IgG抗体稳定的液态药物制剂的制作方法

专利名称：IgG抗体稳定的液态药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及抗体药物制剂领域.。具体说，本发明涉及一种稳定的高浓度液态抗体制剂。本发明稳定的液态制剂示范例是Daclizumab，一种抗IL-2受体抗体；HAIL-12，一种抗IL-12人源化单克隆抗体；和HuEP5C7，一种抗L-选择蛋白的人源化单克隆抗体的稳定性液态制剂。
背景技术：
许多人用蛋白制品在应用之前需要稳定剂来防止蛋白质变性、凝聚和其它变化。不稳定性表现为形成可溶/不可溶性颗粒，在蛋白制品贮藏和运输期间这种不稳定性常会增加。开发蛋白质药物制剂的主要目标是维持蛋白质的可溶性、稳定性和生物活性。
具体说，免疫球蛋白被视为具有在溶液中倾向于形成凝聚物和颗粒的特性，因此许多免疫球蛋白在用于静脉内或皮下注射之前需要过滤。蛋白质形成凝聚物和颗粒一直是开发非胃肠道给药免疫球蛋白产品的一个难题，特别当以高浓度配制免疫球蛋白时。SynagisTM(MedImmune)是一种用重组DNA技术生产的人源化IgGl单克隆抗体，针对呼吸道合胞病毒(RSV)T蛋白的A抗原部位中的某表位。SynagisTM由人(90％)和鼠(10％)抗体序列组成。SynagisTM以无菌冻干产品提供，注射时需用无菌水重建。重建的SynagisTM只能肌肉内注射给药。重建时SynagisTM含有以下赋形剂每安瓿47mM组氨酸、3.0mM甘氨酸、5.6％甘露糖醇和浓度100mg/小瓶的活性成分IgGl抗体。重建的SynagisTM必须在重建6小时内给予。
WO89/11297公开了一种冻干单克隆抗体制剂，含有冻干的l-25mg/ml IgG单克隆抗体、2-10％麦芽糖以及乙酸钠、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液，pH3.0-6.0。
WO97/45140公开了一种抗CD-4抗体水溶液制品，以100mM柠檬酸钠、0.05mMEDTA，pH6.0配成浓度约100mg/ml。申请者说抗体浓缩后，浑浊度轻度升高可能反映蛋白质凝聚。去除这种凝聚物需要加入聚山梨酯(Polysorbate)80和除菌过滤。
WO90/11091公开了一种可注射的组合物水溶液，其含有约5mg/ml IgM、2.5-5％(w/v)人血清白蛋白，溶于8-20mM磷酸缓冲液、270mM氯化钠、pH6.8-7.4。
美国专利6,171,586公开了一种稳定的药物水溶液制剂，其含有治疗有效量的不预先冻干的抗体、pH约4.8-5.5的醋酸缓冲液、表面活性剂和多元醇，其中该制剂不会等渗所需数量的氯化钠。
美国专利申请出版物US2001/0014326A1公开了一种冻干的抗体制剂，其含有25mg/ml抗IgE抗体、5mM组氨酸、pH6.0、85mM蔗糖、0.01％聚山梨酯20。
美国专利5,744,132公开了一种组合物，含有1-1000μg/ml IL-12抗体、2％蔗糖、4.15％甘露糖醇、10mM琥珀酸钠、和约0.02％Tween20，pH5.6。
美国专利6,267,958公开了一种重建的制剂，在20mM组氨酸、pH6.0、340mM蔗糖、0.04％聚山梨酯20和0.9％苄醇中含有100mg/ml rhuMab E25。
美国专利6,165,467公开了一种稳定由杂交瘤细胞系(登录号HB8307)产生的人单克隆抗体组合物的方法，该方法包括以pH7.2-7.4的磷酸盐稳定的缓冲液透析人单克隆抗体；所述缓冲液含1-20mg D-甘露糖醇/mg单抗、0.005-0.2mM甘氨酸/mg单抗、和能稳定所述溶液pH的量的使pH稳定化的磷酸盐。
因此需要一种给予人的稳定的液态抗体制品，其中抗体的浓度为50mg/ml或更高，这种制品适合于非胃肠道给药，包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射。
发明概述本发明涉及一种含有高浓度，例如50mg/ml以上浓度的抗体的稳定的液态药物制剂，该抗体溶于20-60mM琥珀酸缓冲液，或30-70mM组氨酸缓冲液(pH约5.5-6.5)、渗透修饰剂和约0.01-0.1％聚山梨酯中。此配方保留了抗体的理化和生物学稳定性，并能在免疫球蛋白给予病人之前防止其最终产品中形成凝聚物和颗粒。本发明优选的抗体包括Daclizumab，一种人源化抗IL-2受体单克隆抗体；HAIL-12，一种抗IL-12人源化单克隆抗体；和HuEP5C7，一种抗L-选择蛋白的人源化单克隆抗体和Flintozumab，一种抗γ干扰素的人源化单克隆抗体。
这种液体抗体制剂在冷藏温度(2-8℃)下至少能稳定1年，优选2年。此液体制剂在室温(23-27℃)下也能稳定至少6个月。此液体制剂适合于皮下注射。
附图简要说明

图1A显示形成的水解物(clips)的百分率。图1B显示用SEC-HPLC评估样品于不同pH水平在45℃保温4周后凝聚物的百分率.。
图2显示样品于不同pH水平在45℃保温4周后，用cIEF评估得出的降解百分率。
图3样品于不同pH水平在45℃保温4周后，用Promega IsoQuant试剂盒评估形成的异天门冬氨酸(iso-asparticaeid)的百分率.。
图4显示不同缓冲液对制剂37℃保温不同时间后效价的影响。
发明详述I.定义本文中术语“缓冲剂”包括那些能维持溶液pH在可接受范围的试剂，包括琥珀酸盐(钠)、组氨酸、磷酸(钾或钠)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺等。本发明的缓冲液pH范围在约5.5-6.5，优选pH为6.0。能将pH控制在此范围内的缓冲液例子包括琥珀酸盐(如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐和其它有机酸缓冲液。
“药学上可接受的赋形剂”(载体，添加剂)是那些适合给予患病哺乳动物并能提供有效剂量的活性成分的惰性物质。将这些物质加到制剂中能稳定抗体的理化和生物结构。该术语也指适合预定给药方式获得等渗制剂可能需要的添加剂。
术语“药物制剂”指其剂型能明确发挥活性成分的生物活性，且不含有对于给予制品的患者有毒性的其它成分的制品。
“稳定的”制剂是蛋白质于其中在贮藏期能基本上保持其物理稳定性、化学稳定性和生物活性的制剂。测定蛋白质稳定性的各种分析技术可参见Peptide andProtein Drug Delivery，247-310，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.1029-90(1993)。可测定在所选温度所选时间内的稳定性。
