专利名称：双特异性抗erb－b抗体及其在肿瘤治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型双特异性抗体及其在肿瘤治疗中的用途。该新型抗体能够与在多种癌组织上过表达的ErbB受体，特别是ErbB1受体结合。因为抗原结合位点的不同特异性针对相同或不同ErbB受体的结合域内的不同表位，这些抗体在抑制和下调ErbB受体和相应的信号级联方面更加有效。本发明还涉及药物组合物，其包含所述双特异性抗体或其片段和其它药学上有效的药剂诸如单特异性抗体、免疫缀合物和/或细胞毒性剂。
背景技术：
在超过20年的时间里，已知针对肿瘤细胞表面上的多种受体和其它抗原的生物分子，诸如单克隆抗体(MAb)或其它蛋白质/多肽，以及小化学化合物适用于肿瘤治疗。关于抗体方法，这些MAb大多数是被嵌合化的或人源化的以改善人类免疫系统的耐受性。MAb或上述化学体与其在肿瘤细胞上和大多数情况下也存在于正常组织上的靶结构特异性结合，并可导致依赖于其表位特异性和/或具体抗原的功能特性的不同效应。针对孤儿受体(orphan receptor)或其它无功能的细胞表面分子的MAb以及针对功能活性受体(例如具有激酶活性的生长因子受体)的配体-结合位点外部结构的MAb被预期可诱导主要针对靶细胞的免疫效应子功能(抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，补体依赖细胞毒性(CDC))。此外，根据抗原和Mab的特性，抗体的结合可导致受体的交联。由此引起的受体-抗体复合物内在化可导致细胞表面上受体密度的长时期下调。
与配体-结合位点内的或其直接邻域中的表位结合的Mab与天然配体竞争和其受体结合，由此降低或完全抑制了配体结合，并可置换已与其受体结合的配体。该受体的阻断抑制了配体依赖性受体活化和下游信号传导。例如，ErbB受体，诸如表皮生长因子受体(EGFR)被单克隆抗体阻断会导致多种细胞效应，包括抑制DNA合成和增殖，诱导细胞周期停滞和凋亡以及抗转移和抗血管生成作用。
在二十世纪八十年代，ErbB受体是癌症所涉及的典型受体酪氨酸激酶。酪氨酸激酶是一类酶，其催化腺苷三磷酸的末端磷酸向蛋白质底物中的酪氨酸残基转移。据信酪氨酸激酶通过底物磷酸化，在许多细胞功能的信号传导中起关键作用。虽然信号传导的确切机理仍不清楚，但是酪氨酸激酶在细胞增殖，癌发生和细胞分化中显示出是重要的起作用因子。
酪氨酸激酶可分为受体型和非受体型。受体型和非受体型两种酪氨酸激酶都参与细胞信号途径，这些途径可导致许多病理状况，包括癌症，牛皮癣和超免疫反应。许多酪氨酸激酶参与细胞生长及血管生成。
非受体型酪氨酸激酶也由许多亚家族组成，包括Src，Frk，Btk，Csk，Abl，Zap70，Fes/Fps，Fak，Jak，Ack和LIMK。这些亚家族的每一个还可再分成不同的受体。例如，Src亚家族是最大的亚家族之一，其包括Src，Yes，Fyn，Lyn，Lck，Blk，Hck，Fgr和Yrk。Src亚家族中的酶与肿瘤形成有关。对非受体型酪氨酸激酶的更详细的讨论，参见BolenOncogene，82025-2031(1993)。
受体型酪氨酸激酶具有细胞外，跨膜和细胞内部分，而非受体型酪氨酸激酶完全是细胞内的。受体连接的酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其包含细胞外配体结合域，跨膜序列，以及胞质酪氨酸激酶域。受体型酪氨酸激酶由大量具有不同生物活性的跨膜受体组成。
已经鉴定出了不同亚家族的受体型酪氨酸激酶。涉及的酪氨酸激酶包括成纤维细胞生长因子(FGF)受体，ErbB主要家族类型中的表皮生长因子(EGF)受体和血小板衍生生长因子(PDGF)受体。还涉及神经生长因子(NGF)受体，脑衍生的神经营养因子(BDNF)受体，以及神经营养蛋白-3(NT-3)受体和神经营养蛋白-4(NT-4)受体。
一个受体型酪氨酸激酶亚家族，被命名为HER或ErbB亚家族，由EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyr02)组成。此亚家族受体的配体包括表皮生长因子(EGF)，TGF-a，双调蛋白(amphiregulin)，HB-EGF，β-细胞调节素(betacellulin)、heregulin及神经调节蛋白。PDGF亚家族包括由激酶插入域受体(KDR)组成的FLK家族。
EGFR，由ErbB1基因编码，其与人类恶性肿瘤因果相关。特别是，在乳腺，膀胱，肺，头，颈和胃部癌症以及成胶质细胞瘤中已经观察到EGFR的表达增强。EGFR受体表达的增强常常伴随有同一肿瘤细胞中EGFR配体——转化生长因子α(TGF-α)的产生增加，从而经自分泌刺激途径引起受体激活(Baselga和Mendelsohn，Pharmac.Ther.64127-154(1994))。
EGF受体是一种分子量为170,000的跨膜糖蛋白，并发现其存在于许多上皮细胞类型上。其可以被至少三种配体——EGF，TGF-α(转化生长因子α)和双调蛋白激活。经证明表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)都能与EGF受体结合进而引起细胞增殖和肿瘤生长。这些生长因子不能与HER2结合(Ulrich and SCH1esinger，1990，Cell 61，203)。与借助自身二聚化性质诱导受体二聚化的几个生长因子家族(如PDGF)不同，单体生长因子如EGF具有2个受体结合位点，因此，其可以使两个邻近的EGF受体交联(Lemmon等，1997，EMBO J.16，281)。受体二聚化对激活生长因子受体的内在催化活性以及对生长因子受体在酪氨酸残基上的自磷酸化是必需的。后者可作为多种衔接蛋白质或酶的停泊位点，而这些蛋白质或酶可同时启动许多信号级联。在高等真核细胞中，简单的线性通路演化为充分交互作用的多层网络，其中组分的组合表达和活化使得可以在发育的自始至终形成情景特异性生物反应。ErbB网络不仅能整合其自身的输入信号，还能整合异源信号，包括激素，淋巴因子，神经递质和应激诱导物。
应当指出的是受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)既能进行同二聚化，也能进行异二聚化，其中同二聚体受体组合的促有丝分裂和转化作用(不启动或弱启动信号传导)低于相应的异二聚体组合。包含ErbB2的异二聚体是最有效的复合物(参见如下综述Yarden and Sliwkowski，2001，NatureReviews，Molecular cell Biology，volume 2，127-137；Tzahar and Yarden，1998，BBA 1377，M25-M37)。
已经证明抗EGF受体的抗体在阻断EGF和TGF-α与受体结合的时候，显示出对肿瘤细胞增殖的抑制。考虑到这些发现，已经研制出很多小鼠和大鼠单克隆抗EGF受体抗体，并在体内和体外检测了其对肿瘤细胞生长进行抑制的能力(Modjtahedi and Dean，1994，J.Oncology 4，277)。人源化单克隆抗体425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合型单克隆抗体225(cMAb 225，US 4,943,533和EP 0359282)都是针对EGF受体的，而且在临床试验中均显示有效。已经证明C225抗体(Catuximab)可在体外抑制由EGF介导的肿瘤细胞生长，以及在裸鼠体内抑制人肿瘤的形成。而且，最重要的是，该抗体在异种移植小鼠模型中还显示出可与某些化疗剂(即阿霉素(doxorubicin，adriamycin)，紫杉醇和顺铂)协同作用体内根除人肿瘤。Ye等(1999，Oncogene 18，731)报道通过联合应用嵌合型MAb225和针对HER2受体的人源化MAb 4D5可以对人卵巢癌细胞进行成功地治疗。
ErbB家族的第二个成员HER2(ErbB2或p185neu)，其最初被鉴定为来自经化学处理的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因产物。neu原癌基因的激活形式由该编码蛋白的跨膜区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)引起。可在乳腺和卵巢癌症中观察到neu人同系物的扩增，其与预后不良有关(Slamon等，Science，235177-182(1987)；Slamon等，Science，244707-712(1989)；US 4,968,603)。ErbB2(HER2)的分子量为大约185,000，虽然至今对HER2的特异性配体尚未明确确定，但ErbB2(HER2)与EGF受体(HER1)有相当高的同源性。
进一步发现针对HER2受体的抗体4D5使过表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNFα的细胞毒性效应敏感(US 5,677,171)。鼠抗-ErbB2抗体4D5的人源化重组体(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；US 5,821,337)在已进行过大量抗癌前期治疗的患有ErbB2-过表达转移性乳腺癌的患者中具有临床活性(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。HERCEPTIN在1988年被正式批准上市用于治疗患有转移性乳腺癌(其肿瘤过表达ErbB2蛋白)的患者。
除抗ErbB抗体外，已知多种小化学分子也是ErbB受体分子的有效抑制剂，其能阻断天然配体的结合位点(参见详细的描述)，或阻断受体激酶的结合位点的酪氨酸残基，由此阻止磷酸化和进一步的级联信号。
在临床试验中显示出高效能的一个代表物是IressaTM(ZD-1839)，其可以用于NSCLC适应症(非小细胞肺癌)。
虽然已有一些处于研发和上市中的有希望用于治疗肿瘤的药物和方法，但仍需要具有改进的特性和增高的功效的其它药剂和药物组合物和组合。
发明概述本发明基于本发明人的如下发现某些在患病细胞例如肿瘤细胞表面上过表达的受体酪氨酸激酶诸如ErbB受体分子在天然配体结合域内具有特异性表位位点，不同抗体或一般而言，不同特异性可与这些位点同时结合，而不会出现或仅存在可忽略的相互阻碍。显然，这些抗体或特异性所结合的表位在三维构型方面与受体分子的结合域的完整大小相比相对较小。其可诱导增加的对信号通路活性的下调，优选增加的对ErbB受体的阻断，以及由此增加的对整个信号级联的阻断。
本发明首次描述了肿瘤治疗的新概念，即对个体施用双特异性抗体或其功能上有效的片段，通过所述双特异性抗体的第一特异性抗原结合位点与第一表位结合和第二特异性抗原结合位点与相同或不同受体的第二不同表位结合，而阻断或抑制ErbB受体，优选EGF受体(EGFR)。
可以发现，该双特异性抗体可通过其两个不同的抗原结合位点而同时与相同受体分子(例如EGFR或Her-2)或者不同受体分子(例如EGFR和Her-2)的天然配体结合域中的不同表位结合，而不会出现抗体的不同抗原结合位点间的显著相互阻碍，从而使得受体上出现更高的抗体密度并导致(通过降低与天然(激动性)配体诸如EGF或TGFa的结合能力)对单体或二聚体单位形式的相应受体分子的信号级联强得多的抑制。这应导致对肿瘤生长更强的抑制和/或导致实体瘤或肿瘤转移的凋亡增加。优选的抗体尤其是上文和下文中描述的抗EGFR和抗Her2抗体，及其片段，优选双特异性F(ab′)2片段，这是因为其具有较小的尺寸。在本发明的优选的实施方案中，描述了由源于人源化、嵌合或鼠型MAb 425的第一抗原结合位点和源于人源化、嵌合或鼠型MAb 225的第二抗原结合位点组成的双特异性抗体(片段)(BAb<425，225>，F(ab′<425>，ab′<225>))。在本发明的其它实施方案中，描述了由源于人源化、嵌合或鼠型MAb 425的第一抗原结合位点和源于人源化、嵌合或鼠型MAb 4D5的第二抗原结合位点组成的双特异性抗体(片段)(BAb<425，4D5>，F(ab′<425>，ab′<4D5>))。在本发明的其它实施方案中，描述了由源于人源化、嵌合或鼠型MAb 225的第一抗原结合位点和源于人源化、嵌合或鼠型MAb4D5的第二抗原结合位点组成的双特异性抗体(片段)(BAb<225，4D5>，F(ab′<425>，ab′<4D5>))。在上述实施方案中，人源化MAb 425、嵌合MAb225(CETUXIMAB)和人源化4D5(HERCEPT1N)优选作为源抗体。原则上本发明也包括杂合抗体(heteroantibody)或其片段。合成制备的杂合抗体甚至可由源于三种不同的抗EGFR抗体或其片段的三个不同的抗原结合位点部分组成(例如<425，225，4D5>)。
