专利名称：hsgk1基因中新的多态性在诊断高血压中的用途和sgk基因家族在诊断和治疗长Q/T综合 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有hsgk片段的单链或双链核酸在诊断高血压中的用途，所述片段长度至少10个核苷酸/碱基对，此外所述片段包含由hsgk1基因的内含子2中732/733位的核苷酸G插入的存在或缺乏而产生的多态性。
此外，本发明涉及sgk家族的人同系物的过表达或功能性分子修饰与Q/T间期长度之间的正相关用于诊断长Q/T综合征的用途，以及sgk基因家族的人同系物的核酸或其一个片段用于诊断长Q/T综合征的用途。特别是，s gk基因家族的人同系物中单独核苷酸的多态性(单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms)＝SNPs)在本发明的情况下也可以用于诊断长Q/T综合征的遗传决定的倾向性。
在进一步的方面，本发明涉及增加sgk家族基因表达的功能活化剂或转录因子在制备治疗和/或预防长Q/T综合征的药物的用途。
很多胞外信号引起细胞内磷酸化/脱磷酸级联反应，以确保这些信号从胞质膜及其受体快速转移到细胞质和细胞核内。通过许多个别蛋白，尤其是激酶(它们将磷酸基转移到各自底物上)，使得这些可逆信号转移级联反应的特异性成为可能。
血清和糖皮质激素依赖性激酶(sgk)是丝氨酸/苏氨酸激酶，血清和糖皮质激素可增加它的表达，它最初是从大鼠乳腺癌细胞克隆的(Webster et al.，1993)。人型sgk，即hsgk1是从肝细胞克隆的(Waldegger et al.，1997)。据发现调节细胞容积会影响hsgk1的表达。迄今仍没能证明大鼠sgk表达涉及对细胞容积的依赖性。此外发现该大鼠激酶刺激上皮的Na+通道(ENaC)(Chen et al.，1999；Naray-Pejes-Toth et al.，1999)。ENaC继而在肾Na+排泄中起着重要作用。ENaC活性的增加导致钠离子的肾潴留增加，并因此导致高血压的发展，如WO02/074987A2所证明的。
最后，已经克隆了人sgk人家族的另两个成员，即hsgk2和hsgk3(Kobayashi et al.，1999)，二者如同hsgk1一样，均经PI3激酶途径被胰岛素和IGF1活化。电生理学实验表明hsgk2和hsgk3的共表达同样导致ENaC活性显著增加。
由DE 197 08 173 A1明显可知hsgk1对其中细胞容积的改变起重要病理生理作用的很多疾病有坚实的诊断潜力，所述疾病例如高钠血症、低钠血症、糖尿病、肾功能不全、分解代谢过度、肝性脑病和微生物或病毒感染。
WO 00/62781报道了hsgk1活化内皮Na+通道，从而增加肾Na+再吸收。由于这种肾Na+再吸收增加伴随有高血压，因此推测在这种情况下，hsgk1表达的增加将导致高血压，而hsgk1表达的降低将最终导致低血压。
DE 100 421 37也报道了人同系物hsgk2和hsgk3的过表达或活性过强与ENaC过度活化之间的相似联系，由此导致的肾Na+再吸收增加和由此发展而来的高血压。此外，这个文件已经探讨了激酶hsgk2和hsgk3对于原发性高血压的诊断潜力。
WO02/074987A2公开了hsgk1基因中各个核苷酸的两种不同多态性(单核苷酸多态性(SNP))的存在和高血压的遗传决定的倾向性之间的关系。在这种情况下，hsgk1基因中多态性是内含子6中的多态性(T→C)和外显子8中的多态性(C→T)。尤其是，从WO 02/074987A2的表5明显可知，在已经分析的两个SNPs之间存在强相关性失衡外显子8中SNP的大多数CC携带者也是内含子6 TT携带者(即64％)，而只有少数外显子8 TT携带者同时也是内含子6 CC携带者(仅仅2％)。内含子6和外显子8中多态性存在情况之间的这些相关性证实，为了证明高血压倾向，有必要分析这两种多态性(内含子6和外显子8)的基因型，这样引起极度技术投入和时间消耗。
