视记录胚胎的心脏跳动。记录胚胎的形态，用标准照相机给胚胎拍照。将CAM中的血管系统用固定在立体显微镜上的柯达mds 100照相机拍照。
C.结果从三个试验得到的结果表明，橄榄叶提取物是有效的抗血管生成抑制剂。应当理解，上面所用的浓度是举例说明，而非限制性的。试验结束时所拍摄的代表照片清楚地表明了橄榄叶提取物抑制血管生成的实例。附图1显示了对照卵(附图6a、b和c)和用橄榄叶提取物处理的卵(附图6d、e和f)的CAM代表照片。与对照相比，在处理的CAM中，血管数目显著减少，并且分支的复杂程度降低了。
应当理解，以上描述是举例说明，而非限制性的。对于本领域技术人员来说，通过阅读以上描述，很多实施方案将会是显而易见的。因此，本发明的范围不应当以上面的描述为根据，而应当以权利要求书以及权利要求书所要求的全部等同范围为依据确定。所有公开的文章和参考文献，包括专利申请和专利公开物在内，本文都全文引入以供参考。
实施例3本实施例证实了橄榄苦苷在成年小鼠耳朵模型中的抗血管生成特性。成年小鼠耳朵模型试验的最后目标是直接显现出血管的结点数目和末梢数目。这样的直接显现将说明成年小鼠耳朵中血管系统的复杂性。作为施用橄榄苦苷的结果，成年小鼠耳朵的诱发的血管系统的复杂性减小了，这表明了橄榄苦苷的抗血管生成特性。
A.方法在前一个模型(小鸡胚胎发育中的CAM)中，虽然是研究抗血管生成的优良体内系统，但是由于在胚胎生长过程中新血管也在生长，所以我们试验另外的模型来确定橄榄苦苷是否能够在哺乳动物中抑制诱发的血管生长。我们选择使用的模型是成年小鼠耳朵。小鼠耳朵是血管化的，并且很薄，可以直接用光学显微镜观测。如果给成年小鼠耳朵施加刺激物，已有血管就能够萌发出新的血管(血管生成)。用这样的模型就可以测定抗血管生成化合物的效果。我们用氢氧化钠烧灼来刺激成年小鼠耳朵中的已有血管，以使其萌发出新的血管。在施用氢氧化钠烧灼之前，给试验小鼠腹膜内注射含有橄榄苦苷的磷酸盐缓冲盐水。给对照小鼠注射单独的磷酸盐缓冲生理盐水。用氢氧化钠烧灼两组小鼠的耳朵。对第三组小鼠不注射也不烧灼。该第三组小鼠显示成年小鼠耳朵中未诱发的血管状态。成年小鼠耳朵试验包括在用氢氧化钠烧灼三天后，监测成年小鼠耳朵的血管系统。
B.材料小鼠由发明人在清洁而健康的环境中饲养。PBS从Sigma-AldrichChemical Co.；St.Louis，Mo.获得。橄榄苦苷从Indofine chemicalcompany，Inc.，Somerville，NJ.获得。氢氧化钠从Sammy′s Camera inLos Angeles.获得。针头和Nair从Thrifty′s drugs in Los Angeles CA.获得。解剖学显微镜购自Microscope World，Encinitas，CA.。柯达MDS-100照相机购自Eastman Kodak Company，New Haven，CT.。
C.为测定血管生成而培育成年小鼠耳朵模型小鼠是在完全成长2-3个月时使用。给试验小鼠腹膜内注射0.25ml含有0.025g橄榄苦苷的磷酸盐缓冲盐水。给对照小鼠注射单独的0.25ml磷酸盐缓冲盐水。在氢氧化钠烧灼前，给试验和对照组小鼠腹膜内注射三天，每天一次。在第四天时，将用2％氢氧化钠溶液蘸湿的棉花q-tip施于两组小鼠的耳朵上，施加时间总计一分钟。随后将小鼠耳朵用大量水清洗。把小鼠放回笼子，喂养三天，在此期间每天对其进行一次腹膜内注射。在第四天，用颈脱位法将小鼠人工杀死。用Nair处理小鼠耳朵以除去多余的毛，并用连接在立体显微镜上的数字式MDS-100照相机给血管系统拍照。
E.结果在上面的试验中，总共使用了五只对照(烧灼的)小鼠、五只试验(烧灼和橄榄苦苷治疗的)小鼠和五只对照(未烧灼且未治疗的)小鼠的三十只耳朵。从上面试验获得的结果表明，橄榄苦苷是有效的血管生成抑制剂。在试验结束时所拍摄的代表照片清楚地表明了血管抑制实例。附图7显示了全部三组小鼠之间的对比。未被灼烧或以任何方式治疗的小鼠的耳朵清楚地显示了一定的血管生成(附图7a)。在对照组中已用氢氧化钠灼烧的小鼠耳朵显示了血管生成量的增加，这表明我们在诱发血管生长方面是成功的(附图7b)。在附图7c中可以看到诱发的血管生长的显著实例，其中可以看到新的血管从已有的血管处萌发并向灼烧区域蔓延。附图7d显示了橄榄苦苷的有效抗血管生成效果。在该附图中，小鼠耳朵是用氢氧化钠灼烧，并且小鼠同时也接受日剂量的橄榄苦苷。可以看到，橄榄苦苷有效地抑制了已有血管的萌发。事实上，灼烧区域没有血管。这个结果是与每天注射橄榄苦苷的所有小鼠相一致的。