“稳定的”液态抗体制剂是一种在冷藏温度下(2-8℃)至少12个月，优选2年，更优选3年；或在室温下(23-27℃)至少3个月，优选6个月，更优选1年未观察到显著变化的液态抗体制剂。稳定性的标准如下。如SEC-HPLC检测显示，只有不到10％，优选不到5％的抗体单体降解。此溶液肉眼观察无色、或澄清至轻度乳白色。该制剂的浓度、pH和渗透压变化不到±10％。效价为对照的70-130％，优选80-120％。观察到的水解不到10％，优选5％。形成的凝聚物不到10％，优选5％。
如果肉眼检查抗体的颜色和/或澄清度，或经UV光散射测定、尺寸排阻层析(SEC-HPLC)和动态光散射(DLS)检测，抗体的凝聚、沉淀和/或变性无显著增加，则说药物制剂中的抗体“保持了其物理稳定性”。此外蛋白质的构象不改变。蛋白质构象的改变可采用能测定蛋白质三级结构的荧光分光光度法，以及能测定蛋白质二级结构的FTIR分光光度法来评价。
如果药物制剂中的抗体未显示显著的化学变化，则说此抗体“保持了其化学稳定性”。可通过检测和定量测定化学上发生改变的蛋白质形式评估其化学稳定性。常常能改变蛋白质化学结构的降解过程包括水解(可用尺寸排阻层析和SDS-PAGE等方法评价)、氧化(例如可通过肽图，联合质谱或MALD/TOF/MS等方法评价)、脱酰胺(可用离子交换层析、毛细管等电聚焦、肽图、异天冬氨酸测定等方法评价)和异构化(可通过测定异天冬氨酸含量、肽图等评价)。
如果在给定时间内，药物制剂中抗体的生物学活性仍在该药剂制备时显示的生物学活性范围内，则说此抗体“保持了其生物学活性”。抗体的生物学活性可通过例如抗原结合ELISA试验检测。
术语“等渗”指感兴趣的制剂具有基本上与人血相同的渗透压。等渗制剂具有的渗透压通常为约270-328mOsm。渗透压略低为250-269mOsm；渗透压略高为328-350mOsm。例如，可用蒸气压或冰冻型渗透压计测定渗透压。
“渗透修饰剂”是可加入制剂中以提供该制剂等渗性的那些药学上可接受的惰性物质。适用于本发明的渗透修饰剂包括盐和氨基酸。
II.分析方法以下标准对开发稳定的药物抗体制剂很重要。抗体制剂含有药学上可接受的赋形剂。抗体制剂配制时应保持其理化和生物学活性。抗体制剂在冷藏温度(2-8℃)下宜稳定至少一年，在室温(23-27℃)下宜稳定6个月。
评价产品稳定性的分析方法包括尺寸排阻层析(SEC-HPLC)、动态光散射(DLS)、差示扫描量热法(DSC)、异天冬氨酸定量法、效价、340nmUV和UV分光光度法。SEC(J.Pharm.Scien.，831645-50，1994Pharm.Res.，11485，1994；J.Pharm.Bio.Anal.，151928，1997；J.Pharm.Bio.Anal.，141133-40，1986)可测定抗体制品中的单体百分率，得到可溶性水解物数量和絮凝物的信息。DSC(Pharm.Res.，15200，1998；Pharm.Res.，9109，1982)可得到蛋白变性温度和玻璃化转变温度的信息。DLS(American Lab.，Nov.1991)可测定平均扩散系数，得到可溶性和不溶性凝聚物含量的信息。340nmUV可测定340nm散射光的强度，得到可溶性和不溶性凝聚物含量的信息。UV分光光度法可测定278nm吸光值得到蛋白质浓度的信息。
样品中异天冬氨酸含量的测定可采用Isoquant异天冬氨酸检测试剂盒(Promega)。该试剂盒采用酶蛋白异天冬酰基甲基转移酶(PIMT)来特异性检测靶蛋白中异天冬氨酸残基的存在。此过程中，PIMT能催化S-腺苷基-L-甲硫氨酸的甲基转移到异天冬氨酸的α-羧基位点，产生S-腺苷基-L-同型半胱氨酸(SAH)。其是一种较小的分子，可用该试剂盒中的SAH HPLC标准品以反相HPLC分离和定量测定。
抗体的效价或生物学活性可通过其结合于其抗原的能力来测定。抗体与其抗原的特异性结合可用本领域技术人员已知的方法，例如ELISA(酶联免疫吸附试验)等免疫测定法来定量检测。
III.抗体的制备本发明涉及含有抗体的稳定的液态制剂。该制剂中的抗体可用本领域现有的产生抗体的技术来制备，其示范性的方法在以下章节中有更详细说明。
所述抗体针对感兴趣的抗原。优选该抗原是生物学上的重要多肽，将该抗体给予哺乳动物可预防和治疗疾病。然而也可考虑抗非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原，见美国专利5,091,178)的抗体。
当抗原是一种多肽时，它可能是一种跨膜分子(如受体)或配体如生长因子。抗原的例子包括肾素；生长激素包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；副甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链、胰岛素B-链、胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如第8因子、第9因子、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(活化后可调节的正常T细胞表达并分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨衍生神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)；或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)如IL-1到IL-12；IL-1到IL-12的受体；选择蛋白如L，E和P-选择蛋白；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如AIDS包膜部分；转运蛋白；归巢受体；地址素(addressins)；调节蛋白；整合蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18和ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；以及任一上述多肽的片段。