已发现，与相应单特异性抗体相比，根据本发明的双特异性抗体能够增强不同或相同ErbB受体的交聪/二聚化，增强对ErbB受体的阻断/抑制，增强对ErbB受体-特异性信号通路调节的诱导。令人感兴趣的是，该交联作用可进一步被包含所述双特异性抗体(片段)和单特异性抗ErbB抗体(片段)的混合物增强，其中所述单特异性抗体(片段)优选具有与双特异性抗体(片段)的所述第一或第二抗原结合位点相同的抗原结合位点。换言之例如，(i)MAb 425或MAb 225或MAb 4D5和BAb<425，225>；或(ii)MAb 425或MAb 225或MAb 4D5与BAb<425，4D5>；或(iii)MAb 425或MAb 225或MAb 4D5与BAb<4D5，225>的混合物与将MAb或BAb作为单独药剂以相同浓度进行施用相比，前者引起增加的对ErbB受体的抑制和下调。
虽然上述发现是仅对将ErbB受体作为靶受体分子而做出的，应当指出的是由本发明人所揭示的并如上述和下述的科学原理也适用于ErbB之外的其它生物受体。
任选地，本发明的组合物还包含可以支持和增强上述分子的功效的治疗活性化合物。
所述药剂可以是细胞毒性剂，优选是拮抗性分子，诸如酪氨酸激酶拮抗剂、其它ErbB拮抗剂、激素受体拮抗剂、蛋白激酶拮抗剂或抗血管生成剂。下面将更详细地具体描述可用于本发明的所述分子。
本发明所述的治疗活性剂也可以以包含如下包装的药物试剂盒的形式提供，所述包装包含在分开容器内的或在单一容器内的一种或多种所述拮抗剂。利用该联合的治疗方法可以任选地包括放射性治疗。大抵上，此药物施用可与放射治疗伴随进行，其中放射治疗可与药物施用基本上同时或在之前或在之后进行。根据本发明的联合疗法中不同药剂的施用也可以基本上同时进行或相继进行。细胞表面上有参与肿瘤血管形成的受体的肿瘤可用本发明联合疗法成功地治疗。
已知肿瘤的发育和生长有多条可替换的路线。如果一条路线被阻断，则它们常能通过表达和使用其他受体和信号途径而转换到另一条路线上。因此，由于本发明的药物联合可以阻断几种这样的可能肿瘤发育策略，因而具有多个优点。根据本发明的组合可用于治疗和预防那些通过激活存在于肿瘤细胞表面上的相关激素受体而发育和生长的肿瘤、肿瘤样疾病和瘤形成性疾病以及肿瘤转移。
本发明联合中的不同药剂优选以低剂量联合应用，即，低于常规的临床条件下使用的剂量。在给个体施用本发明的化合物、组合物、药剂和治疗的时候，降低剂量的优点包括降低了高剂量相关副反应的发生率。例如，通过降低如上文和下文所述药剂的剂量，和高剂量条件下观察到的效果相比，恶心和呕吐的频率和严重程度都得到降低。预期降低副反应发生率将能改善癌症患者的生活质量。降低副反应发生率的优点还包括改善患者的依顺性、降低因副反应需要住院治疗的次数、减少在医治副反应带来的疼痛时所需止痛剂的使用。另外，本发明的方法和联合还能使高剂量时的治疗效果最大化。
上述组合显示出令人惊异的协同作用。临床研究中可以观察到使用该药物联合使肿瘤出现真实的缩小和解体，同时没有检测到明显的药物副反应。
本发明一般涉及·双特异性抗体，或其功能上有效的片段，其包含与第一ErbB受体的第一表位结合的第一抗原结合位点和与第二ErbB受体的第二表位结合的第二不同抗原结合位点。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一和/或所述第二表位位于所述受体的天然配体的结合域内。
·相应的双特异性抗体或其片段，与相应单特异性抗体相比，其增强对ErbB受体的阻断和/或抑制，并增强对ErbB受体-特异性信号通路下调的诱导。
·相应的双特异性抗体或其片段，其增强对具有相同或不同特异性的受体分子的交联和/或二聚化的诱导。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一ErbB受体的第一表位与第二ErbB受体的第二表位不同。
·权利要求5的双特异性抗体或其片段，其中所述第一ErbB受体与所述第二ErbB受体不同。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一和第二ErbB受体是相同的。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一ErbB受体是EGF受体(EGFR)。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第二ErbB受体是ErbB-2(Her-2)。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一和第二ErbB受体是EGF受体(EGFR)。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 425。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 225。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 425，而所述第二抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 225，每个抗原结合位点与相同EGF受体分子的天然配体结合域中的不同表位结合。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一ErbB受体是EGF受体(EGFR)而所述第二ErbB受体是ErbB-2(Her-2)。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 425或225，而所述第二抗原结合位点源于MAb 4D5(Herceptin)。
·相应的双特异性抗体或其片段，其中片段是F(ab′)2。
·药物组合物，其包含如上述权利要求任一项所述的双特异性抗体或其功能上有效的片段和可选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
·相应的药物组合物，其还包含单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段。
·相应的药物组合物，其中所述单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段选自MAb 425、MAb 225，或MAb4D5(Herceptin)。
·相应的药物组合物，其还包含细胞毒性剂。
·相应的药物组合物，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
·相应的药物组合物，其中所述化疗剂选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素。
·相应的药物组合物，其中所述细胞毒性剂是ErbB受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂，或抗血管生成剂。
·一种药物试剂盒，其包含(i)第一包装，其至少包含上述双特异性抗体或其功能上有效的片段，和(ii)第二包装，其至少包含单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段。
·相应的药物试剂盒，其包括包含BAb<h425，c225>或其F(ab′)2片段的第一包装和包含人源化MAb 425(h425)、嵌合MAb 225(c225)或人源化Mab 4D5或其功能上有效的片段的第二包装。
·相应的药物试剂盒，其还包含第三包装，该包装包含其它药剂。
·相应的药物试剂盒，其中所述其它药剂是细胞毒性药。
·相应的药物试剂盒，其中所述细胞毒性药选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素、ErbB受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂和抗血管生成剂。
·上述双特异性抗体或药物组合物/试剂盒在制备用于治疗过表达ErbB受体的肿瘤和肿瘤转移的药物中的用途。
·一种在个体中治疗过表达ErbB受体的肿瘤和肿瘤转移的方法，其包括对所述个体施用治疗上有效量的上述和权利要求中所述的双特异性抗体或其功能上有效的片段或药物组合物/试剂盒。
·一种在过表达ErbB受体的肿瘤中增强ErbB受体-特异性信号通路下调的方法，该方法通过对个体施用治疗上有效量的上述双特异性抗体或其功能上有效的片段或药物组合物/试剂盒来实施。
·相应的方法，还包括对患者施用有效量的细胞毒性剂。
·相应的方法，其中所述细胞毒性剂是化疗剂，且选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素。
·相应的方法，其中所述细胞毒性剂是ErbB受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂，或抗血管生成剂。
在本发明的优选实施方案中，本发明的双特异性抗体的一个抗原结合位点所结合的第一ErbB受体类型是ErbB1受体(EGFR)。
因此，本发明更具体地涉及·双特异性抗体或其片段，其能够与位于相同或不同ErbB受体分子类型上的不同表位结合，所述抗体包含与第一受体类型ErbB1的表位结合的第一抗原结合位点和与第二ErbB受体分子类型的不同表位结合的第二不同抗原结合位点。
·双特异性抗体，其中所述第二ErbB受体分子类型是ErbB1(EGFR)。
·双特异性抗体，其中所述第二ErbB受体分子类型是ErbB2(Her-2)。
·双特异性抗体，其中至少一个所述表位位于受体结合域内。
·双特异性抗体，其中所述受体结合域是所述受体的天然配体结合域。
·双特异性抗体，其中第一或第二抗原结合位点与所述ErbB受体分子类型的天然配体结合域内的表位结合。
·双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合位点与所述ErbB受体分子类型的天然配体结合域内的表位结合。
·双特异性抗体，其中抗原结合位点与位于相同ErbB受体分子类型上的不同表位结合。
·双特异性抗体，其中抗原结合位点与位于不同ErbB受体分子类型上的不同表位结合。
·双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合位点各自与所述ErbB受体的天然配体结合域内的不同表位结合，由此阻断和/或抑制该受体，借此与相应单特异性抗体相比，增强对ErbB受体的阻断和/或抑制以及增强对ErbB受体-特异性信号通路下调的诱导。
·双特异性抗体，其中与双特异性抗体和相同ErbB受体分子类型上的表位的结合相比，增强了对具有相同或不同特异性的不同ErbB受体分子的交联和/或二聚化的诱导。
·双特异性抗体，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 425。
·根据权利要求1-11任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 225。
·双特异性抗体，其被命名为“BAb<h425，c225>”，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 425，而所述第二抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb 225，各抗原结合位点与ErbB1受体(EGFR)分子上的不同表位结合。
·双特异性抗体，其中所述不同表位位于天然配体的结合域内。
·双特异性抗体，其中第二抗原结合位点与ErbB 2受体分子(Her-2)或VEGF受体分子结合。
·权利要求16的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合位点源于MAb4D5(Herceptin)。
·源于上述和权利要求任一项所述的双特异性抗体的双特异性抗体片段，其中片段是F(ab′)2。
·药物组合物，其包含上述和权利要求中所述的一种或多种双特异性抗体或其片段，以及任选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
·药物组合物，其还包含单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段。