应当理解，以上描述和所使用的橄榄苦苷的量是举例说明，而非限制性的。对于本领域技术人员来说，通过阅读以上描述，很多实施方案将会是显而易见的。因此，本发明的范围不应当以上面的描述为根据，而应当以权利要求书以及权利要求书所要求的全部等同范围为依据确定。所有公开的文章和参考文献，包括专利申请和专利公开物在内，本文都全文引入以供参考。
实施例4本实施例证实了橄榄叶提取物在成年小鼠耳朵模型中的抗血管生成特性。成年小鼠耳朵模型试验的最后目标是直接显现出血管的结点数目和末梢数目。这样的直接显现将说明成年小鼠耳朵中血管系统的复杂性。作为施用橄榄叶提取物的结果，成年小鼠耳朵的诱发的血管系统的复杂性减小了，这表明了橄榄叶提取物的抗血管生成特性。
A.方法如实施例3所述，用成年小鼠耳朵模型来测定橄榄叶提取物的抗血管生成特性。
B.材料小鼠由发明人在清洁而健康的环境中饲养。PBS从Sigma-AldrichChemical Co.；St.Louis，Mo.获得。橄榄叶提取物从橄榄叶获得。氢氧化钠从Sammy′s Camera in Los Angeles.获得。针头和Nair从Thrifty′sdrugs in Los Angeles CA.获得。解剖学显微镜购自Microscope World，Encinitas，CA.。柯达MDS-100照相机购自Eastman Kodak Company，New Haven，CT.。
C.为测定血管生成而培育成年小鼠耳朵模型小鼠是在完全成长2-3个月时使用。给试验小鼠腹膜内注射0.25ml含有橄榄叶提取物的磷酸盐缓冲盐水。橄榄叶提取物是这样制得的将干燥的橄榄叶在咖啡研磨器中研磨直至叶子成粉末状。将10ml压实的橄榄叶粉末与45ml热水混合在一起。将磷酸盐缓冲盐水加到该混合物中。在氢氧化钠烧灼前，给试验和对照组小鼠腹膜内注射三天，每天一次。每只小鼠接受0.25ml注射液。试验组接受含有橄榄叶提取物的磷酸盐缓冲盐水。对照组接受单独的磷酸盐缓冲盐水。在第四天时，将用2％氢氧化钠溶液蘸湿的棉花q-tip施于两组小鼠的耳朵上，施加时间总计一分钟。随后将小鼠耳朵用大量水清洗。把小鼠放回笼子，喂养三天，在此期间每天对其进行一次腹膜内注射。在第四天，用颈脱位法将小鼠人工杀死。用Nair处理小鼠耳朵以除去多余的毛，并用连接在立体显微镜上的数字式MDS-100照相机给血管系统拍照。
E.结果在上述试验中使用了总共七只对照小鼠和七只试验小鼠共28只耳朵。从上面试验获得的结果表明，橄榄叶提取物是有效的血管生成抑制剂。在试验结束时所拍摄的代表照片清楚地表明了橄榄叶提取物的血管抑制实例。附图8显示了得自对照小鼠(附图8a、b、c和d)和用橄榄叶提取物治疗的小鼠(附图8e、f、g和h)的八只独立耳朵的代表照片。对照小鼠的耳朵是高度血管化的，这表明诱发了新的血管生长。用橄榄叶提取物治疗的小鼠具有减少的血管生成，这表明了橄榄叶提取物抑制新血管生长的有效作用。
应当理解，上面所用橄榄叶提取物的量是举例说明，而非限制性的。应当理解，以上描述是举例说明，而非限制性的。对于本领域技术人员来说，通过阅读以上描述，很多实施方案将会是显而易见的。因此，本发明的范围不应当以上面的描述为根据，而应当以权利要求书以及权利要求书所要求的全部等同范围为依据确定。所有公开的文章和参考文献，包括专利申请和专利公开物在内，本文都全文引入以供参考。
本发明的另外改变和改进对于那些本领域的技术人员来说也是显而易见的。因此，本文所描述和举例说明的部分的特定组合只是为了代表本发明的一些实施方案，而并非为了限制在本发明实质和范围内的其它实施。
权利要求
1.治疗个体中涉及血管生成的病症的方法，所述方法包括给需要这种治疗的个体施加治疗有效量的具有抗血管生成活性的药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的作为活性组分的下式化合物 其中R1和R2是羟基官能团；R3是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和COOCH3；X1-X3是选自氧、硫、-CH2-或羧基的官能团；R4是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷氧基、葡萄糖、B-D-吡喃葡萄糖、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、卤素、NO2、NH3、碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂质；且R5是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和CH3。