当采用重组技术时，可在细胞内周质间隙内产生抗体，或直接分泌到培养液中。如果抗体产生在细胞内，第一步用离心或超滤去除宿主或裂解细胞产生的颗粒碎片。当抗体分泌到培养液中时，通常可采用市售的蛋白浓缩滤器如Amicon或MilliporePellicon超滤单元先浓缩该表达系统的上清液。可在上述步骤之一加入蛋白酶抑制剂如PMSF来抑制蛋白水解，可加入抗菌素来防止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可采用，例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化。亲和层析是优选的纯化技术。A蛋白用作亲和配体的适用性取决于抗体中存在的免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。A蛋白可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.621-13，1983)。所有小鼠同种型和人γ3推荐用G蛋白(Guss et al.，EMBO J.51567-75，1986)。亲和配体附着的基质最常用琼脂糖，但也可用其它基质。机械性能稳定的基质如可控孔径的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。当抗体含有CH3区时，可采用Bakerbond ABXTM树脂来纯化(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J)。根据要回收的抗体类型也可采用其它蛋白质纯化技术，如离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶层析、肝素SEpHAROSETTM层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
本发明的优选抗体包括Daclizumab(USAN，美国采用名)，一种人源化抗IL-2受体抗体。Daclizumab最近上市的商标名为Zenapax，用于肾移植后预防器官排斥，经静脉给药。Daclizumab也用于治疗牛皮癣，为此宜采用皮下给药途径。为了皮下输送抗体宜用高浓度抗体。Daclizumab是一种重组人源化单克隆抗体，属IgGl亚类，其分子由二条相同的重链和二条相同的轻链亚基组成。二硫桥键连接了4条链。Daclizumab单体分子量约150,000道尔顿。Daclizumab能结合活化T细胞上表达的IL-2受体的p55亚基。此靶抗原称为CD25。通过补料分批发酵培养，从含有重链和轻链基因的GS-NSO细胞系产生Daclizumab。生物反应器收获物经处理去除细胞和碎片，用离子交换和凝胶过滤层析结合一系列超滤和过滤技术纯化，产生含有95％以上单体抗体的药物。
另一优选抗体是抗白介素12(IL-12)抗体。IL-12是一种由抗原呈递细胞合成的细胞因子，它含有二个亚基(p35和p40)，二者必须同时存在才有功能活性。功能性IL-12也称为12p70。该细胞因子通过提高其增殖速率优先作用于1型T辅助(Th1)淋巴细胞和自然杀伤细胞。其一种下游作用是使Th1细胞分泌干扰素γ(IFNg)。这二种功能(增殖和产生IFNg)不难检测，并可用于检测样品的IL-12活性。已报道某些抗IL-12抗体可“中和”上述活性。因为Th1细胞在各种疾病中起着中枢作用，具有中和特性的抗体应具有潜在的治疗价值。16G2(Hoffman La Roche)是一种鼠产生的抗IL-12p70抗体。已证明在人外周血(PBMC)活化T细胞的功能试验中，16G2以接近化学计量的量作用于IL-12，抑制活化T细胞的增殖。这是一种重要的特性，因为血清中存在IL-12的p40二聚体，需过量使用抗p40亚基抗体，才能中和给定量的IL-12的增殖能力。Protein Design Labs Inc.(Fremont，CA)人源化的16G2是针对HAIL-12的(人源化抗IL-12，IgGl抗体)。
另一优选抗体是抗L-选择蛋白抗体。已发现选择蛋白如L、E和P-选择蛋白与局部缺血和再灌注时组织损伤有关。此种联系中中性白细胞起着重要作用。推测中性白细胞的募集需要选择蛋白。L-选择蛋白对于骨骼肌和肺中损伤的完全出现很重要(Seekamp et al.，Am.J.Pathol.11592-98，1994；Mulligan et al.，J.Immunol.151832-40，1994；)HuEP5C7(SMART抗L-选择蛋白)是一种人源化的抗L-选择蛋白单克隆抗体，含有突变的IgG2 Fc，可与人E-和P-选择蛋白抗原起交叉反应。它是Protein DesignLabs Inc.最近开发的，可用于多种疾病，如哮喘、中风、创伤和某些自身免疫病。
另一优选抗体是Flintozumab，一种抗γ-干扰素抗体。Flintozumab是Protein DesignLabs Inc.开发的一种人源化IgG1单克隆抗体，用于治疗由γ-干扰素(IFN-g，一种促炎症细胞因子)介导的免疫疾病。IFN-g可诱导主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类(HLA-DR)抗原的表达，提高自然杀伤细胞的溶细胞活性，活化巨噬细胞和调节体液应答的免疫球蛋白的同种型模式。作为淋巴因子，IFN-g也促进1型T辅助细胞(Th1)的发育，同时抑制2型T辅助细胞(Th2)的发育。Th1/Th2比率异常意味着各种自身免疫病。
IV.制剂的制备如上所述制备了所述抗体后，即可制备含该抗体的药物制剂。该制剂生产的方法如下选择最佳溶液pH，选择缓冲剂种类和浓度，评价各种赋形剂对液体稳定性的作用，用I-优化实验设计(Statistics for ExperimentersAn Introduction to Design，DataAnalysis，and Model Building，Box，George E.P.et al.，John Wiley and Sons，Inc.，1978)来优化所选赋形剂的浓度。
本发明的组合物最大程度地减少了抗体凝聚和颗粒的形成，确保抗体在用时保持其生物活性。该组合物是一种含有高浓度抗体的药学上可接受的液态制剂，并含有中性或微酸性pH(pH5.5-6.5)的缓冲液、表面活性剂和渗透修饰剂。
该组合物中的抗体浓度高达50mg/ml或以上，优选100mg/ml或以上。本发明的优选组合物含有Daclizumab，一种人源化的抗IL-12受体抗体；HAIL-12，一种人源化的抗IL-12抗体；HuEP5C7，一种抗L-选择蛋白抗体；和Flintozumab，一种人源化抗γ-干扰素抗体。
本发明组合物所用的缓冲液pH为5.5-6.5。优选pH6.0-6.5的缓冲液。能将pH控制在此范围的缓冲液的例子包括琥珀酸盐(如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐和其它有机酸缓冲液。琥珀酸(pKa 5.63)是皮下注射优选的缓冲液。组氨酸(pK5.97)次优选因为它易于氧化，虽然可通过用N2置换小瓶顶部空间或加入抗氧化剂阻止其氧化。柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液更不优选，因其皮下注射时引起疼痛反应。优选的缓冲液含有20-60mM的琥珀酸钠。另一优选的缓冲液是以过量N2复盖的30-70mM组氨酸缓冲液。