因此本发明的目的是提供hsgk1基因中进一步的多态性，其中一种或另一种形式的存在可比外显子8和内含子6中两个已知多态性更好地与患者中高血压的表型存在相关联。尤其是，提供与高血压倾向相关、并且以一种或另一种形式的存在具有对hsgk1蛋白的功能性分子修饰后果的单一SNP将非常有利。
通过提供hsgk1基因中的新多态性完成了这个目的，其中所述多态性包括在732/733位插入核苷酸G。已经发现在732/733位具有核苷酸G插入(InsG/InsG)的个体以更高频率存在，并且发展为高血压的倾向较低。另一方面，在732/733位不具有这种插入的个体(WT/WT)更罕见存在，并且发展为高血压的倾向明显较高。根据迄今获得的结果，有关内含子2中732/733位处多态性的基因型与发展为高血压的倾向性之间的这种相关性看起来比外显子8和内含子6中多态性的相应相关性具有明显较高的显著性(见表1)。
此外，根据使用已知预测程序获得的预测，推测hsgk1基因的特定剪接变体的表达取决于在hs gk1基因内含子2中732/733位存在还是缺乏G插入。hsgk1基因的这种特定剪接变体的表达可以导致hsgk1蛋白的功能性分子修饰，引起hsgk1活性改变，尤其是hsgk1活性增加。因此，hsgk1蛋白的这种分子修饰，尤其是hsgk1活性增加的生理后果最终可以导致高血压症状的发展。
在第一个方面，本发明涉及分离的单链或双链核酸在诊断高血压中的用途，该核酸包含如SEQ ID No.1描述或如SEQ ID No.2描述的核酸序列的片段，所述片段的长度是至少10个核苷酸/碱基对，优选至少15个核苷酸/碱基对，尤其是至少20个核苷酸/碱基对，并且所述片段包含hsgk1基因的内含子2中在732/733位有或无核苷酸G插入的多态性。
SEQ ID No.1描述了这样的hsgk1基因组DNA序列，其中在hsgk1基因内含子2的732/733位没有核苷酸G(或GTP)的插入，即所谓的“野生型(WT)”序列，SEQ ID No.2描述了这样的hsgk1的基因组DNA序列，其中在hsgk1基因内含子2的732/733位具有核苷酸G(或GTP)的插入，即所谓的“G插入(InsG)”序列。
在第二个方面，本本发明涉及诊断高血压的试剂盒，该试剂盒包含至少一个分离的单链或双链核酸，该核酸包含如SEQ ID No.1或2描述的序列的片段。在这一点上，来自SEQ ID No.1或2的所述片段的长度是至少10个核苷酸/碱基对，优选至少15个核苷酸/碱基对，尤其是至少20个核苷酸/碱基对。此外，来自SEQ ID No.1或2的所述片段应该包含hsgk1基因内含子2中在732/733位有或没有核苷酸G插入的多态性。
或者，除上述单链或双链核酸之外，或与上述单链或双链核酸相反，诊断高血压的试剂盒也可以包含至少一种抗体，该抗体针对的是hsgk蛋白的某一区域，hsgk1蛋白中所述区域的存在取决于相应hsgk编码基因的内含子2中732/733位核苷酸G插入的存在。例如，如果hsgk1基因中732/733位G插入的存在会诱导外显子被剪接掉，那么精确地针对该被剪接掉的蛋白区域的抗体可以用来检测该个体中的多态性形式。因此，这种抗体可以用来诊断发展高血压的倾向性。
在第三个方面，本发明涉及诊断高血压的方法，该方法包括下列程序步骤a)从个体中取出身体样品，b)合适时，从根据a)的身体样品分离和/或扩增基因组DNA、cDNA或mRNA，c)对在hsgk1基因内含子2中732/733位具有核苷酸G插入的等位基因进行定量。
在a)步骤中，从试验个体取出身体样品，优选该个体是哺乳动物，尤其是人。在根据本发明的这个诊断方法中，优选使用的来自患者的身体样品是血液样品或唾液样品，其中包含细胞物质，并可相对不太费劲地从患者获得。然而，也可以使用同样包含细胞的其它身体样品，如组织或细胞样品等等。
在b)步骤中，使用标准方法(Sambrook J.and Russell D.W.(2001)Cold Spring Harbor，NY，CSHL Press)从来自a)的身体样品制备(合适时)和/或扩增(合适时)基因组DNA或cDNA或mRNA。在这一点上，有可能使用熟练技术人员熟悉的任何合适方法。合适时，也可能省却这个DNA分离步骤或DNA扩增步骤，在c)步骤中使用本身包括PCR扩增步骤的检测方法时尤其如此。