2.权利要求1的方法，其中所述药物组合物包含可药用载体或稀释剂。
3.抑制内皮细胞血管生成的方法，所述方法包括将所述细胞与足以抑制其血管生成的量的药物组合物接触，所述药物组合物含有有效量的下式化合物 其中R1和R2是羟基官能团；R3是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和COOCH3；X1-X3是选自氧、硫、-CH2-或羧基的官能团；R4是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷氧基、葡萄糖、B-D-吡喃葡萄糖、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、卤素、NO2、NH3、碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂质；且R5是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和CH3。
4.权利要求3的方法，其中所述药物组合物包含可药用载体或稀释剂。
5.权利要求3的方法，其中所述内皮细胞血管生成的抑制是在体内进行的。
6.权利要求3的方法，其中所述内皮细胞血管生成的抑制是在体外进行的。
7.治疗个体中涉及血管生成的病症的方法，所述方法包括给需要这种治疗的个体施加治疗有效量的具有抗血管生成活性的药物组合物，所述药物组合物含有作为活性组分的至少一种通过水解下式化合物而制得的组分 其中R1和R2是羟基官能团；R3是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和COOCH3；X1-X3是选自氧、硫、-CH2-或羧基的官能团；R4是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷氧基、葡萄糖、B-D-吡喃葡萄糖、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、卤素、NO2、NH3、碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂质；且R5是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和CH3。
8. 抑制内皮细胞血管生成的方法，所述方法包括将所述细胞与足以抑制其血管生成的量的药物组合物接触，所述药物组合物含有有效量的化合物，所述化合物选自至少一种通过水解下式化合物而制得的组分 其中R1和R2是羟基官能团；R3是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和COOCH3；X1-X3是选自氧、硫、-CH2-或羧基的官能团；R4是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷氧基、葡萄糖、B-D-吡喃葡萄糖、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、卤素、NO2、NH3、碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂质；且R5是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和CH3。
9.权利要求1的方法，其中所述组合物包含下式所示化合物
10.权利要求3的方法，其中所述组合物包含下式所示化合物
11.在需要这种治疗的哺乳动物中治疗癌症的方法，所述方法包括给所述患者施加治疗有效量的具有下式的化合物或其可药用盐、前药或水合物 其中R1和R2是羟基官能团；R3是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3和COOCH3；X1-X3是选自氧、硫、-CH2-或羧基的官能团；R4是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷氧基、葡萄糖、B-D-吡喃葡萄糖、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、卤素、NO2、NH3、碳水化合物、氨基酸、核苷酸或脂质；且R5是选自下列的官能团氢、C1-C6-烷基、C2-C6-链烯基、C2-C6-炔基、芳基、羟基、C1-C6-烷氧基、卤素、NO2、NH3或CH3。