抗体制剂中也可加入表面活性剂。示范性表面活性剂包括非离子表面活性剂如聚山梨酯(如聚山梨酯20，80，如Tween20，Tween80)和poloxamers(如poloxamer188)。加入的表面活性剂量应能减少抗体制剂的凝聚，和/或最大程度减少该制剂中形成颗粒，和/或减少吸附。该制剂中存在的表面活性剂量为约0.005％-0.5％，优选约0.01％-0.1％，更优选约0.01％-0.05％，最优选约0.02％-0.04％。
可将能影响该制剂等渗性的渗透修饰剂加入此组合物中。本发明所用的渗透修饰剂包括盐和氨基酸。药学上可接受的可用于本发明的盐包括氯化钠、琥珀酸钠、硫酸钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁和氯化钙。本发明优选的盐是NaCl和MgCl2。MgCl2还可保护蛋白质避免脱酰胺而提高抗体的稳定性。NaCl的优选浓度为约75-150mM。MgCl2的优选浓度为约1-100mM。药学上可接受的可用于本发明的氨基酸包括脯氨酸、丙氨酸、L-精氨酸、天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸和组氨酸。本发明优选的氨基酸是脯氨酸。脯氨酸的优选浓度为约200mM。
该制剂中也可加入常用于稳定蛋白质制剂的EDTA。EDTA作为螯合剂可抑制金属催化的巯基氧化，从而减少二硫链凝聚物的形成。EDTA的优选浓度为0.01-O.2％。
示范性液态组合物是含有约100mg/ml或更高浓度的抗体、约20-60mM琥珀酸钠(pH6)、约0.01-0.1％聚山梨酯20或80、约75-150mM NaCl的制剂。此制剂保持了单克隆抗体生物活性的稳定，并可防止给予人的免疫球蛋白最终产品中发生理化和生物学降解。
本发明的液态抗体制剂适宜胃肠道外给药，如静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射，尤其适合皮下注射。
本发明将通过以下实施例进一步说明，这不构成将本发明限制于所述具体方法的范围内。
实施例实施例1 pH的优化为了确定最佳制剂的pH范围和确定主要的降解途径，进行了pH特点研究。用三种缓冲液pH4.0或5.0的50mM乙酸钠缓冲液；pH5.5，6.0或6.5的50mM组氨酸；pH7.0或8.5的50mM磷酸钠缓冲液，分别配制含5mg/ml抗IL2受体抗体(Daclizumab)的样品制剂。将各制剂于5℃或45℃以100RPM振荡保温4周。於0周和4周用以下分析方法评估各样品的理化稳定性pH和肉眼观察分析、340nmUV分光光度法、尺寸排阻层析(SEC-HPLC)、荧光分光光度法、动态光散射(DLS)、差示扫描量热法(DSC)、Promega IsoQuant试验、毛细管等电聚焦(cIEF)、SDS-PAGE(还原和非还原)和生物活性评估(ELISA)。
45℃保温4周后对样品进行SEC-HPLC，显示水解是该液态制剂的主要降解途径。图1A显示不同pH水平时用SEC所发现的水解物百分率。中间范围5.5-6.5pH值时，SEC测定的水解物百分率和凝聚物百分率(图1B)均降低。
图2显示45℃保温样品4周后进行cIEF评估不同pH水平时所得的降解百分率。PH值约5.5时降解最少。
图3显示45℃保温样品4周后用Promega IsoQuant试剂盒评估不同pH水平形成的异天冬氨酸的百分率。pH6.0或6.5时异天冬氨酸形成(脱酰胺)最少，pH8.0时急速增加。
此实验结果表明，pH5.5-6.5，优选pH6.0-6.5，是抗体降解和凝聚最少的优选pH。
实施例2 缓冲液的优选此项实验中含5.0mg/ml Daclizumab抗体的各制剂用pH6.0的50mM琥珀酸钠；和pH6.0的50mM组氨酸配制，充氮气或不充。不包括柠檬酸钠缓冲液因为报告说皮下注射疼痛。用包被了重组人IL2α受体(IL-2 sRα)抗原的微量培养板和羊抗人IgG-HRP偶联物进行ELISA，检测0时刻和37℃保温4、8和12周后的生物学活性(效价)。
图4显示37℃保温后不同缓冲液对不同时间效价的影响。用pH6.0 50mM琥珀酸钠缓冲液在8周期间内实现了该抗体制剂的最高稳定性。单用组氨酸的制剂由于缓冲液氧化而迅速(少于8周)失去其效价。用琥珀酸钠缓冲液或充N2气以预防氧化的组氨酸缓冲液配的该制剂的效价可保持在80％以上至少12周。
实施例3 筛选赋形剂目的进行此项研究以筛选用于50mg/ml的Daclizumab抗体制剂的各种赋形剂。从以上(实施例1)pH优化研究可知，该制剂在pH6.0-6.5时稳定性最好。因此此研究中，以二种缓冲液pH6.5的50mM磷酸盐和pH6.0的50mM琥珀酸盐来筛选赋形剂。在5℃或45℃，以100RPM振荡3周，监测二种缓冲液中50mg/ml浓度的抗体稳定性。受检的赋形剂包括表面活性剂(Tween80和Tween20)；盐(NaCl和MgCl2)；抗氧化剂(EDTA和甲硫氨酸)；氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸和脯氨酸)；和助溶剂(甘油和乙醇)。采用不同分析技术(澄清度、pH、SEC-HPLC、UV-Vis和cIEF)来分析含赋形剂的制剂。
样品制备Daclizumab抗体以67mM磷酸钠溶液(不加Tween80)配成6.6mg/ml浓度，将其在Pellicon II(Millipore)单元中浓缩至约30mg/ml，然后用50ml amicon搅拌装置(stir cell)(Millipore)将缓冲液换成二种所选缓冲液pH6.5的50mM磷酸钠和pH6.0的50mM琥珀酸钠。在第三步和最后一步缓冲液交换时，将该抗体浓缩至最终浓度约125mg/ml。最后，通过0.8μm膜(Uniflo)过滤此抗体，测定过滤后的蛋白质浓度磷酸盐缓冲液样品为约100mg/ml；琥珀酸钠缓冲液样品约为97mg/ml。
表1显示它们筛选出的赋形剂的目标浓度。通过秤取所需量的赋形剂直接加入小瓶(如所有的氨基酸)，或配制浓的赋形剂储备溶液制备制剂。将赋形剂加入到0.5ml合适的缓冲液中，用1N HCl或10％NaOH调节至所需的pH值，然后加入以适当缓冲液配的0.5ml浓缩抗体溶液以获得目标浓度50mg/ml.。采取此法以预防因直接接触浓赋形剂而致的蛋白降解。将1ml溶液分成两小瓶，各0.5ml。一瓶用作初始T＝0分析，然后于2-8℃保存于3周时间点作2-8℃分析。另一瓶45℃ 100RPM振荡保温3周，结束时进行分析。