在c)步骤中，最后对hsgk1基因内含子2中732/733位具有核苷酸G插入的等位基因的数量进行定量。在这一点上，具有两个WT等位基因的那些个体应该具有发展为高血压的倾向。可使用熟练技术人员已知的各种方法来实现有关hsgk1基因内含子2中732/733位置处多态性的等位基因的定量/鉴定。下面更详细解释一些优选方法。然而，hsgk1基因内含子2中732/733位具有G核苷酸插入的等位基因数的定量不限于下面描述的优选方法。优选地，可以通过对来自身体样品的DNA、优选基因组DNA在hsgk1基因内含子2中732/733位的直接测序，鉴定关于732/733位置处多态性的基因型(或等位基因数量)。为了完成此，有必要使用已知测序方法，以获得具有就在hsgk1基因732/733位置处附近的序列的短寡核苷酸作为测序引物。
基于来自身体样品的基因组DNA与特异性杂交探针杂交的任何已知方法构成同样优选的、用于鉴定关于在732/733位多态性的基因型(或用于定量等位基因数量)的进一步方法。
Southern印迹是这种杂交方法的实例。例如，如果hsgk1基因内含子2中的732/733位置处G插入的存在破坏了或形成了限制性内切核酸酶的切割位点，那么将可能使用特异性杂交探针来检测长度不同于WT等位基因中相应片段长度的核酸片段。这样，将可能检测针对732/733位置处感兴趣的多态性而言特异的基因型。
如果由于在732/733位存在或缺乏G插入，导致表达出缺乏特定外显子的其它剪接变体，则也将可能使用来自在剪接变体中丧失的外显子的特异杂交探针来检测针对感兴趣的732/733位置处多态性的基因型。
杂交方法的另一个实例是来自身体样品的基因组DNA与被标记的单链寡核苷酸杂交的方法，该寡核苷酸优选长度为15-25个核苷酸，并且在732/733位有或没有G插入。在非常特异的杂交条件下，该条件可以使用已知方法用实验方法试验每一单独的寡核苷酸，有可能将完全杂交的寡核苷酸与具有单一碱基错配的寡核苷酸区分开来，这样的杂交条件可使用已知方法针对每种具体的寡核苷酸而实验性地测试出来。
尤其是，鉴定关于在732/733位置处多态性的基因型(或对等位基因数量进行定量)的其它优选方法是PCR寡核苷酸延伸试验或连接试验。
在PCR寡核苷酸延伸试验的情况下，将可能例如提供具有来自SEQID No.2中片段的序列的寡核苷酸，并在其3′末端具有732/733多态性位点处的G。当这个寡核苷酸与WT等位基因的样品片段(无G插入)杂交时，因为3′末端的错配，在随后的PCR反应中将不可能延伸以及最终扩增这个片段。另一方面，当这个寡核苷酸与InsG等位基因杂交时，由于寡核苷酸3′末端的完美碱基配对，将有可能实现延伸，并最终获得PCR扩增产物。
连接试验最终基于的是与PCR寡核苷酸延伸试验相同的原理只有在其末端具有确切碱基配对的那些双链核酸片段可以与另一双链核酸片段连接。因此，取决于hsgk1基因内含子2中732/733位置处G插入的存在与否，可以显现特定的连接产物。
除根据本发明的多态性与高血压倾向的相关性之外，意外发现了根据本发明的多态性与所谓的Q/T间期长度之间另有一种相关性。在关于hs gk1基因内含子2中的732/733位置具有WT/WT基因型的个体中观察到比具有InsG/InsG基因型的个体明显较短的Q/T间期。杂合(WT/InsG)个体具有中等Q/T间期(见表3)。显著延长的Q/T间期导致所谓的长Q/T综合征的发展，表现为心脏节律失调，经由心室纤颤直到心源性猝死。因此，具有InsG/InsG基因型的个体应该具有发展长Q/T综合征的倾向。
由于已经证明的Q/T间期长度和hsgk1基因的基因组成之间的正相关性，尤其是Q/T间期长度和hsgk1基因内含子2中732/733位置处的多态性之间的正相关性，可以推测sgk家族的另一人类同系物的核酸同样适用于诊断长QT综合征。
使用ECG测量仪器可以检测的Q、R和S波组成评估去极化的实验值。Q/T间期定义为使用ECG测量仪器检测的从T波传播(Q波出现)开始至以T波结束为特征的去极化结束之间的时间。因此Q/T间期构成心脏新的兴奋状态开始和恢复到休息状态之间的流逝时间。因此，Q/T间期的明显延长会导致心脏节律失调，并最终导致已经提及的长Q/T综合征。