12.权利要求11的治疗癌症的方法，其中所述癌症选自肺癌、喉癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌和膀胱癌。
13.权利要求11的方法，其中所述癌症选自淋巴瘤、白血病、成胶质细胞瘤、肉瘤和成视网膜细胞瘤。
14.权利要求1的方法，其中所述病症是眼病。
15.权利要求14的方法，其中所述眼病包括与角膜新血管形成有关的选自下列的疾病糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、角膜移植排斥、新血管性青光眼和晶状体后纤维增生、流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、隐形眼镜过度磨损、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干性角膜炎、斯耶格伦病、酒渣鼻、phylectenulosis、梅毒、分支杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、莫伦溃疡、Terrien′s边缘变性、边缘性角质层分离、创伤、全身性狼疮、多动脉炎、韦格纳肉样瘤病、巩膜炎、史蒂文斯-约翰逊疾病、periphigoid radial角膜切开术和角膜移植排斥。
16.权利要求14的方法，其中所述眼病是与视网膜/脉络膜新血管形成有关的选自下列的疾病糖尿病性视网膜病、黄斑变性、镰状细胞贫血、肉样瘤、梅毒、弹力纤维性假黄瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性眼色素层炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、全身红斑狼疮、早熟视网膜病、伊尔斯病、Bechets病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假定的眼组织胞浆菌病、Bests病、近视、视力凹陷(optic pits)、施塔加特病、pars planitis、慢性视网膜脱离、高粘滞性综合症、弓形体病、创伤和激光后并发症。
17.权利要求14的方法，其中所述眼病选自发红性和增殖性前房性视网膜病。
18.权利要求1的方法，其中所述病症包括与慢性炎症有关的选自下列的疾病炎性肠病、牛皮癣、肉样瘤病和类风湿性关节炎。
19.权利要求18的方法，其中所述炎性肠病选自局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。
20.权利要求1的方法，其中所述化合物经由选自口服、颊、直肠、非胃肠道、腹膜内、皮内、经皮和鞘内的途径给药。
21.权利要求1的方法，其中是将所述组合物配制成用于口服给药的片剂或酏剂。
22.权利要求1的方法，其中所述组合物是经由选自肌内或静脉内给药的途径给药。
23.权利要求1的方法，其中所述组合物是经由吸入给药。
24.权利要求11的方法，其中所述组合物是经由选自口服、颊、直肠、非胃肠道、腹膜内、皮内、经皮和鞘内的途径给药。
25.权利要求11的方法，其中是将所述组合物配制成用于口服给药的片剂或酏剂。
26.权利要求11的方法，其中所述组合物是经由选自肌内或静脉内给药的途径给药。
27.权利要求11的方法，其中所述组合物是经由吸入给药。
28.权利要求11的治疗癌症的方法，其中所述组合物包含下式所示化合物
29.权利要求7的方法，其中所述至少一种组分选自橄榄苦苷苷元、洋橄榄酸(elenolic acid)、β-3，4-二羟基苯基乙基醇和甲基-o-甲基洋橄榄酸酯(elenolate)。
30.权利要求8的方法，其中所述至少一种组分选自橄榄苦苷苷元、洋橄榄酸(elenolic acid)、β-3，4-二羟基苯基乙基醇和甲基-o-甲基洋橄榄酸酯(elenolate)。
全文摘要
本申请公开了用于抑制血管生成的方法，所述方法包括以治疗的有效量给药橄榄苦苷和/或其水解产物。本发明方法和组合物可特别有效地抑制内皮细胞的血管形成，因此可以用于治疗各种各样的癌症、眼病和炎症。
文档编号A61K31/23GK1531435SQ02812125
公开日2004年9月22日 申请日期2002年5月22日 优先权日2001年5月23日
发明者哈姆迪·K·哈姆迪, 杰弗里·H·塔维斯, 拉克尔·卡斯特利翁, H 塔维斯, 卡斯特利翁, 哈姆迪 K 哈姆迪 申请人:哈姆迪·K·哈姆迪, 杰弗里·H·塔维斯, 拉克尔·卡斯特利翁, 哈姆迪 K 哈姆迪