·药物组合物，其中所述单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段选自MAb 425、MAb 225，或MAb 4D5(Herceptin)。
·药物组合物，其还包含细胞毒性剂。
·药物组合物，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
·药物组合物，其中所述化疗剂选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素。
·药物组合物，其中所述细胞毒性剂是ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗血管生成剂、抗激素剂，或细胞因子。
·免疫缀合物，其包含上述双特异性抗体，该抗体直接或借助接头分子在C末端与生物学上有效的肽、多肽或蛋白质融合，其中优选的所述蛋白质或多肽是细胞因子。
·药物试剂盒，其包含(i)第一包装，其包含至少上述和权利要求中所述的双特异性抗体或免疫缀合物，和(ii)第二包装，其包含至少单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段。
·药物试剂盒，其包含第一包装和第二包装，该第一包装包含双特异性抗体“BAb<h425，c225>”或其F(ab′)2片段或其免疫缀合物，所述第二包装包含人源化MAb 425(h425)、嵌合MAb 225(c225)或人源化Mab 4D5或其功能上有效的抗体片段或其免疫缀合物。
·药物试剂盒，其还包含第三包装，该包装包含细胞毒性药。
·药物试剂盒，其中所述细胞毒性药选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素、ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗激素剂和抗血管生成剂。
·上述的双特异性抗体或药物组合物/试剂盒在制备用于治疗过表达ErbB受体的肿瘤和肿瘤转移及相关疾病的药物中的用途。
发明详述本发明基于如下观察结果，具有针对不同免疫原性结构的特异性的两种或多种MAb可同时且无阻碍地或仅具有不显著的阻碍地与其表位结合，所述表位可以位于相同受体内，甚至是相同的受体结构域内，例如配体结合域内。因此，具有针对相同受体的不同表位的特异性的双特异抗体可与其两个特异性表位结合由此形成二价受体-抗体复合物，在使用单特异性Mab时大多数情况下在单一受体上是看不见这种复合物的。
或者，所述双特异性抗体的抗原结合位点可以与邻近的其它相同受体发生相互作用，由此在这些受体之间构建复合物。此外，针对相同或不同受体家族的不同受体上的抗原结构的双特异性抗体也可以被用来在这些受体之间构建复合物。
与仅用一种单特异性抗体的治疗效果相比，使用针对相同或不同受体的一种或多种双特异性抗体或单特异性和双特异性抗体的联合可极大地改进治疗效果·双特异性抗体的每个抗原结合位点独立地与其在靶受体(例如EGFR)上的特异性表位结合。
·双特异性抗体的两个抗原结合位点可与其特异性表位发生相互作用，所述表位可位于相同受体上且可能位于相同受体域内或位于不同受体上。
·双特异性抗体能独立地结合相同受体上的两种不同表位。与单特异性抗体的亲合力在大多数情况下受限于与该受体的单价结合相比，这增加了双特异性抗体对单个受体的总亲合力。
·由于对单个受体的较高亲合力，与单特异性MAb相比，有效阻断受体将需要较低浓度的双特异性抗体。
·因为双特异性抗体在受体阻断方面比单特异性MAb更有效，其可以诱导对受体激活和下游信号传导更显著的抑制作用。
·类似地，具有针对配体结合域内或邻近结合域的不同表位的特异性的一种或多种双特异性抗体或单特异性和双特异性抗体的混合物能增加受体阻断的功效。
·因为由针对相同受体结构域的两种或多种单特异性和/或双特异性抗体的联合造成的受体阻断比仅由单一一种单特异性或双特异性抗体造成的受体阻断更有效，故可得到对配体-结合更有效的抑制作用，从而导致更有效的受体失活。
·该更有效的受体失活导致对下游受体信号传导更有效的抑制，并由此导致对配体-依赖性细胞功能的影响增强。
·由于该更有效的受体阻断，故可降低所使用的各单特异性和/或双特异性抗体的剂量(或浓度)而不会损失功效。当使用低于最适治疗剂量仍显示出剂量限制性毒性或副作用的治疗性抗体时，这可能是非常有意义的。
·与相同细胞上的不同受体结合的双特异性抗体以及单特异性抗体将首先形成二聚的受体-抗体复合物。但是，由于其不同的抗原特异性，双特异性抗体可形成这样的受体-抗体复合物，该复合物不限于相同受体的二聚体。由此，由双特异性抗体形成的受体聚集物可包含大的、理论上无限数量的受体。
·这些大受体-抗体复合物改善了受体的内在化，并由此可能对于从细胞表面除去受体和随后下调受体-依赖性细胞功能更为有效。
·通过联合两种或多种单特异性和/或双特异性抗体可进一步增强大受体-抗体复合物的形成，由此可以进一步增强受体的内在化和对受体-依赖性细胞功能的下调。
·针对相同或不同受体的双特异性抗体及两种或多种单特异性和/或双特异性抗体的联合可用于治疗带有适宜受体的肿瘤。EGFR阳性肿瘤是一个典型的实例，但是本发明所述的治疗原则的应用并不限于该适应症。由此，采用相同的原则可以治疗带有其它受体、受体家族或其它抗原性结构的种类繁多的肿瘤。
·利用双特异性抗体进行的治疗或利用针对相同或不同受体上的不同抗原的两种或多种单特异性和/或双特异性抗体进行的联合治疗，还可以联合化疗药和/或放射实施联合治疗。
·利用双特异性抗体进行的治疗或利用针对相同或不同受体上的不同抗原的两种或多种单特异性和/或双特异性抗体进行的联合治疗，还可与其它治疗原则联合使用，所述其它治疗原则包括但不限于激素拮抗剂或激素激动剂、血管生成抑制剂疗法和其它疗法。
本文中以对EGFR阳性肿瘤的治疗为例，描述了应用具有针对相同或不同受体上的不同抗原结构的特异性的双特异性抗体或单特异性和双特异性抗体的联合的治疗原则。但是，该原则并不限于EGFR，其可适用于任何其它靶抗原的应用。
若没有另外的说明，本发明使用的术语和词语具有下面给出的含义和定义。而且，这些定义和含义更详细地描述了本发明，包括优选实施方案。
“受体”或“受体分子”是指可溶的或膜结合/相关的蛋白或糖蛋白，其含有一个或多个可与配体结合以形成受体-配体复合物的域。通过与可能是激动剂或拮抗剂的配体结合，受体可以被激活或者失活，由此可以启动或阻断信号通路。
术语“受体分子类型”或“ErbB(ErbB1)受体分子类型”是指具体的受体类型诸如ErbB1，ErbB2等，而非该受体类型的具体的单分子。换言之本发明的双特异性抗体可通过其第一抗原结合位点与ErbB1受体分子个体的第一表位结合，而该抗体的第二抗原结合位点与该相同的ErbB1受体分子个体的第二不同表位结合。还可能是该抗体的第二抗原结合位点与另一相同类型(ErbB1)的受体分子个体的第二不同表位结合。此外，还可能是该抗体的第二抗原结合位点与另一不同ErbB受体分子类型(例如ErbB2)的受体分子个体的第二不同表位结合。
“配体”或“受体配体”是指这样的天然或者合成的化合物，其可以和受体分子结合形成受体-配体复合物。术语配体包括激动剂、拮抗剂以及具有部分激动剂/拮抗剂活性的化合物。
“激动剂”或“受体激动剂”是指这样的天然或者合成的化合物，其和受体结合形成受体-激动剂复合物，激活所述受体或受体-激动剂复合物而启动信号通路及进一步的生物学过程。
“拮抗剂”或“受体拮抗剂”是指具有与激动剂相反的生物学效应的天然或者合成的化合物。拮抗剂和受体结合，通过和激动剂竞争受体而阻断受体激动剂的作用。拮抗剂是根据它阻断激动剂的作用的能力来定义的。受体拮抗剂也可以是抗体或是其具有免疫治疗活性的片段。下面将举出并论述本发明优选的拮抗剂。
“ErbB受体”是指属于(如上述)ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(ErbB1)，ErbB2，ErbB3和ErbB4受体以及此家族中有待于在将来进行鉴别的其他成员。ErbB受体一般含有一个可与ErbB配体结合的细胞外域；一个亲脂性的跨膜域；一个保守的细胞内酪氨酸激酶域；以及一个含有若干可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号域。ErbB受体可以是“天然序列的”ErbB受体或其“氨基酸序列变异体”。优选的ErbB受体是天然序列的人ErbB受体。ErbB1是指编码EGFR蛋白产物的基因。最优选的是EGF受体(EGFR，HER1)。“ErbB1”和“HER1”和“EGFR”的表达在本文可互换使用且均指人HER1蛋白。“ErbB2”和“HER2”在本文可互换使用且均指人HER2蛋白。本发明优选ErbB1受体(EGFR)。
“ErbB配体”是结合并且/或者激活ErbB受体的多肽。与EGFR结合的ErbB配体包括例如EGF，TGF-α，双调蛋白，β细胞调节素(betacellulin)，HB-EGF和表皮调节素(epiregulin)，优选EGF和TGF-α。
在本发明的上下文中，“ErbB受体结合域”是ErbB受体的局部区域(结合序列/环/袋)，该区域与天然配体或拮抗性或激动性药物结合。该区域不仅可以包含一种特异性结合位点或表位，还可以包含两种或多种表位或结合位点。该域内的一种特异性结合表位与一类拮抗性或激动性药物或配体结合。然而，不同药剂与相同受体类型的结合域内的或邻近结合域的不同表位结合被认为通常会通过抑制或活化作用导致独特且唯一的信号通路，所述信号通路对所述抗体是特有的。此外，应当指出本说明书和权利要求书中所使用的短语“结合域内”还包括紧邻相应天然配体的真实结合域的位置。
“ErbB结合表位或结合位点”是指ErbB受体的结合域内的或与结合域紧邻的氨基酸的构象和/或构型，所述结合域与配体或受体拮抗剂/激动剂结合。
“相同的ErbB/ErbB1受体分子”不一定意指同一受体分子，而是也包括相同类型的其它受体分子。优选，意指同一受体分子。
术语“ErbB受体拮抗剂/抑制剂”是指能结合并阻断或抑制ErbB受体的生物学上有效的分子。因此，通过阻断受体，拮抗剂阻止了ErbB配体(激动剂)的结合以及激动剂/配体受体复合物的活化。ErbB拮抗剂可针对HER1(ErbB1，EGFR)，HER2(ErbB2)和ErbB3和ErbB4。本发明优选的拮抗剂针对EGF受体(EGFR，HER1)。ErbB受体拮抗剂可以是抗体或抗体的免疫治疗活性片段或非免疫生物学分子，诸如肽、多肽蛋白。化学分子也包括在内，但是本发明优选的拮抗剂为抗EGFR抗体和抗HER2抗体。
本发明优选的抗体为抗HER1和抗Her2抗体，更优选抗HER1抗体。优选的抗HER1抗体为MAb425，优选人源化的MAb425(hMAb425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合MAb 225(CETUXIMAB)。最优选的是单克隆抗体h425，在单药物治疗中其已显示出高疗效和降低的不良反应和副反应。最优选的抗Her2抗体是Genentech/Roche上市的HERCEPTIN。
本发明的有效EGF受体拮抗剂还可以是天然或合成的化学化合物。此类优选分子的一些实例包括有机化合物、有机金属化合物、有机化合物和有机金属化合物的盐。化学HER2受体拮抗剂的实例有苯乙烯基取代的杂芳基化合物(US 5,656,655)；双单环和/或双环芳基杂芳基、碳环和杂碳环化合物(US 5,646,153)；三环的嘧啶化合物(US 5,679,683)；具有受体酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物(US 5,616,582)；杂芳基乙烯二基或杂芳基乙烯二基芳基化合物(US 5,196,446)；名称为6-(2，6-二氯代苯基)-2-(4-(2-二乙基-氨基乙氧基)苯基氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3)-5-嘧啶-7-酮的化合物(Panek，等，1997，J.Pharmacol.Exp.Therap.283，1433)，其可以抑制EGFR、PDGFR和FGFR受体家族。
根据本发明，术语“酪氨酸激酶拮抗剂/抑制剂”是指天然或者合成的能够抑制或阻断酪氨酸激酶(包括受体酪氨酸激酶)的药剂。因此，该术语实质上包括上述ErbB受体拮抗剂/抑制剂。除了上文和下文所提及的抗ErbB受体抗体以外，此定义下更优选的酪氨酸激酶拮抗剂是在单药物治疗中表现出对乳腺癌和前列腺癌有效的化学化合物。适宜的吲哚并咔唑型酪氨酸激酶抑制剂可利用如美国专利5,516,771；5,654,427；5,461,146；5,650,407等文献的信息获得。美国专利5,475,110；5,591,855；5,594,009和WO96/11933公开了吡咯并咔唑型酪氨酸激酶抑制剂和前列腺癌。文中最有希望的一种抗癌剂是gefitinib(IRESSA，Astra Zeneca)，其已被报道对患有非小细胞肺癌(NSCLC)以及晚期头颈癌的患者具有显著的治疗效果和良好的耐受性。