因此，本发明也涉及利用sgk家族的人同系物、尤其是hsgk1基因的过表达或功能性分子修饰与Q/T间期长度之间的正相关性诊断长QT综合征的用途。
在“sgk家族的人同系物”中，同系物包括功能性的分子修饰，这样，这一完整术语应理解为sgk家族的同系物，其已被突变而改变了相应蛋白的性质，尤其是催化性质或底物特异性。
根据本发明，Q/T间期和sgk家族人同系物的遗传组成之间的正相关性暗示将可能在患者个体中存在hsgk1、hsgk2或hsgk3基因的各个突变，这些突变改变了hsgk1、hsgk2或hsgk3激酶的表达水平或功能性质，并因此导致遗传性的Q/T间期延长，并最终导致长Q/T综合征发展的倾向性。例如，这种突变可以发生在sgk基因位点的调节基因区或在内含子序列中。另一方面，sgk位点的遗传组成的个体差异还可以影响基因的编码区。然后，合适时，编码区中的突变能导致相应激酶的功能改变，例如激酶的催化性质被修饰，这些被改变的性质最终也影响Q/T间期。因此，上述两种突变类型都可以引起Q/T间期延长，并因此最终导致长Q/T综合征发展的倾向性。
导致患者发展长Q/T综合征的倾向性的sgk家族人同系物内上述突变照例是所谓的单核苷酸多态性(SNPs)，所述多态性位于这些同系物的外显子区或内含子区内。在它们的较少发生的形式、即稍后称作突变形式中，hsgk基因外显子区内的SNPs在合适时可以引起相应hsgk蛋白中的氨基酸置换，并因此使激酶受到功能性修饰。在它们的突变形式中，合适时，hsgk基因的内含子区或调节序列中的SNPs可以引起相应激酶的表达水平的改变。然而，如果内含子区中的SNPs影响不成熟mRNA的可变剪接，则它们也可以引起激酶的功能改变。
本发明也涉及单链或双链核酸用于诊断发展长Q/T综合征的倾向性的用途，该核酸包含sgk家族人同系物的序列或它的一个片段，尤其是hsgk1基因本身或它的一个片段。在这一点上，单链或双链核酸优选具有至少10个核苷酸/碱基对的长度。
除上述的单链或双链核酸之外，针对sgk家族人同系物的底物、尤其是针对hsgk1的底物的某些抗体也适于诊断发展长Q/T综合征和高血压的倾向性。优选这些诊断性抗体针对的是sgk家族人同系物的表位，尤其是hsgk1的表位，其中含有处于磷酸化形式或未磷酸化形式的底物磷酸化位点。
在优选实施方案中，泛素蛋白连接酶Nedd4-2(登记号BAA23711)被用作sgk家族人同系物的底物。这个泛素蛋白连接酶是被sgk家族的人同系物特异性磷酸化的蛋白[Debonneville et al.，Phosphorylation of Nedd4-2 by Sgk 1 regulates epithelial Na(+)channel cell surface expression.EMBO J.，2001；207052-7059；Snyder et al.，Serum and glucocorticoid-regulated kinasemodulates Nedd4-2-mediated inhibition of the epithelial Na(+)channel.J.Biol.Chem.2002，2775-8]。hsgk1的磷酸化位点具有共有序列(R X R X X S/T)，其中R是精氨酸，S是丝氨酸，T是苏氨酸，X是任何任意氨基酸。在Nedd4-2(登记号BAA23711)中，存在符合上述共有序列标准的两个hsgk1潜在磷酸化位点在382位氨基酸位置处的丝氨酸和在468位氨基酸位置处的丝氨酸。
因此，用于诊断发展长Q/T综合征的倾向性的上述抗体优选针对的是底物Nedd4-2，特别优选针对的是具有hsgk1潜在磷酸化位点的序列、即共有序列(R X R X X S/T)的Nedd4-2蛋白的区域。特别是，这些抗体针对的是包含两个潜在磷酸化位点中的至少一个(即382位氨基酸的丝氨酸和/或468位氨基酸的丝氨酸)的Nedd4-2蛋白区。