表 1此项研究所用赋形剂及其浓度表#赋形剂 目标浓度1Tween80 0.05％2EDTA0.05％3NaCl150mM4甲硫氨酸100mM5甘氨酸 200mM6丝氨酸 200mM7脯氨酸 200mM8赖氨酸 200mM9MgCl2100mM10Tween 20 0.05％11甘油 5.0％12乙醇 5.0％分析方法用各种分析技术分析二个时间点时的样品。拿住样品小管对着黑色背景在荧光灯下肉眼观察溶液澄清度。检查溶液中的不溶性物质并记录颜色变化。用二极管阵列检测和二根串联的Tosohaas柱作Perkin Elmer HPLC进行尺寸排阻层析。样品用相应的缓冲液稀释约5倍至浓度约1mg/ml，取100μl样品注入此柱。以Perkin ElmerLambda Bio 40分光光度计用UV分光光度法检测样品浓度。
在BioRad CE(BioFocus 3000)系统上进行毛细管等电聚焦分析3周时间点的样品。用水将所有样品稀释至0.25mg/ml，用含有TEMED和二个内部pI标记8.4和10.1的药物(pharmalyte)溶解液作1∶1稀释(最终浓度为0.125mg/ml)。所用毛细管是含中性涂层的eCAP(Beckmann，56cm长，50μm ID)。
在5℃和45℃保温3周后测定用含赋形剂Tween-80、EDTA、NaCl和MgCl2的琥珀酸盐缓冲液所配样品的效价。此生物试验包括KIT-225-K6细胞。
结果在时间点T＝0时，监测24份样品，涉及二种不同缓冲剂中的12种赋形剂。在经3周时间后有48份样品要分析(12种不同赋形剂量×2种温度×2种缓冲液＝48)。试验包括用UV-Vis测浓度，测pH，澄清度，SEC-HPLC和ClEF。
(a)样品澄清度表2显示样品外观。二种缓冲液中的所有样品在起始时刻T＝0时均澄清。3周后，5℃时磷酸盐缓冲液中的所有样品除含赖氨酸的以外均澄清。45℃时同一缓冲液中含氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和赖氨酸)的样品外观澄清，但小瓶中有线状漂浮物。含MgCl2的样品有沉于瓶底的透明结晶。
琥珀酸盐缓冲液中，除含氨基酸的制剂外，所有样品5℃保温3周后均澄清。含脯氨酸和赖氨酸的样品最混浊。45℃时3周后琥珀酸盐缓冲液中的所有样品均澄清。
表 25℃和45℃在琥珀酸钠(pH6.0)和磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，T＝0和T＝4周时用荧光检测的样品澄清度样品 磷酸T＝0 磷酸T-3周 磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周澄清度 澄清度5℃ 澄清度45℃澄清度 澄清度5℃ 澄清度45℃Tween-80澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清EDTA澄清 清 澄清澄清 澄清 澄清NaCl澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清甲硫氨酸澄清 澄清澄清澄清 混浊 澄清甘氨酸 澄清 澄清澄清澄清 混浊 澄清丝氨酸 澄清 澄清澄清澄清 混浊 澄清脯氨酸 澄清 澄清澄清澄清 混浊 澄清赖氨酸 澄清 混浊澄清澄清 混浊 澄清MgCl2澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清Tween-20澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清甘油澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清乙醇澄清 澄清澄清澄清 澄清 澄清
(b)SEC-HPLC表3(A-C)显示SEC-HPLC的结果。表3A表明该项研究检测的所有样品中单体的百分比。T＝0时所有样品的单体的百分比均≥99％。三周时，二种缓冲液中5℃样品的单体百分比未见显著改变。然而在45℃所有样品的单体百分比显示轻度下降(＜5％)。用磷酸盐缓冲液配的样品单体百分比在94.08(甲硫氨酸)至97.29(脯氨酸)之间；而用琥珀酸盐缓冲液配的样品单体百分比在95.86(甲硫氨酸)至97.55(Tween-80)之间。二种缓冲液中含甲硫氨酸和甘氨酸的制剂单体百分比下降最明显。单体百分比下降主要是由于水解物的形成。
表3B列出了此项研究所检测的所有样品中凝聚物形成的百分比。这些结果表明3周内凝聚物形成的增加在二种缓冲液中于5℃时所有样品都极少。45℃保温3周后磷酸盐缓冲液中的样品显示凝聚物百分率增加为0.4％(EDTA)到2.4％(甘氨酸)范围。保温3周后琥珀酸盐缓冲液中凝聚物形成略低，范围从0.7％(甲硫氨酸)至1.09％(甘氨酸)。支持这些结果的一种假设是，如果凝聚物形成是由于氧化，其在琥珀酸盐缓冲液中较慢是由于琥珀酸盐缓冲液的金属螯合性能。
表3C列出了此项研究所检测的所有样品中水解物形成的百分比。起始时刻水解物的百分比范围所有样品为约0.2-0.4％.在5℃保温三周，所有样品水解物增加的百分比不显著。在45℃观察到水解物形成的速度明显升高。磷酸盐缓冲液配的样品水解物百分比在4.7％(甲硫氨酸)至1.5％(脯氨酸、甘油和乙醇)，而琥珀酸盐缓冲液为1.48％(Tween-80)至3.44％(甲硫氨酸)。总之，在含氨基酸的制剂中观察到水解物形成增加。此外，水解物形成速度在磷酸盐缓冲液中较快。这可能归因于琥珀酸钠和磷酸钠缓冲液的pH差异(分别为pH6.0和6.5)，表明碱催化水解是水解物形成的主要原因。
表 3a5℃和45℃在琥珀酸钠(pH6.0)和磷酸钠缓冲液(pH6.5)中T＝0和3周时用SEC测定的单体百分比样品 磷酸T＝0 磷酸T-3周 磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周单体％ 单体％5℃ 单体％45℃单体％ 单体％5℃单体％45℃Tween-8099.36 99.48 96.71 99.43 99.51 97.55EDTA99.37 99.42 96.43 99.42 99.53 97.51NaCl99.37 99.41 96.84 99.42 99.53 97.31甲硫氨酸99.42 99.42 94.08 99.47 99.53 95.86甘氨酸 99.41 99.42 95.90 99.46 99.53 96.46丝氨酸 99.41 99.45 96.15 99.45 99.53 97.29脯氨酸 99.40 99.43 97.29 99.45 99.52 97.06赖氨酸 99.34 