上面定义的化学性酪氨酸激酶抑制剂的优选剂量为每天1pg/kg体重到1g/kg体重。更优选地，酪氨酸激酶抑制剂的剂量为每天0.01mg/kg体重到100mg/kg体重。
根据本发明的生物分子优选是抗体或其片段或抗体的任何变体诸如免疫缀合物。
在本文中，术语“抗体”或“免疫球蛋白”有最广义的含义，特别包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体构成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要其显示出具有所需的生物学活性即可。此术语一般包括由2个或多个具有不同结合特异性的抗体或抗体片段连接在一起构成的杂合抗体。
根据抗体恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可被划分成不同的“抗体(免疫球蛋白)类型”。完整抗体有5个主要类型IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可以被进一步划分成“亚类”(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。相应于不同抗体类型的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。本发明优选的抗体主要类型是IgG，更具体的说是IgG1和IgG2。
抗体常常是分子量约150,000的糖蛋白，由2条同样的轻(L)链和2条同样的重(H)链组成。每条轻链都通过一个共价二硫键和重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间二硫键数目不同。每条重链和轻链还有规则间隔的链内二硫键。每条重链都在一端有一个可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链都在一端上有一个可变区(VL)，在另一端上有一个恒定区。轻链的恒定区和重链的第一个恒定区并列，轻链的可变区和重链的可变区并列。据信特定氨基酸残基构成轻链和重链可变区之间的介面。可将脊椎动物物种的抗体“轻链”基于其恒定区的氨基酸序列划分为2种明确不同的类型，即卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群中获得的抗体，即，除了可能的天然发生的突变(这些突变可能小量存在)以外，抗体群内的每一株抗体都是相同的。单克隆抗体具有高度的特异性，其针对单一的抗原位点。而且，和多克隆抗体制品不同，多克隆抗体包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，而每个单克隆抗体都仅针对抗原上的一个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越之处还在于可以合成无其他抗体污染的单克隆抗体。单克隆抗体的制备方法包括Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495)和“单克隆抗体技术，啮齿类和人类杂交瘤的制备和表征”(1985，Burdon等，Eds，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam)中描述的杂交瘤法，或者可以用众所周知的重组DNA方法进行制备(实例可参见US 4,816,567)。也可采用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其重链和/或轻链的一部分与来自特定物种的抗体或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，然而链的其余部分则与来自另一物种的抗体或属于另一抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，该术语还指此种抗体的片段，只要其具有所需的生物学活性即可(例如US 4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。生产嵌合型和人源化抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，制备嵌合抗体的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)(US 4,816,397；US 4,816,567)的专利中描述的方法。
“人源化抗体”是非人(如啮齿类)嵌合抗体形式的抗体，其含有最低量的源于非人免疫球蛋白的序列。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区(CDR)的残基被替换成非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)(供体抗体)的、具有所需的特异性、亲和性和性能的高变区残基。有时，人免疫球蛋白构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以含有受体抗体和供体抗体上均没有的残基。这些修饰可以进一步精细化抗体的性能。通常，人源化抗体含有基本上所有的可变区(至少一个，典型地两个可变区)，其中所有或基本上所有的高变环都对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而所有或基本上所有的FR都具有人免疫球蛋白序列。人源化抗体也可任选地含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型的是人免疫球蛋白的恒定区。人源化抗体的制备方法描述在例如Winter，US 5,225,539和Boss(Celltech，US 4,816,397)中。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包含抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv和Fc片段，双抗体(diabody)，线性抗体，单链抗体分子；以及由抗体片段构成的多特异性抗体。”完整”抗体是指包含结合抗原的可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的抗体。
优选地，完整抗体具有一个或多个效应子功能。木瓜蛋白酶消化抗体产生2个相同抗原结合片段(称之为“Fab”片段，每个片段含有一个抗原结合位点和一个CL区和一个CH1区)以及一个残余的“Fc”片段(其名称反映了其易于结晶的能力)。
抗体的“Fc”区一般含有CH2，CH3和IgG1或IgG2抗体主要类型的铰链区。铰链区是具有约15个氨基酸残基的基团，其把CH1区和CH2-CH3区结合起来。
胃蛋白酶处理产生一个“F(ab′)2”片段，其含有2个抗原结合位点并仍具有交联抗原的能力。
“Fv”是最小的抗体片段，其含有一个完整的抗原识别和抗原结合位点。此区域由一个重链可变区和一个轻链可变区通过紧密的非共价连接形成的二聚体组成。在此构型中每个可变区的3个高变区(CDR)相互作用在VH-VL二聚体表面上确定出一个抗原结合位点。总的说来，6个高变区赋予了抗体的抗原结合特异性。但是，甚至仅一个可变区(或仅含有3个抗原特异性高变区的一半Fv)也有识别并结合抗原的能力，虽然其比完整的结合位点的亲合力低。
“Fab”片段还包括轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)且仅具有一个抗原结合位点。“Fab′”片段和Fab片段的不同之处在于在重链CH1区的羧基端多了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。
F(ab′)2抗体片段最初以Fab′片段对的形式产生，这两个Fab′片段之间有半胱氨酸铰链。抗体片段的其它化学偶联也是已知的(例如参见Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996；US4,342,566)。
“单链Fv′”或“scFv”抗体片段包含抗体的V，和V，区，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其可使scFv形成抗原结合所需的结构。单链FV抗体也可从例如Plückthun(The Pharmacology Of Monoconal Antibodies，Vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994))，WO93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)获知。
术语“可变”或“FR”是指如下事实，即抗体与抗体之间在可变区的某些部分具有十分不同的序列，这些部分用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，此可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变区。其集中在轻链和重链可变区的三个称为高变区的区段中。可变区的较高保守部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区每一个都包含四个FR(FR1-FR4)，其主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，高变区形成环连接β-折叠结构，且有时形成β-折叠结构的一部分。每条链的高变区通过FR紧邻地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences Of Proteins Of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes Of Health，Bethesda，MD.(1991)。虽然恒定区不直接参与抗体和抗原的结合，但其显示出多种效应子功能，如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本文所用的术语“高变区”或“CDR”是指负责与抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的24-34位(L1)，50-56位(L2)和89-97位(L3)残基，重链可变区的31-35位(H1)，50-65位(H2)和95-102位(H3)残基)；和/或“高变环”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的26-32位(L1)，50-52位(L2)和91-96位(L3)残基，重链可变区的26-32位(H1)，53-55位(H2)和96-101位(H3)残基；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基是指除本处定义的高变区残基以外的那些可变区残基。
术语“单特异性”是指根据本发明的抗体，其中抗体的两个结合位点具有相同的特异性，由此，能够结合受体上的相同表位。优选地，根据本发明，药物组合物包含单特异性抗体。