此外本发明涉及诊断长Q/T综合征或表现为Q/T间期延长的其它疾病的试剂盒。这种诊断长Q/T综合征的试剂盒优选包含针对sgk蛋白家族的人同系物的抗体，或者尤其是在严格条件下能够与sgk基因家族的人同系物杂交的核酸。该试剂盒还可以共同包含针对s gk蛋白家族的人同系物的抗体和在严格条件下与sgk基因家族的人同系物杂交的核酸。特别优选地，根据本发明的诊断长Q/T综合征的试剂盒还可以包含针对hsgk1蛋白的抗体或在严格条件下能够与hsgk1基因杂交的核酸。
在这一点上，在严格条件下的杂交被理解为指在相关专业文献(Sambrook J.and Russell D.W.(2001)Cold Spring Harbor，NY，CSHL Press)中已经描述的关于杂交温度和杂交液中甲酰胺含量的那些杂交条件下进行的杂交。
特别是，该诊断试剂盒可以包含具有如SEQ ID No.1或2所述序列的单链或双链作为杂交探针，所述核酸的长度是至少10个核苷酸/碱基对，并包含hsgk1基因内含子2中732/733位置处的存在或缺乏核苷酸G插入的多态性。
特别地，根据本发明的诊断试剂盒提供了特异性地针对hsgk1蛋白的某些区域的抗体，其中hsgk1蛋白中所述区域的存在取决于hsgk1基因内含子2中732/733位置处G插入的存在。特别地，那些区域会由于未成熟mRNA中存在或缺乏该G插入而被剪接掉，因此在成熟mRNA和由它产生的蛋白中并不存在，故而适于用作诊断性抗体所针对的免疫原性表位。相应地，能够与取决于732/733位置处G插入而被剪接掉的这种基因区域杂交的hsgk1基因的核酸区域也适合用作诊断性杂交探针。
作为特异性杂交探针，优选用于诊断长Q/T综合征的试剂盒还可以包括包含hsgk1基因中已知SNPs、尤其是外显子8中的SNP(C2617T、D240D)、内含子6中的SNP(T2071C)和/或内含子2中732/733位置处的SNP(G插入)的核酸片段。
本发明上下文里已经证明的hsgk1基因家族内基因的遗传组成和Q/T间期长度之间的相关性也使得有可能治疗性地使用sgk家族的功能活化剂或正向转录调节剂来治疗长Q/T综合征和同样伴有Q/T间期延长的类似疾病。在这一点上，“功能活化剂”被理解为活化sgk家族相应激酶的生理功能的物质。“正向转录调节剂”被理解为活化sgk家族相应激酶的表达的物质。
因此，本发明也涉及sgk家族的人同系物，尤其是hsgk1的功能活化剂或正向转录调节剂用于降低Q/T间期、尤其是治疗和/或预防长Q/T综合征的用途。sgk家族人同系物、尤其是hsgk1的已知功能活化剂和/或正向转录调节剂是糖皮质激素、盐皮质激素、醛固酮、促性腺激素和很多细胞因子，尤其是TGF-β。
因此本发明进一步涉及选自包括糖皮质激素、盐皮质激素、醛固酮、促性腺激素和细胞因子、尤其是TGF-β中的物质用于制备治疗和/或预防长Q/T综合征的药物的用途。本发明也涉及包含选自上述物质组中的物质用于治疗和/或预防长Q/T综合征的药物。
通过下列实施例详细说明本发明。
实施例1本发明上下文里进行相关性研究，其中将不同患者(双胞胎)中hsgk1基因的基因型与这些患者中测定的收缩和舒张压值相比较，然后进行统计学评价。
75对双卵性双胞胎用于相关性分析(Busjahn et al.，J.Hypertens 1996，141195-1199；Busjahn et al.，Hypertension1997，29165-170)。实验受试者都属于德裔白种人并来源于德国的不同地区。为了证实双卵性以及更多的分子遗传分析，从双胞胎对和他们的父母取血。每个实验受试者经历在先医学检查。已知无一实验受试者罹患任何慢性的医学上公认的疾病。5分钟后，受过训练的医生使用标准水银血压计测量处于坐姿的被测试受试者血压(以1分钟时间间隔测量2次)。两次测量的平均值用作血压值。
使用双卵性双胞胎进行相关性研究的优点是他们年龄相同，并且判定外界对他们表型的影响最小(Martin et al.，Nat Genet 1997，17387-392)。
Martin et al.1997最近描述了研究双胞胎的研究对于解释复杂遗传性疾病的重要性。