99.62 95.45 99.45 99.57 96.28MgCl299.37 99.44 97.12 99.47 99.53 96.62Tween-2099.17 99.53 96.33 99.44 99.53 97.27甘油99.41 99.59 96.32 99.43 99.48 97.46乙醇99.41 99.42 97.24 99.31 99.19 97.42表 3B5℃和45℃在琥珀酸钠(pH6.0)和磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，T＝0和3周时用SEC测定的凝聚物百分比样品 磷酸T＝0 磷酸T-3周磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周凝聚物％ 凝聚物％5℃ 凝聚物％45℃ 凝聚物％凝聚物％5℃ 凝聚物％45℃Tween-800.410.00 1.61 0.36 0.36 0.96EDTA0.390.43 0.40 0.35 0.35 0.96NaCl0.400.43 1.23 0.33 0.34 0.85甲硫氨酸0.360.41 1.18 0.32 0.34 0.70甘氨酸 0.380.42 2.40 0.33 0.35 1.09丝氨酸 0.380.40 2.15 0.32 0.33 0.91脯氨酸 0.380.41 1.14 0.35 0.34 0.86赖氨酸 0.390.36 1.50 0.32 0.30 0.64MgCl20.380.42 0.60 0.32 0.34 0.82Tween-200.400.44 1.55 0.34 0.34 1.00甘油0.370.40 2.13 0.35 0.32 0.94乙醇0.370.43 1.26 0.28 0.38 0.91
表 3C5℃和45℃在琥珀酸钠(pH6.0)和磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，T＝0和3周时，用SEC测定的物百分比样品 磷酸T＝0 磷酸T-3周磷酸T＝3周 琥珀酸T＝0 琥珀酸T＝3周 琥珀酸T＝3周水解物％ 水解物％5℃ 水解物％45℃ 水解物％ 水解物％5℃ 水解物％45℃Tween-800.21 0.52 1.670.22 0.11 1.48EDTA0.22 0.15 2.000.22 0.12 1.53NaCl0.24 0.16 1.930.21 0.12 1.85甲硫氨酸0.21 0.16 4.740.21 0.13 3.44甘氨酸 0.20 0.15 1.700.21 0.12 2.41丝氨酸 0.21 0.14 1.690.23 0.12 1.81脯氨酸 0.22 0.16 1.580.21 0.13 2.08赖氨酸 0.24 0.02 3.050.23 0.12 3.09MgCl20.21 0.14 2.280.21 0.13 2.55Tween-200.44 0.03 2.120.22 0.11 1.73甘油0.23 0.01 1.540.22 0.20 1.61乙醇0.22 0.14 1.510.41 0.40 1.67(b)毛细管电泳用BioRAD系统以毛细管电泳(cIEF)分析了此项研究的所有样品。Daclizumab的典型cIEF图显示有4个峰。通常高温时加速老化，主要的同种型峰面积下降，然后其它同种型峰上升，表明一种同种型转变成另一种同种型。通过主要的同种型峰面积减少百分率计算出降解百分率 我们的结果表明，在45℃时，与琥珀酸盐缓冲液(pH6.0)中的相似样品相比，磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的样品降解更多。最佳载体电泳图见于赋形剂EDTA、NaCl、赖氨酸和MgCl2。对于含Tween-80、Tween-20、丝氨酸和脯氨酸的样品没有计算在5℃和45℃时3周后的降解百分率，因为它们的载体电泳图折叠，峰不可区别。
(c)效价根据此项研究结果，琥珀酸钠缓冲液看来比磷酸钠缓冲液更有应用前景。因此只对琥珀酸钠缓冲液和最稳定的赋形剂进行效价评估。这包括对含Tween-80、EDTA、NaCl和MgCl2的制剂进行5℃和45℃保温3周。结果(表4)显示所有制剂的效价都在规格范围内，表明发生的化学和物理降解过程没有显著改变该蛋白质的效价活性。
表4在5℃和45℃T＝3周时琥珀酸盐缓冲液配制的一些制剂的效价测定结果样品 pH ％效价Tween-80，5℃ 6.0 105Tween-80，45℃6.0 80EDTA，5℃ 6.0 103EDTA，45℃6.0 74NaCl，5℃ 6.0 105NaCl，45℃6.0 98MgCl2，5℃ 6.0 112MgCl2，45℃ 6.0 96讨论根据此项研究的结果，制剂在琥珀酸钠缓冲液(pH6.0)中的稳定性比在磷酸钠缓冲液(pH6.5)中为高。这主要是因为在较高pH6.5时碱催化的水解加速导致水解物形成速度加快。因此所有以下研究都选用pH6.0的琥珀酸钠缓冲液。此项研究的结果也明确表明，在这二种缓冲液中，氨基酸(甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸)对蛋白质的稳定性不具有稳定作用。如样品澄清度数据所示，所有含氨基酸的制剂在45℃时都有不溶性凝聚物形成。
本研究选用赋形剂MgCl2是根据它可能保护蛋白质避免脱酰胺基的推测。虽然据cIEF数据，MgCl2在磷酸钠缓冲液中及在琥珀酸钠缓冲液中沉淀，但MgCl2对蛋白质具有稳定作用。乙醇也作为赋形剂包括在内，测试它是否可通过降低溶液的介电常数稳定蛋白质避免脱酰胺基。然而结果不支持这个推测。最后最常用于稳定蛋白质制剂的赋形剂Tween-80、EDTA和NaCl却没有显示对二种缓冲液中的蛋白质有任何不稳定作用。
用pH6.0的琥珀酸钠缓冲进行了进一步实验；进一步检验了赋形剂(MgCl2、Tween-80、NaCl和EDTA)对蛋白质稳定性的作用。结果表明用100mM NaCl配制100mg/ml的抗体，Tween-80的最佳浓度在0.02-0.03％范围内。结果还表明增加盐浓度(100-150mM)能进一步稳定该制剂。因此有维持渗透性要求时应使NaCl浓度最高。结果还表明，含Tween-80和NaCl的制剂的稳定性可通过加入浓度为0.35-0.5％的EDTA而提高。在浓度范围0-50mM内加入MgCl2也能产生有利的作用。结果还表明，最稳定制剂的赋形剂浓度为150mM NaCl，0.05％Tween-80，0.03-0.04％EDTA和60-70mM MgCl2，然而这些条件不实用，因为它们不能提供等渗状态。