“双特异性抗体(BAb)”是单个、双价的抗体(或其免疫治疗活性片段)，其含有2个不同特异性的抗原结合位点。根据本发明，BAbs的特征在于BAb<MAb1，MAb2>，其中<MAb1>和<MAb2>命名源于MAb1和MAb2的抗原结合位点。例如，第一抗原结合位点针对血管生成受体(例如整联蛋白或VEGF受体)，而第二抗原结合位点针对ErbB受体(例如EGFR或HER2)。双特异性抗体可用化学方法(例如参见Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5807)或“polydoma”技术(参见US4,474,893)或重组DNA技术制备，所有这些技术均为实质上已知的技术。其他方法在WO 91/00360，WO 92/05793和WO 96/04305中有描述。双特异性抗体还可用单链抗体来制备(例如参见Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。这些是以单条多肽链形式产生的抗体可变区类似物。为了构成双特异性结合剂，单链抗体可以通过本领域内技术人员熟知的化学方法或遗传工程方法偶联在一起。本发明的双特异性抗体也可以用亮氨酸拉链序列来制备。所用序列可来自于转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链区(Landschulz等，1988，Science 240，1759；综述见，Maniatis和Abel，1989，Nature 341，24)。亮氨酸拉链是约20-40个残基长的特殊氨基酸序列，典型地每7个残基就有一个亮氨酸。此拉链序列形成两亲性α-螺旋，亮氨酸残基在疏水侧上排成一线以便形成二聚体。与Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链相应的肽优先地形成异二聚体(O′Shea等，1989，Science 245，646)。含有拉链的双特异性抗体及其制备方法在WO 92/10209和WO 93/11162中也有公开。
术语“融合蛋白”是指由上述一种或多种生物分子组成的天然或合成分子，其中具有不同特异性的两种或多种基于肽或蛋白质(包括糖蛋白)的分子任选地通过化学或基于氨基酸的接头分子融合在一起。该连接可通过C-N融合或N-C融合(以5′→3′方向)，优选C-N融合而实现。
然而，根据本发明优选的融合蛋白质是如下述的免疫缀合物。
术语“免疫缀合物”指融合蛋白，其意义是通过共价键与非免疫学效应分子融合在一起的抗体或免疫球蛋白或其免疫学活性片段。此融合伙伴(partner)优选为可被糖基化的肽或蛋白质。所述非抗体分子可以连接到抗体重链恒定区的C末端或连接到轻链和/或重链可变区的N末端。此融合伙伴可以通过接头分子连接，一般这种接头分子是含3-15个氨基酸残基的肽。本发明的免疫缀合物是由针对ErbB受体的免疫球蛋白或其有免疫治疗效果的片段和优选地细胞因子，诸如TNFα、IFNγ或IL-2，或其它毒性剂组成的融合蛋白。优选地，这些基于肽或蛋白质的分子通过其N末端与所述免疫球蛋白的C末端(即，其Fc部分)相连。
“杂合抗体”是基本上由常规地通过化学交联剂融合在一起的两个或两个以上抗体或抗体结合片段组成的融合蛋白，其中所述抗体每个都具有不同的结合特异性。杂合抗体可以通过将两个或多个抗体或抗体片段缀合在一起而制备。
优选的杂合抗体由交联的Fab/Fab′片段组成。很多偶联或交联试剂可用于抗体的缀合。例如蛋白A，碳二亚胺，N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸酯(SPDP)(例如参见Karpovsky等(1984)J.EXP.Med.160，1686；Liu等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，8648)。其他的方法还有Paulus，BehringInst.Mitt.，No.78，118(1985)；Brennan等(1985)Science 30，81或Glennie等(1987)J.Immunol.139，2367描述的方法。另一种方法使用邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)将三个Fab′片段偶联在一起(WO 91/03493)。
本发明中多特异性抗体也是适用的，并可例如按照WO 94/13804和WO 98/50431的教导进行制备。本发明优选的杂合抗体是包含如所述连接在一起的两种抗EGFR抗体(每个抗体各针对相同受体的不同表位)的融合蛋白(例如MAB 425-MAB 225)。
术语“细胞因子”是对由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这类细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子以及传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素，N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGFβ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGFα和TGFβ；红细胞生成素(EPO)；干扰素如IFNα，IFNβ和IFNγ；集落刺激因子如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素如IL-1，IL-1a，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；和TNFα或TNFβ。本发明优选的细胞因子为干扰素和TNFα和IL-2。
抗体“效应子功能”是指抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括补体依赖的细胞毒性，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，吞噬作用；细胞表面受体(如B细胞受体)的下调等。
术语“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用)是指这样一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞——NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞可表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。为估计目的分子的ADCC活性，可利用例如现有技术(US 5,500,362；US 5,821,337)中描述的体外ADCC实验来进行。此实验中有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)并包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。对FcR的综述可参见例如，Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991)。
作为一个具体的实施方案，本发明的治疗方法包括其它治疗上有效的药剂的施用，该其它药剂能辅助所需效应，例如肿瘤毒性或细胞抑制功效，或减少或防止不需要的副作用。因此，本发明包括所述药剂与上文和下文所述和定义的药物组合物的联合，其中所述药剂通常可以是其它ErbB受体拮抗剂、VEGF受体拮抗剂、细胞因子、细胞因子免疫缀合物、抗血管生成剂、抗激素剂、或细胞毒性剂。本发明的一个目的还在于根据已知方法使本文所述的组合物与放射治疗联合。
本文中所使用的术语“细胞毒性剂”具有非常广泛的定义，其是指这样的物质，该物质能抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏(细胞死亡)和/或产生抗瘤形成的/抗增生的作用，例如，直接或间接阻止瘤性肿瘤细胞的进展、成熟或扩散。该术语表达性地也包括这样的药剂，其仅导致细胞抑制作用而无纯粹的细胞毒性作用。该术语包括下面详细描述的化疗剂，以及其它ErbB拮抗剂(诸如抗ErbB抗体)，抗血管生成剂，酪氨酸激酶抑制剂，蛋白激酶A抑制剂，细胞因子家族成员，放射性同位素，和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素。
术语“化疗剂”是术语“细胞毒性剂”的子集，其具体指具有抗肿瘤效果、优选直接作用于肿瘤细胞上、和较少地间接经过诸如生物反应修饰等机制起作用的化学药剂。本发明适宜的化疗剂优选为天然或合成的化学化合物。大量的现有处于商业使用、临床评价和临床前研发阶段的抗瘤形成化疗剂都可包括在本发明内，用于通过与本发明描述的受体拮抗剂相联合来治疗肿瘤/瘤形成。应当指出化疗剂可任选地与本发明的所述ErbB受体拮抗剂，优选所述抗EGFR抗体一起施用。
化疗剂的实例包括烷化剂，如氮芥，吖丙啶化合物，烷基磺酸酯以及其他具有烷基化作用的化合物如亚硝基脲，顺铂和达卡巴嗪；抗代谢物如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂如长春花生物碱和鬼臼毒素衍生物；细胞毒性抗生素和喜树碱衍生物。
优选的化疗剂是氨磷汀(ethyol)，顺铂，达卡巴嗪(DTIC)，放线菌素D，氮芥，链脲霉素，环磷酰胺，carrnustine(BCNU)，环己亚硝脲(CCNU)，阿霉素，阿霉素微脂体(doxil)，吉西他滨(gemzar)，柔红霉素，柔红霉素微脂体(daunoxome)，甲基苄肼，丝裂霉素，阿糖胞苷，足叶乙甙，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)，长春花碱，长春新碱，博来霉素，紫杉醇(taxol)，泰索帝(taxotere)，阿地白介素(aldesleukin)，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，克拉立平，喜树碱，CPT-11，10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)，gefitinib(Iressa)、达卡巴嗪，氟尿苷，氟达拉滨，羟基脲，异环磷酰胺，伊达比星，巯乙磺酸钠，干扰素α，干扰素β，伊立替康(irinotecan)，米托蒽醌，托泊替堪，亮丙瑞林，甲地孕酮，抗瘤氨酸，巯嘌呤，普卡霉素(plicamycin)，氯苯二氯乙烷，天冬酰胺酶(pegaspargase)，喷司他丁(pentostatin)，哌酰溴烷，普卡霉素，链脲霉素，他莫西芬，替尼泊甙，睾内酯，硫鸟嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，维诺利宾，苯丁酸氮芥及其组合。
本发明最优选的化疗剂是顺铂，吉西他滨，阿霉素，紫杉醇(taxol)和博来霉素。
抗血管生成剂”指的是天然的或合成的化合物，它可在一定程度上阻断或干扰血管的发生。抗血管生成分子可以是，例如，和生血管生长因子或生长因子受体结合并将其阻断的生物分子。本处优选的抗血管生成分子可以与受体结合，优选与整联蛋白受体或与VEGF受体结合。本发明中此术语还包括所述抗血管生成剂的前体药物。该术语还包括具有所述效果并也可被分类为细胞毒性剂，优选地化疗剂的药剂。
有很多结构和来源不同的分子都可以引起抗血管生成性质。本发明中适宜的血管生成抑制剂或阻断剂的大多数相关类型是，例如(i)抗有丝分裂剂，例如氟尿嘧啶，丝裂霉素C，紫杉醇；(ii)雌激素代谢物如2-甲氧基雌二醇；(iii)抑制锌金属蛋白酶的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如，betimastat，BB16，TIMPs，二甲胺四环素，GM6001，或在“基质金属蛋白酶的抑制治疗应用”中论及的那些(物质)(Golub，Annals of the New YorkAcademy of Science，Vol.878a；Greenwald，Zucker(Eds.)，1999)；(iv)抗血管生成的多功能药剂和因子，如IFNα(US 4,530,901；US4,503,035；5,231,176)；制管张素和纤溶酶原片段(例如kringle1-4，kringle5，kringle 1-3(O′Reilly，M.S.等，Cell(Cambridge，Mass.)79(2)315-328，1994；Cao等，J.Biol.Chem.27129461-29467，1996；Cao等，J.BiolChem 27222924-22928，1997)；内皮生长抑素(endostatin)(O′Reilly，M.S.等，Cell 88(2)，277，1997和WO 97/15666)，血小板反应蛋白(TSP-1；Frazier，1991，Curr Opin Cell Biol 3(5)792)；血小板因子4(PF4)；(v)纤溶酶原激活物/尿激酶抑制剂；(vi)尿激酶受体拮抗剂；(vii)肝素酶；(viii)烟曲霉素类似物如TNP-470；(ix)酪氨酸激酶抑制剂如SU 10(上面和下面提到的很多ErbB受体拮抗剂(EGFR/Her 2拮抗剂)也是酪氨酸激酶抑制剂，因此其分别可以显示出抗EGF受体阻断活性从而导致肿瘤生长受抑制，及显示出抗血管生成的活性从而导致血管发育和内皮细胞发育受抑制)；(x)苏拉明和苏拉明类似物；(xi)制管张性(angiostatic)类固醇；(xii)VEGF和bFGF拮抗剂；