使用聚合酶链式反应(PCR)扩增五个微卫星标记来证实双胞胎对的双卵性。在这个微卫星标记的分析中，通过PCR使用含有在不同人个体中高度可变的区域的特异性寡核苷酸扩增脱氧核糖核酸(DNA)片段。通过扩增片段大小的微小差异可以检测这些基因组区域内的高程度变异性，这样，当相应基因位点存在多样性时，在对PCR产物进行凝胶电泳分离后将产生双条带，即所谓的微卫星条带(Becker et al.，J.Reproductive Med 1997，42260-266)。
为了进行靶基因的分子遗传分析，在hsgk1基因目前的情况下，通过PCR扩增hsgk1位点邻近区域中的另外三个微卫星标记区域(d6s472、d6s1038、d6s270)，然后与来自另一双胞胎及其父母的相应样品相比较。用这种方法有可能判定双胞胎是否具有由他们的父母遗传的、与研究中的等位基因相同或不同的等位基因。使用结构方程模型(SEM)模型(Eaves et al.，Behav Genet 1996，26519-525；Neale，1997MxStatistical modeling，Box 126MCV，Richmond，VA 23298Department of Psychiatry.4th edition)进行相关性分析。这个模型依据的是测试对的变量-协变量矩阵，其以他们不具有、或具有一个或两个相同等位基因的概率为特征。关于表型的方差可分为基于所有基因的遗传背景的方差(A)、基于靶基因的遗传背景的方差(Q)(在这种情况下靶基因是hsgk1基因)和由于外界影响造成的方差(E)。
VAR＝A2+Q2+E2测试对的协变量定义为三种可能的等位基因组合IBD0、IBD1和IBD2(IBD＝血统相同；0、1或2相同的等位基因)如下COV(IBD0)＝0.5 A2COV(IBD1)＝0.5A2+0.5 Q2COV(IBD2)＝0.5 A2+Q2为了评估hsgk1位点的遗传组成和测试受试者的血压之间的相关性，分别考虑和不考虑靶基因hsgk1的遗传变异的模型之间的差异作为x2统计量计算。对于每对和每个基因位点，通过基于父母基因型的所谓多点模型(MAPMAKER/SIBS；Kruglyak et al.，Am J Hum Genet1995，57439-454)计算等位基因比率。
最近在模拟研究(Fulker et al.，Behav Gen 1996，26527-532)中证实了，与上述x2统计量(S.A.G.E.Statistical Analysis forGenetic Epidemiology，Release 2.2.Computer program package，Department of Epidemiology and Biostatistics，Case WesternReserve University，Cleveland，OH，USA，1996)比较，基于变量-协变量评估的分析方法的更大信息价值。为了确保Lander和Kruglyak标准(Lander et al.，Nat Genet 1995，11241-246)方面的显著相关性，采用p＜0.01的误差概率。
表1显示了这个相关性研究的结果。
表1
如从表1可以看出，所确定的误差概率p值低，不超过或仅仅稍微超过采用的p＜0.01的误差概率，这证明hsgk1基因位点的遗传变异和表型确定的所测血压的变异之间存在正相关。
实施例2已经描述了hgsk1基因的基因组结构(Waldegger et al.，Genomics，51，299)，http//www.ensembl.org/Homo_sapiens/geneview？gene＝ENSG00000118515)。
为了鉴定其存在与发展高血压的倾向性相关的SNPs，首先研究数据库中公开的hsgk1基因中的SNPs，以确定它们是否是真实的SNPs，而不是简单的测序误差，以及确定SNPs是否足够多态而可以构成诊断性检测高血压倾向的基础。以这种方法已经定位了涉及T取代C的外显子8中的SNP rs 1057293(http//www.ensembl.org/Homo_sapiens/snpview？snp＝1057293；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？type＝rs&rs＝1057293)和另一个SNP，其位于hsgk1基因中与第一个SNP相距正好551bp，在内含子6至外显子7的供体剪接位点中，并涉及C取代T。