实施例4在琥珀酸盐缓冲液中的二种Daclizumab抗体制剂的稳定性数据按照实施例3制备制剂1和2。
制剂1100mg/ml Daclizumab抗体、30mM琥珀酸钠(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80。
制剂2与制剂1相同，另加0.05％EDTA。
在5℃、25℃和37℃，T＝0，2周，4周，8周，和12周时制剂1和2的稳定性结果见表5。
表 5制剂1和2的稳定性结果T＝0样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F1 澄清 98.27 0.770.96100F2 澄清 98.27 0.770.9690T＝2周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F1-5c澄清 98.31 0.730.95NAF1-25c 澄清 98.03 0.821.14NAF1-37c 澄清 97.11 1.211.69NAF2-5c澄清 98.20 0.920.90NAF2-25c 澄清 97.90 1.091.06NA
T＝4周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F1-5c澄清 98.30 0.740.9693F1-25c 澄清 97.80 0.921.2888F1-37c 澄清 96.20 1.772.0384F2-5C澄清 98.30 0.770.9394F2-25c 澄清 97.85 0.951.2092F2-37c 澄清 96.30 1.831.8780T＝8周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F1-5c澄清 98.24 0.730.9596F1-25c 澄清 97.51 0.821.1496F1-37c 澄清 94.76 1.211.6990F2-5c澄清 98.34 0.780.8890F2-25c 澄清 97.42 1.201.3890F2-37c 澄清 94.63 3.062.3185T＝12周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F1-5c澄清 98.25 0.731.0298F1-25c 澄清 97.07 1.261.6290F1-37c 澄清 93.31 3.882.8184F2-5c澄清 98.30 0.701.0094F2-25c 澄清 97.22 1.301.4888F2-37c 澄清 92.88 4.051.5482实施例5在组氨酸缓冲液中的二种Daclizumab抗体制剂的稳定性数据按照实施例3制备制剂3和4。
制剂3100mg/ml Daclizumab抗体、50mM组氨酸(pH6.0)、115mM NaCl和0.03％Tween-80，充氮气。
制剂4与制剂3相同，另加0.05％EDTA。
在5℃、25℃和37℃，T＝0，2周，4周，8周，和12周时制剂3和4的稳定性结果见表6。
表 6制剂3和4的稳定性结果T＝0样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F3 澄清 98.24 0.430.3379F4 澄清 98.01 0.680.3289T＝2周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F3-5C澄清 98.24 0.380.38NDF3-25C 澄清 99.09 0.470.44NDF3-37C 澄清 98.32 1.010.67NDF4-5C澄清 99.19 0.440.37NDF4-25C 澄清 99.11 0.470.42NDF4-37C 澄清 98.41 0.930.66NDT＝4周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F3-5C澄清 96.26 0.370.3591F3-25C 澄清 98.99 0.560.4576F3-37C 澄清 97.96 1.420.6283F4-5C澄清 99.28 0.380.3481F4-25C 澄清 99.00 0.560.4485F4-37C 澄清 97.94 1.440.6379
T＝8周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F3-5C澄清 99.24 0.380.3886F3-25C 澄清 98.74 0.820.5482F3-37C 澄清 96.87 2.370.7675F4-5C澄清 99.23 0.390.3897F4-25C 澄清 98.71 0.750.5492F4-37C 澄清 96.90 2.340.7686T＝12周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价F3-5C澄清 98.89 0.630.4999F3-25c 澄清 98.04 1.210.7596F3-37c 澄清 94.79 4.061.1790F4-5C澄清 98.92 0.600.4891F4-25C 澄清 98.06 1.230.7287F4-37c 澄清 95.02 3.831.1578实施例6 Daclizumab制剂在室温保存一年的稳定性数据检测了以30mM琥珀酸钠(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80配制的100mg/ml Daclizumab液态抗体制剂在25℃保存一年后的稳定性。稳定性结果表明该制剂在25℃稳定至少一年。(表7)表 7Daclizumab制剂在25℃保存一年后的稳定性结果样品澄清度％单体％絮凝物％凝聚物 ％效价T＝0 澄清 98.27 0.770.96100T＝1年 澄清 94.32 3.142.5386实施例7 Daclizumab制剂在5℃保存18个月后的稳定性数据将以30mM琥珀酸钠(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80配制的100mg/mlDaclizumab液态抗体制剂在5℃(2-8℃)保温不同时间，测试其不同时间点的稳定性。稳定性结果表明该制剂在冷藏温度下至少可稳定18个月。(表8)表 8Daclizumab在5℃时的稳定性结果时间(月) ％单体 ％凝聚物0 99.0 N/A3 99.1 0.2％6 99.1 0.2％9 98.8 0.2％12 98.9 0.2％18 98.6 0.2％实施例8 HAIL-12(组氨酸缓冲液)的稳定性数据以50mM组氨酸缓冲液(pH6.0)、120mM NaCl和0.03％Tween-80配制HAIL-12(抗IL-12抗体，50mg/ml)。正在进行的稳定性试验表明该制剂在5℃至少可稳定9个月(表9)。