(xiii)VEGF受体拮抗剂如抗VEGF受体抗体(DC-101)；(xiv)flk-1和flt-1拮抗剂；(xv)环加氧酶-II抑制剂如COX-II；(xvi)整联蛋白拮抗剂和整联蛋白受体拮抗剂如αv拮抗剂和αv受体拮抗剂，例如，抗αv受体抗体和RGD肽。本发明优选整联蛋白(受体)拮抗剂。
术语“整联蛋白拮抗剂/抑制剂”或“整联蛋白受体拮抗剂/抑制剂”是指天然或者合成的分子，其阻断并抑制整联蛋白受体。有时，此术语包括针对所述整联蛋白受体的配体(例如对于αvβ3玻连蛋白，纤维蛋白，纤维蛋白原，冯·维勒布兰德因子，血小板反应蛋白，层粘连蛋白；对于αvβ5玻连蛋白；对于αvβ1纤连蛋白和玻连蛋白；对于αvβ6纤连蛋白)的拮抗剂。
本发明优选针对整联蛋白受体的拮抗剂。整联蛋白(受体)拮抗剂可以是天然或合成的肽，非肽，肽模拟物(pepetidomimetica)，免疫球蛋白例如抗体或抗体的功能性片段，或免疫缀合物(融合蛋白)。
本发明优选的整联蛋白抑制剂为针对αv整联蛋白受体(例如，αvβ3，αvβ5，αvβ6和亚类)的抑制剂。优选的整联蛋白抑制剂为αv拮抗剂，尤其是αvβ3拮抗剂。本发明优选的αv拮抗剂是RGD肽，肽模拟物(非肽)拮抗剂和抗整联蛋白受体抗体如阻断αv受体的抗体。示例性非免疫学的αvβ3拮抗剂在US 5,753,230和US 5,766,591中有教导。优选的拮抗剂为含RGD的线性和环型肽。环肽通常更稳定且在血清中的半衰期更长。然而，本发明最优选的整联蛋白拮抗剂是环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(EMD121974，Cilengitide，Merck KgaA，德国；EP 0770622)，其可有效地阻断整联蛋白受体αvβ3、αvβ1、αvβ6、αvβ8、αпbβ3。
科技文献和专利文献中均描述过αvβ3/αvβ5/αvβ6整联蛋白受体的适宜肽类拮抗剂及肽模拟(非肽)拮抗剂。例如，可参见Hoekstra和Poulter，1998，Curr.Med.Chem.5，195；WO 95/32710；WO 95/37655；WO97/01540；WO 97/37655；WO 97/45137；WO 97/41844；WO 98/08840；WO 98/18460；WO 98/18461；WO 98/25892；WO 98/31359；WO 98/30542；WO 99/15506；WO 99/15507；WO 99/31061；WO 00/06169；EP 0853084；EP 0854140；EP 0854145；US 5,780,426；和US 6,048,86。公开了也适用于本发明的苯并氮杂唑及相关的苯并二氮杂唑和苯并环庚烯αvβ3整联蛋白受体拮抗剂的专利包括WO 96/00574，WO 96/00730，WO 96/06087，WO96/26190，WO 97/24119，WO 97/24122，WO 97/24124，WO 98/15278，WO 99/05107，WO 99/06049，WO 99/15170，WO 99/15178，WO 97/34865，WO 97/01540，WO 98/30542，WO 99/11626和WO 99/15508。在WO98/08840；WO 99/30709；WO 99/30713；WO 99/31099；WO 00/09503；US 5,919,792；US 5,925,655；US 5,981,546；和US 6,017,926中描述了具有主链构象环约束特征的其他整联蛋白受体拮抗剂。在US 6,048,861和WO00/72801中公开了一系列的壬酸衍生物，它们是有效的αvβ3整联蛋白受体拮抗剂。WO 00/38665中公开了其他化学小分子整联蛋白拮抗剂(多数为玻连蛋白拮抗剂)。其它αvβ3受体拮抗剂已被证实可有效地抑制血管生成。例如，合成的受体拮抗剂如(S)-10，11-二氢-3-[3-(吡啶-2-基氨基)-1-丙氧基]-5H-二苯并[a，d1环庚烯-10-乙酸(命名为SB-265123)已经在很多哺乳动物模型系统中实验过。(Keenan等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.8(22)，3171；Ward等，1999，Drug Metab.Dispos.27(11)，1232)。适用作拮抗剂的整联蛋白拮抗剂的甄选实验在如Smith等，1990，J.Biol.Chem.265，12267中以及参考专利文献中有描述。
抗整联蛋白受体的抗体也是众所周知的。可对适宜的抗整联蛋白(如αvβ3，αvβ5，αvβ6)的单克隆抗体进行修饰，以包括其抗原结合片段(包括F(ab)2，Fab和工程化的Fv或单链抗体)。针对整联蛋白受体αvβ3的一个合适的且优选使用的单克隆抗体被鉴定为LM609(Brooks等，1994，Cell79，1157；ATCC HB 9537)。在WO 97/45447中公开了一个强特异性抗αvβ5抗体，P1 F6，其也优选用于本发明。另一合适的αvβ6选择性抗体是选择性针对整联蛋白受体的αv链的Mab 14D9.F8(WO 99/37683，DSMACC2331，Merck KGaA，德国)以及MAb 17.E6(EP 0719 859，DSMACC2160，Merck KGaA)。另一个适宜的抗整联蛋白抗体是已上市的Vitraxin。
如此处所用的，术语“抗激素剂”包括天然或合成的有机或肽化合物，其作用是调节或抑制激素对肿瘤的作用。更具体地来说，“抗激素剂”(1)抑制血清雄激素的产生，(2)阻断血清雄激素与雄激素受体的结合，或者(3)抑制睾酮转化为DHT，或两种或多种此类化合物的联合。本发明的抗激素剂一般包括类固醇受体拮抗剂，更具体来说抗雌激素剂，如包括他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，氢萘吡苯酮，keoxifene，LY117018，奥那斯酮和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素剂，如氟他胺(flutamide)，尼鲁他胺(nilutamide)，比卡鲁胺，亮丙瑞林(leuprolide)和性瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。该术语还包括糖蛋白激素-如促卵泡成熟激素(FSH)，促甲状腺素(TSH)和黄体生成素(LH)和LHRH(黄体生成激素释放激素)的激动剂和/或拮抗剂。可用于本发明的LHRH激动剂是醋酸性瑞林，其商品名称为ZOLADEX(Zeneca)。适用的LHRH拮抗剂的另一实例是醋酸环丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮，其商品为MEGACE(Bristol-Myers，Oncology)。类固醇抗雄激素剂可阻断前列腺雄激素受体。其还可抑制LH的释放。优选给人类患者施用的CPA剂量为100mg/天-250mg/天。非类固醇抗雄激素剂阻断雄激素受体。它们也可引起血清LH水平和血清睾酮水平的增加。优选的非类固醇抗雄激素剂是氟他胺(2-甲基-N-[4-20硝基-3-(三氟甲基)苯基丙酰胺]，其商品名为EULEXIN(Schering Corp.)。氟他胺发挥的是抗雄激素作用，其抑制雄激素摄取，抑制靶组织中雄激素的核结合或两者兼而有之。另一个非类固醇抗雄激素剂是尼鲁他胺，其化学名称为5，5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4’-硝基苯基)-4，4-二甲基-咪唑烷-二酮。在本发明的一些实施方案中，抗激素剂是LHRH激动剂如醋酸亮丙瑞林和抗雄激素剂如氟他胺或尼鲁他胺的联合。如，可通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射施用醋酸亮丙瑞林，并同时可以口服氟他胺。本发明的抗激素剂包括，如上述，类固醇/甲状腺激素受体的拮抗剂，其中包括其它非许可(non-permissive)的受体-如RAR，TR，VDR等的拮抗剂。本领域技术人员可很容易地理解，多种合成的和天然的视黄酸受体(RAR)拮抗剂可根据本发明使用。
根据本发明的双特异性抗体可与其它药物联合。这些药物优选选自·酪氨酸激酶抑制剂，诸如Iressa；·抗血管生成剂，优选整联蛋白抑制剂，更优选RGD肽，包括环肽，诸如环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(Cilengitide，Merck KGaA)；·抗VEGF受体抗体，诸如DC-101，或VEGF拮抗剂；·COX-II抑制剂；·细胞因子，诸如TNF-α，IFN-α，IFN-B，IFN-γ，IL-2；·I型蛋白激酶A(PKAI)抑制剂，诸如混合的主链反义寡核苷酸，如HYB 165(参见，例如，Tortora等，1999，Clin.Cancer Res.，875-881)；·抗激素剂，诸如性瑞林，boserelin，亮丙瑞林，他莫昔芬。
术语“癌”和“肿瘤”是指或描述的是典型特征为无调控细胞生长的哺乳动物生理疾病。通过施用本发明的药物组合物可以治疗肿瘤，诸如乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾，肾，膀胱，头颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，子宫颈和肝的肿瘤。更具体地，肿瘤选自腺瘤，血管肉瘤，星形细胞瘤，上皮癌，生殖细胞瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质瘤，错构瘤，血管内皮瘤，血管肉瘤，血肿，肝胚细胞瘤，白血病，淋巴瘤，成神经管细胞瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，骨肉瘤，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，肉瘤和畸胎瘤。详细而言，肿瘤选自肢端色斑样黑素瘤，光化性角化病，腺癌，囊腺癌，腺瘤，腺肉瘤，腺鳞癌，星形细胞瘤，前庭大腺癌，基底细胞癌，支气管腺癌，毛细血管瘤、癌、癌肉瘤，海绵状胆管癌，软骨肉瘤，脉络丝乳头状瘤/癌，透明细胞癌，囊腺瘤，内胚窦瘤，子宫内膜增生，子宫内膜间质肉瘤，子宫内膜腺癌，室管膜肉瘤，上皮样肉瘤，尤因肉瘤，纤维板层样癌，局灶性结节性增生，胃泌素瘤，生殖细胞瘤，成神经胶质细胞瘤，胰升糖素瘤，成血管细胞瘤，血管内皮瘤，血管瘤，肝腺瘤，肝腺瘤病，肝细胞癌，胰岛素瘤，上皮内瘤形成，上皮间鳞状细胞癌，侵袭性鳞状细胞癌，大细胞癌，平滑肌肉瘤，恶性着色斑型黑素瘤，恶性黑素瘤，恶性间皮瘤，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，脑膜肿瘤，间皮肿瘤，转移性肿瘤，粘液上皮癌，成神经细胞瘤，神经上皮腺癌，结节性黑色素瘤，燕麦细胞癌，少突神经胶质瘤，骨肉瘤，胰腺多肽，乳头状浆液性腺癌，松果体细胞瘤，垂体瘤，浆细胞瘤，假肉瘤，肺母细胞瘤，肾细胞瘤，成视网膜细胞癌，横纹肌肉瘤，肉瘤，浆液性癌，小细胞癌，软组织癌，抑生长素分泌细胞肿瘤，鳞癌，鳞状细胞癌，间皮下、表浅蔓延型黑素瘤，未分化的癌，眼色素层黑色素瘤，疣状癌，血管活性肠多肽瘤，充分分化的癌，和肾母细胞瘤。
优选可用根据本发明的抗体分子治疗的肿瘤是大量表达ErbB受体，尤其是ErbB 1受体的实体肿瘤或肿瘤转移，诸如乳癌，前列腺癌，头颈癌，SCLC，胰腺癌。
术语“生物学上/功能上有效的”或“治疗上有效的(量)”是指这样的药物/分子，其能导致体内或体外的生物学功能或生物学功能的改变，以及在哺乳动物，优选在人类中能以特定量有效治疗疾病或病症。对癌症而言，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；降低肿瘤的大小；抑制(即，一定程度地减缓并优选终止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，一定程度地减缓并优选终止)肿瘤的转移；在一定程度上抑制肿瘤的生长；和/或一定程度上减轻癌症相关的一种或多种症状。如果药物可以阻止已存在癌细胞的生长且/或杀死已存在的癌细胞，则该药物可能具有细胞抑制性和/或细胞毒性。对于癌症的治疗，疗效可以例如通过估计疾病进展时间(TTP)和/或测定反应率(RR)来确定。