实施例3从75对双胞胎的随机样品中取血液样品。通过PCR从血液样品中扩增hsgk1基因的基因组DNA后，使用合适的测序引物直接并且完全对hsgk1基因的外显子和内含子(而不是启动子区)进行测序。当比较来源于不同测试受试者的hsgk1基因序列时，注意到了内含子2中的又一个多态性，由732/733位置处的额外核苷酸G插入组成。此外，各个测试受试者的hsgk1基因中732/733位置处这个G插入的存在或缺乏显示与各个测试受试者中测量的血压显著相关平均起来，InsG/InsG基因型显示出比WT/WT基因型以及杂合WT/InsG基因型显著降低的收缩和舒张压值(见表3)。相反，hsgk1基因中的其它多态性显示出与测量血压的相关性更不显著(例如内含子6(C2071T)和外显子8(T2617C、D240D))或与测量血压无相关性(例如内含子3位置Ins13+xT、T1300-1312和内含子4(C1451T)以及内含子7位置2544delA)，如表2所示。
同样对测试受试者测量的ECG值也表明由各个测试受试者测定的Q/T间期与所测试受试者有关hsgk1基因内含子2中732/733位置处的多态性的基因型有显著相关性在这一点上，具有较不常见的WT/WT基因型的测试受试者显示出比杂合WT/InsG测试受试者明显更短的Q/T间期，而后者显示具有比更常见的InsG/InsG基因型的测试受试者显著更短的Q/T间期(见表3)。较长的Q/T间期会增加收缩性心脏节律失调、尤其是长Q/T综合征的危险。因此，发现hsgk1基因内含子2中732/733位置处的多态性的基因型一方面和长Q/T综合征倾向之间是负相关，另一方面和高血压倾向性之间是负相关。每种情况下，这些相关性均可以用于高血压和长Q/T综合征的诊断、治疗和预防。
表2
表3
序列表<110>Lang，Florian<120>hsgk1基因中新的多态性在诊断高血压中的用途和sgk基因家族在诊断和治疗长Q/T综合征中的用途<130>L62136<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5704<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>外显子<222>(36)..(155)<223>
<220>
<221>外显子<222>(303)..(378)<223>
<220>
<221>外显子<222>(806)..(881)<223>
<220>
<221>外显子<222>(1317)..(1421)<223>
<220>
<221>外显子<222>(1526)..(1609)<223>
<220>
<221>外显子
<222>(1725)..(1856)<223>
<220>
<221>外显子<222>(2106)..(2218)<223>
<220>
<221>外显子<222>(2560)..(2683)<223>
<220>
<221>外显子<222>(3141)..(3236)<223>
<220>
<221>外显子<222>(3652)..(3807)<223>
<220>
<221>外显子<222>(3915)..(4004)<223>
<220>
<221>外显子<222>(4349)..(5526)<223>
<220>
<221>内含子<222>(156)..(302)<223>
<220>
<221>内含子<222>(379)..(805)<223>
<220>
<221>内含子<222>(882)..(1316)<223>
<220>
<221>内含子<222>(1422)..(1525)<223>
<220>
<221>内含子<222>(1610)..(1724)<223>