表 9HAIL-12在5℃时的稳定性结果样品 澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价T＝0澄清 99.47 0.180.3595T＝7个月澄清 98.90 0.650.45--T＝8个月------ --- --- - 100T＝9个月--- 98.52 ----- -- -实施例9 HAIL-12(琥珀酸盐缓冲液)的稳定性数据以40mM琥珀酸钠缓冲液(pH6.0)、100mM NaCl和0.03％Tween-80配制HAIL-12(50和100mg/ml)。正在进行的稳定性试验表明该制剂在5、25和37℃至少可稳定12周(表10和11)。
表 10不同温度时HAIL-12(50mg/ml)的稳定性结果T＝0样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价5℃ 澄清 99.27 0.270.4799T＝12周样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价5℃ 澄清 99.00 0.340.6710925℃ 澄清 98.05 0.921.047637℃ 澄清 93.86 4.251.9075T＝6个月样品澄清度％单体％水解物％凝聚物％效价5℃ 澄清 98.63 0.610.769725℃ 澄清 97.1 1.671.2278表 11不同温度时HAIL-12(10mg/ml)的稳定性结果T＝0样品 澄清度 ％单体 ％水解物 ％凝聚物5℃澄清99.2 0.31 0.49T＝12周样品 澄清度 ％单体 ％水解物 ％凝聚物5℃澄清98.9 0.31 0.7825℃ 澄清97.670.95 1.3837℃ 澄清93.264.14 2.6实施例11 HuEP5C7的稳定性数据以50mM组氨酸缓冲液(pH6.0)、125mM NaCl和0.01％Tween-80配制HuEP5C7(抗L选择蛋白抗体，50和100mg/ml)。正在进行的稳定性试验表明，该制剂在25℃和45℃可稳定3个月，在5℃至少可稳定9个月。5℃9个月稳定性试验的结果见表12。3个月加速稳定性试验结果见表13。
表 12HuEP5C7在5℃时的稳定性结果50mg/ml样品％单体 ％水解物 ％凝聚物 ％效价T＝0 98.540.30 1.17 83T＝9个月 99.080 0.91 99100mg/ml样品％单体 ％水解物 ％凝聚物 ％效价T＝0 98.560.23 1.21 79T＝9个月 98.5 0.03 1.47 90表 13HuEP5C7在不同温度时的稳定性结果T＝3个月样品 ％单体 ％水解物 ％凝聚物 ％效价50mg/ml，5℃ 99.48 0.14 0.39 12150mg/ml，25℃ 98.81 0.31 0.88 7250mg/ml，45℃ 98.26 0.99 0.76 107100mg/ml，5℃ 99.03 0 0.97 93100mg/ml，25℃98.56 0.40 1.06 78100mg/ml，45℃97.88 0.92 1.20 91现已用完整、清楚、简明和准确的专业用语说明了本发明，以及制备及使用本发明制剂的方式和方法，从而使属本领域的技术人员能够制备和使用这些制剂。应理解可对上述本发明的优选实施例进行改进，而不脱离本发明权利要求书所述的范围。为特别指出和明确要求被看作本发明的主要内容，此说明书以下列权利要求书结果中。
权利要求
1.一种稳定的液态药物制剂，其特征在于，该制剂含有pH约5.5-6.5的约20-60mM的琥珀酸缓冲液，约0.01％-0.1％的聚山梨酯，能增强该制剂等渗性的渗透修饰剂，和50mg/ml以上的抗体。
2.一种稳定的液态药物制剂，其特征在于，该制剂含有pH约5.5-6.5约30-70mM的组氨酸缓冲液，约0.01％-0.1％的聚山梨酯，能增强该制剂等渗性的渗透修饰剂，和50mg/ml以上的抗体。
3.如权利要求1或2所述的液态药物制剂，其中所述抗体浓度高于100mg/ml。
4.如权利要求1或2所述的稳定的液态药物制剂，其中所述渗透修饰剂是NaCl或MgCl2。
5.如权利要求4所述的稳定的液态药物制剂，其中所述NaCl为75-150mM。
6.如权利要求4所述的稳定的液态药物制剂，其中所述MgCl2为1-100mM。
7.如权利要求1或2所述的稳定的液态药物制剂，其中所述pH约为6.0-6.5。
8.如权利要求1或2所述的稳定的液态药物制剂，其中所述聚山梨酯的浓度约为0.02-0.04％。
9.如权利要求1或2所述的稳定的液态药物制剂，所述制剂还含有0.01-0.5％的EDTA。
10.如权利要求1或2所述的稳定的液态药物制剂，其中所述制剂在约2-8℃时可稳定至少一年。
11.如权利要求1或2所述的稳定的液态药物制剂，其中所述制剂在约23-27℃时可稳定至少6个月。
12.一种液态药物制剂，其特征在于，该制剂含有pH约5.5-6.5的约20-60mM的琥珀酸缓冲液，约0.01％-0.05％的聚山梨酯，约75-150mM的氯化钠和50mg/ml以上的选自Daclizumab、Flintozumab、HAIL-12和HuEP5C7的抗体。
13.一种液态药物制剂，其特征在于，该制剂含有pH约5.5-6.5的约30-70mM的组氨酸缓冲液，约0.01％-0.05％的聚山梨酯，约75-150mM的氯化钠和50mg/ml以上的选自Daclizumab、Flintozumab、HAIL-12和HuEP5C7的抗体。
全文摘要
本发明涉及一种稳定的液体药物制剂，该制剂含有pH约5.5－6.5的约20－60mM的琥珀酸缓冲液，或30－70mM的组氨酸缓冲液；约0.01％－0.1％的聚山梨酯(polysorbate)；和能增强该制剂等渗性的渗透修饰剂，以及高浓度如50mg/ml或以上的抗体。该液体制剂在冷藏温度(2－8℃)下至少能稳定一年，优选二年。该液体制剂适合皮下注射。本发明的示范性抗体是Daclizumab，一种人源化抗IL－2受体单克隆抗体；HAIL－12，一种抗IL－12人源化单克隆抗体；HuEP5C7，一种抗L－选择蛋白的人源化单克隆抗体和Flintozumab，一种抗γ干扰素的人源化单克隆抗体。
文档编号A61K9/00GK1612689SQ02826727
公开日2005年5月4日 申请日期2002年11月8日 优先权日2001年11月8日
发明者E·A·凯舍瓦, S·古普塔, S·G·杜弗, M·萨布拉曼尼安 申请人:蛋白质设计实验室股份有限公司