术语“免疫治疗上有效的”是指引起哺乳动物免疫反应的生物分子。更具体地，此术语是指可以识别和结合抗原的分子。典型地，抗体、含有其抗原结合位点(互补决定区，CDRs)的抗体片断和抗体融合蛋白是免疫治疗上有效的。
“放射性疗法”根据本发明，肿瘤还可以利用放射线或放射药物进行治疗。放射源既可以位于要治疗的患者体外也可以位于体内。如果放射源位于患者体外，该治疗方法称作体外照射放疗(EBRT)。如果放射源可以位于患者体内，此治疗称为近距放射疗法(BT)。已经使用的一些典型的放射性原子包括镭，铯-137，和铱-192，镅-241和金-198，钴-57；铜-67；锝-99；碘-123；碘-131；以及铟-111。也可以用放射性同位素标记本发明药剂。当前放射性疗法是控制不能切除的或不宜手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗方法。已经发现联合放射性疗法和化疗可提高疗效。放射性疗法依据的原理是投射到靶区的高剂量辐射将导致肿瘤和正常组织中的增殖细胞的死亡。辐射剂量方案一般根据辐射吸收剂量(rad)，时间和分段进行确定，并且必须由肿瘤专家进行仔细确定。患者接受的辐射量将取决于各种因素，但两个最重要的因素是肿瘤相对身体其它重要结构或器官的位置，以及肿瘤扩散的程度。对患者实施放射性疗法的一个优选治疗方案是疗程持续5-6个星期，将50-60Gy总剂量按照每星期5天每天1次1.8-2.0Gy的剂量给患者分段施用。Gy是戈瑞的缩写，是指100rad剂量。如果在放射疗法背景下用本发明所述的抗ErbB抗体治疗肿瘤，通常可观察到积极的甚至是协同的作用。换句话说，所述化合物如果与放射和/或化疗剂组合，则对肿瘤生长的抑制作用将增强。根据本发明可任选地使用放射治疗。其在不能对患者施用有效量的根据本发明的药剂的情况下是推荐和优选的。
“药物治疗”就步骤而言，本发明的方法包括多种实施形式。比如，本发明的药剂可以同时地，相继地或独立地使用。另外，药剂可分开施用且两次施用间隔在约3周以内，即第二种药剂在第一种活性剂施用后基本上立即开始施用到第一种药剂施用后不超过约3周的时间开始施用。本方法可在手术之后进行。或者，手术可在施用第一种活性药剂和施用第二种活性药剂之间的间隔期内进行。此方法的实例是将本发明方法和外科肿瘤摘除手术联合应用。根据本发明方法的治疗典型地包括以一个或多个施用周期施用本治疗组合物。例如，当进行同时施用的时侯，含有2种药剂的治疗组合物在一个周期内持继施用大约2天到约3周。此后，治疗周期可根据执业医生的判断按需要进行重复。类似地，如果进行相继施用，则每种治疗剂施用的时间可调整到典型地覆盖同样的时间。两周期之间的间隔可从约0到2个月不等。
本发明的药剂可通过注射或随时间逐渐输注而经肠胃外施用。体内待治疗的组织用全身施用的方法一般就可进行治疗，因此最经常使用的方法是静脉内给予治疗组合物，但是当目标组织可能含有靶分子的时候，其他组织和施用方法也是可考虑的。因此，本发明的药剂可经眼内，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，腔内，经皮，通过常位注射和输注施用，而且还可以通过蠕动泵方式施用。例如，包括如整联蛋白拮抗剂的本发明治疗组合物通常通过静脉方式，例如以单位剂量注射施用。
本发明的治疗组合物包含生理学可耐受的载体和溶解或分散于其中的作为活性成分的此处描述的相关药剂。
如此处所使用的，术语“药学上可接受的”指代表如下物质的组合物、载体、稀释剂和试剂，所述物质能施用于哺乳动物而不会产生不期望的生理效应如恶心，眩晕，反胃等。其中溶解或分散了活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员所熟知的，故无须在制剂的基础上进行限定。典型地，这种组合物可制成注射剂如液体溶液或悬液，但是，也可制成适于在使用前在液体中形成溶液或混悬液的固体形式。制剂也可进行乳化。可将活性成分和其量适用于此处描述的治疗方法的药学上可接受的并与活性成分兼容的赋形剂混合。
适当的赋形剂是，例如，水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等以及这些的组合。另外，如果需要的话，组合物还可以包括小量的可增加活性成分效用的辅助物质如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂等。本发明治疗组合物中可包括所述成分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(和多肽的游离氨基基团成盐)，所述酸是无机酸，例如，盐酸或磷酸，或如乙酸，酒石酸，苦杏仁酸等有机酸。也可从无机碱，例如，钠，钾，铵，钙或铁的氢氧化物，以及有机碱如异丙胺，三甲基胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等，得到与游离羧基基团形成的盐。在环肽αv拮抗剂制剂中特别优选使用HCl盐。生理学上可耐受的载体是本领域的技术人员所熟知的。液相载体的例子为无菌水性溶液，其可以仅含有活性组分和水或可以还含有缓冲剂例如在生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，如磷酸缓冲盐水。
此外，含水载体可以含有一种以上的缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾等盐，葡萄糖，聚乙二醇和其他溶质。液体组合物也可含有有水或无水的液相。这类其他液相的例子有甘油，植物油如棉籽油和水油乳液。
典型地，例如，对于形式为ErbB(ErbB1)受体阻断双特异性抗体、整联蛋白受体阻断抗体或抗体片段或抗体缀合物或抗VEGF受体阻断抗体、片断或缀合物的免疫治疗剂，治疗有效量是在生理可耐受的组合物中施用时，足以使血浆浓度达到约0.01微克(μg)每毫升(ml)至约100μg/ml，优选约1μg/ml至约5μg/ml，通常约5μg/ml的量。换言之，在一日或多日的每日一次或多次的施用中，剂量可在约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选约0.5mg/kg至约20mg/kg之间变化。当免疫治疗剂是单克隆抗体的片段或缀合物形式时，其用量可很容易地根据片段/缀合物的质量相对于整个抗体的质量的比例进行调整。优选的血浆摩尔浓度为约2微摩尔(μM)至约5毫摩尔(mM)，优选约100μM至1mM抗体拮抗剂。
对于属于非免疫治疗性肽或蛋白质多肽或其他类似大小的生物分子的本发明药剂，其治疗有效的量典型地为这样的多肽量，即在生理可耐受的组合物中施用时足以使血浆浓度达到约0.1微克(μg)每毫升(ml)至约200μg/ml，优选约1μg/ml至约150μg/ml的量。根据每摩尔有约500克质量的多肽来计算，优选的血浆摩尔浓度为约2微摩尔(μM)到约5毫摩尔(mM)，优选约100μM至1mM多肽拮抗剂。
对于优选为本发明的化学细胞毒性剂或化疗剂(既不是免疫治疗剂，也不是非免疫治疗性肽/蛋白)的活性剂，其典型剂量为每公斤体重每天10mg至1000mg，优选约20至200mg，更优选的是50至100mg。
本发明的“药物组合物”可包含能降低或避免伴随本发明联合疗法出现的副反应的药剂(“辅助疗法”)，其包括但不限于，如降低抗癌药物毒性作用的药剂，例如骨重吸收抑制剂，心脏保护药物。所述的辅助药剂可以防止或降低化疗，放射治疗或手术带来的恶心和呕吐的发生率，或降低施用骨髓抑制性抗癌药物带来的感染机率。辅助药剂是本领域内的技术人员所熟知的。此外，本发明的免疫治疗剂还可以和佐剂如BCG及免疫系统刺激剂一起使用。而且，组合物可包括含有具有细胞毒性作用的放射性标记同位素或其他细胞毒性剂如细胞毒性肽(例如细胞因子)或细胞毒性药物等的免疫治疗剂或化疗剂。
术语用于治疗肿瘤或肿瘤转移的“药物试剂盒”，是指一种包装以及通常地，药剂在肿瘤和肿瘤转移治疗方法中的使用说明书。本发明试剂盒中的药剂一般被配制成本处所描述的治疗组合物，因此可以采用任何适于试剂盒内放置的形式。这些形式可以包括液体，粉末，片剂，混悬液等制剂，以便提供本发明的治疗分子，优选抗-ErbB1抗体。这些药剂可以在适合于根据本发明方法单独施用的各单独容器中提供，或可以在此包装中的单一容器内结合在组合物中提供。包装中可含有足以按照此处描述的治疗方法施用一次或多次的药剂量。本发明试剂盒还包括包装中所含材料的“使用说明”。
实施例实施例1制备MAB 425和MAB 225的F(AB′)2-片段采用限制性蛋白水解将抗EGFR抗体人源化MAb 425和嵌合MAb225转化为F(ab′)2片段。对每个抗体都必须对F(ab′)2抗体的生成进行优化。用于该制备的一般方案如下。
胃蛋白酶裂解对两个抗体均为最佳的，然而木瓜蛋白酶裂解也是适用的。从蛋白A琼脂糖柱上除去残留的完整抗体和Fc片段。F(ab′)2片段的产率接近100％。可将F(ab′)2片段保存于-20℃，在长时间内不丧失任何活性。
一般方案生长发酵→离心→超滤→蛋白A层析→透析/超滤→裂解→蛋白A层析→透析/超滤→F(ab’)2产物详细内容PBS，pH7.4蛋白质含量5.06mg/ml(Pierce)。
试剂二水合枸橼酸三钠，枸橼酸，三(羟甲基)氨基甲烷，胃蛋白酶，甘氨酸，氯化钠缓冲液0.1M枸橼酸钠缓冲液pH3.5，10mg/mL胃蛋白酶，于枸橼酸钠缓冲液pH3.5中，1M Tris pH111.5M甘氨酸+3M NaCI pH8.90.1M枸橼酸pH2.5胃蛋白酶消化过程通过在0.1M枸橼酸钠，pH3.5中对MAb透析过夜调整pH和缓冲液条件。将胃蛋白酶以1∶33w/w的比例加入透析过的免疫球蛋白中。
在37℃下，于水浴中持续搅拌混合物。75分钟后，加入7ml 1M Tris液终止消化。在该步骤中，反应的pH应设定为大约8.5。然后将该混合物转至蛋白A柱以便除去残留的IgG和/或Fc片段。
蛋白-A-琼脂糖将胃蛋白酶消化物加入已平衡的蛋白-A-琼脂糖柱，用平衡缓冲液洗涤直至层析谱返回基线。收集直流级分，在Amicon室(Membrane YM 30)中将体积缩小，然后用PBS pH7.4进行透析。用0.1M枸橼酸pH2.5从蛋白-A-琼脂糖柱上洗脱潜在的污染物诸如Fc片段或未修饰的抗体。
层析条件柱床大小5cm×2.5cm。预计1ml蛋白A琼脂糖能结合10mgIgG，用1.5M甘氨酸+3M NaCl，pH8.9平衡柱，流速60ml/h，检测OD 280nm，0.2/2.0Abs-Range，Uvicord S I1，纪录纸速0.1mm/min，每一级分收集5ml。
F(ab′)2制品(Pierce)的产率考虑到Fc-部分大概占分子的三分之一，两种抗体的F(ab′)2制品的产率接近100％。样品的浓度应为6-7mg/ml。用SDS-PAGE监测F(ab′)2制品的纯度。
实施例2制备双特异性抗体BAB<425，225>
采用Brennan等(Science，1985，229，81-83)所述的方法以IgG片段的化学重组生成双特异性抗体。本发明修改方法的各步骤如下F(ab′)2产物→还原为Fab′→凝胶层析→衍生→凝胶层析→缀合→凝胶层析→超滤→无菌过滤→BAbs将两种特异性F(ab′)2片段均转化为Fab′。缀合步骤的成功依赖于选择适宜的Fab′片段用于埃尔曼氏修饰。对于源于MAb 225/MAb 425的BAb，<225>组分被修饰。在导入这些修饰后，个体BAb的产率为20-30％。抗225Fab′用埃尔曼氏试剂进行修饰，并被缀合于425特异性Fab′上。通过凝胶过滤回收双特异性抗体。
详细内容在该步骤中，两种抗体均用DTT还原以便产生Fab′片段。
在缀合前用埃尔曼氏试剂修饰源于MAb 225的Fab′。但是也可以用埃尔曼氏试剂修饰源于MAb 425的Fab′。
片段(i)F(ab′<425>)27.4mg/ml
(ii)F(ab′<225>)2 6.9mg/ml溶液/缓冲液PBS pH7.4，PBS+0.65M NaCl+2.5mM EDTA，pH7.4，PBS中51mM二硫苏糖醇，0.1M磷酸钠缓冲液，pH8.0，0.1M磷酸钠缓冲液中35mM埃尔曼氏试剂，pH8.0，250mM EDTA，pH7.4试剂1，4-二硫苏糖醇，埃尔曼氏试剂(Elman’s reagent)，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，EDTA，Titriplex III，Superdex 200(26/60)Pharmacia，合成的第一步制备MAb<225>Fab′-TNB.
6550μl F(ab′)2MAb 22540mg+65.4μl DTT 51mM+65.4μl EDTA250mM.
DTT的终浓度为0.5mM，而EDTA为2.5mM。
用氩覆盖反应物，在30℃下，于水浴中持续搅拌孵育40分钟。孵育后，在反应混合物中加入1120μl埃尔曼氏试剂，该步骤可逆地阻断了所得Fab′中的游离SH基团。
反应中埃尔曼氏试剂的终浓度为5.0mM。于室温下，将反应混合物搅拌30分钟，以便阻断所有SH基团。反应混合物的颜色从澄清变为黄色。用PBS+0.65M NaCl+2.5mM EDTA缓冲液通过Superdex 200(26/60)柱对反应混合物进行纯化，以便将还原的埃尔曼氏修饰的Fab′分子与潜在的污染物诸如未还原的F(ab′)2、Fab′和过剩的试剂分离。合并Fab-TNB级分，用氩覆盖，在偶联反应之前保存在冰上。
合成的第二步制备MAb<425>Fab′。
6135μl F(ab′)2MAb 42540mg+80μl EDTA 250mM+80μl DTT 51mM。
反应的启动不应早于Fab-TNB制备几乎完成之前。反应终浓度为0.5mM DTT和2.5mM EDTA。用氩覆盖反应混合物，于30℃孵育40分钟。孵育后立即将反应混合物移至已平衡的Superdex 200(26/60)柱上，采用PBS+0.65M NaCl+2.5mM EDTA pH7.4缓冲液将Fab′与未被还原的F(ab′)2和DTT分离。缓冲液和集合管已分别用氩饱和以防止游离SH基团氧化。将包含Fab′的级分直接收集在用氩饱和的试管中。
合成的第三步Fab′<425>和Fab′<225>-TNB的缀合偶联反应32.5ml MAb 225Fab′-TNB，0.9mg/ml，31.6mg+23.5mlMAb 425 Fab′1.5mg/ml，34.8mg。将该Fab′和该Fab′-TNB抗体合并，并在包含YM 10膜的Amicon室内将体积减至大约5ml(使用氩)。用氩覆盖该反应混合物，于4℃持续搅拌过夜。将缀合物过Superdex 200(26/60)柱进行纯化，缓冲液和柱均用氮饱和。回收双特异性F(ab′)2，(峰1)。峰1纯化的双特异性抗体(166-187ml)，峰2残留Fab′。
为了验证样品身份和纯度，将样品加至非还原性10％SDS-Page凝胶。该典型实施例中纯化的BAb<425，225>F(ab′)2的产率为11mg(16.7％)。
权利要求
1.一种能够与位于相同或不同ErbB受体分子类型上的不同表位结合的双特异性抗体或其片段，所述抗体包含与第一受体类型——ErbB1——的表位结合的第一抗原结合位点和与第二ErbB受体分子类型的不同表位结合的第二不同抗原结合位点。
2.根据权利要求1的双特异性抗体，其中所述第二ErbB受体分子类型是ErbB1(EGFR)。
3.根据权利要求1的双特异性抗体，其中所述第二ErbB受体分子类型是ErbB2(Her-2)。
4.根据权利要求1-3任一项的双特异性抗体，其中至少一个所述表位位于受体结合域内。
5.根据权利要求4的双特异性抗体，其中所述受体结合域是所述ErbB受体的天然配体的结合域。
6.根据权利要求1-3任一项的双特异性抗体，其中第一或第二抗原结合位点与所述ErbB受体分子类型的天然配体的结合域内的表位结合。
7.根据权利要求1-3任一项的双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合位点与所述ErbB受体分子类型的天然配体的结合域内的表位结合。
8.根据权利要求1-7任一项的双特异性抗体，其中抗原结合位点与位于相同ErbB受体分子类型上的不同表位结合。
9.根据权利要求1-7任一项的双特异性抗体，其中抗原结合位点与位于不同ErbB受体分子类型上的不同表位结合。
10.权利要求8的双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合位点各自与所述ErbB受体的天然配体的结合域内的不同表位结合，由此阻断和/或抑制该受体，借此与相应单特异性抗体相比，增强对ErbB受体的阻断和/或抑制以及对ErbB受体-特异性信号通路下调的诱导。
11.权利要求9的双特异性抗体，其中与双特异性抗体和相同ErbB受体分子上的表位的结合相比，增强了对具有相同或不同特异性的不同ErbB受体分子的交联和/或二聚化的诱导。
12.根据权利要求1-11任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb425。
13.根据权利要求1-11任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb225。
14.根据权利要求12或13的双特异性抗体，其被命名为“BAb<h425，c225>”，其中所述第一抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb425，而所述第二抗原结合位点源于人源化的、嵌合的或鼠的MAb225，各抗原结合位点与ErbB1受体(EGFR)分子上的不同表位结合。
15.权利要求14的双特异性抗体，其中所述不同表位位于天然配体的结合域内。
16.根据权利要求12或13的双特异性抗体，其中第二抗原结合位点与ErbB2受体分子(Her-2)或VEGF受体分子结合。
17.权利要求16的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合位点源于MAb4D5(Herceptin)。
18.源于权利要求1-17任一项所述的双特异性抗体的双特异性抗体片段，其中片段是F(ab′)2。
19.一种免疫缀合物，其包含根据权利要求1-18任一项的双特异性抗体或其片段，该抗体或片段直接或借助接头分子在C末端与生物学上有效的肽、多肽或蛋白质融合。
20.权利要求19的免疫缀合物，其中所述蛋白质是细胞因子。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-20任一项所述的双特异性抗体或免疫缀合物，及任选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
22.权利要求21的药物组合物，其还包含单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段选自MAb425、MAb225，或MAb 4D5(Herceptin)。
24.权利要求21-23任一项的药物组合物，其还包含细胞毒性剂。
25.权利要求24的药物组合物，其中所述细胞毒性剂是化疗剂。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述化疗剂选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素。
27.权利要求24的药物组合物，其中所述细胞毒性剂是ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗血管生成剂、抗激素剂，或细胞因子。
28.一种药物试剂盒，其包含(i)第一包装，其至少包含如权利要求1-20任一项所述的双特异性抗体或免疫缀合物，和(ii)第二包装，其至少包含单特异性抗ErbB抗体或其功能上有效的片段。
29.根据权利要求28的药物试剂盒，其包含第一包装和第二包装，其中第一包装包含双特异性抗体“BAb<h425，c225>”或其F(ab′)2片段，第二包装包含人源化MAb425(h425)、嵌合MAb225(c225)或人源化Mab4D5或其功能上有效的抗体片段。
30.根据权利要求28或29的药物试剂盒，其还包含第三包装，该包装包含细胞毒性药。
31.根据权利要求30的药物试剂盒，其中所述细胞毒性药选自顺铂、阿霉素、吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、博来霉素、ErbB受体抑制剂、VEGF受体抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂、抗激素剂和抗血管生成剂。
32.如权利要求1-31任一项所述的双特异性抗体或药物组合物/试剂盒在制备用于治疗过表达ErbB受体的肿瘤和肿瘤转移及相关疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及新型双特异性抗ERB－B抗体及其在肿瘤治疗中的用途。该新型抗体能够与在多种癌组织上过表达的ErbB受体，优选ErbB1受体结合。因为抗原结合位点的不同特异性针对相同或不同ErbB受体的结合域内的不同表位，这些抗体在抑制和下调ErbB受体和相应的信号级联方面更加有效。
文档编号A61K39/395GK1703242SQ200380101059
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月9日 优先权日2002年10月10日
发明者H-G·克赖施 申请人:默克专利有限公司