<220>
<221>内含子<222>(1857)..(2105)<223>
<220>
<221>内含子<222>(2219)..(2559)
<223>
<220>
<221>内含子<222>(2684)..(3140)<223>
<220>
<221>内含子<222>(3237)..(3651)<223>
<220>
<221>内含子<222>(3808)..(3914)<223>
<220>
<221>内含子<222>(4005)..(4348)<223>
<220>
<221>突变<222>(732)..(733)<223>在某些基因型中在位置732/733处插入G<220>
<221>突变<222>(1299)..(1300)<223>在某些基因型中插入同型13 x T<220>
<221>突变<222>(1451)..(1451)<223>在某些基因型中在位置1451处的C/T-交换<220>
<221>突变<222>(2071)..(2071)<223>在某些基因型中内含子6的位置2071处的C/T-交换<220>
<221>突变
<222>(2543)..(2544)<223>在某些基因型中在内含子7的位置2543/2544处插入A<220>
<221>突变<222>(2617)..(2617)<223>在某些基因型中在外显子8的位置2617处的T/C-交换(不导致氨基酸交换，D240D)<400>1ggccgagcgc gcggcctggc gcacgatacg ccgag ccg gtc ttt gag cgc taa 53cgt ctt tct gtc tcc ccg cgg tgg tga tga cgg tga aaa ctg agg ctg101cta agg gca ccc tca ctt act cca gga tga ggg gca tgg tgg caa ttc149tca tcg gtgagtgcag gaatcttgcg ggacttctgc tccaggagac gcaaagtgga 205aattttttga aagtcccgga tcagattagt gtgtgtggcg ccgggacgtt atgaagccgt 265ctaaacgttt ctttatttct cctccttcta tccacag ctt tca tga agc aga gga 320gga tgg gtc tga acg act tta ttc aga aga ttg cca ata act cct atg368cat gca aac a gtaagttcag accggattga ggaaataact agtatagttt 418gaatttgcca gcggtaaaca ttctcatcac ggcgtttatc gggaaggcga agacttcttc 478
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<221>突变<222>(733)..(733)<223>在某些基因型中在位置733处缺失核苷酸G<220>
<221>突变<222>(1300)..(1301)<223>在某些基因型中同型插入13 x T<220>
<221>突变<222>(1452)..(1452)<223>在某些基因型中在位置1452处的C/T-交换<220>
<221>突变
<222>(2072)..(2072)<223>在某些基因型中在内含子6的位置2072处的C/T交换<220>
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<221>突变<222>(2618)..(2618)<223>在某些基因型中在外显子8的位置2618处的T/C交换(不导致氨基酸交换，D240D)<400>2ggccgagcgc gcggcctggc gcacgatacg ccgag ccg gtc ttt gag cgc taa 53cgt ctt tct gtc tcc ccg cgg tgg tga tga cgg tga aaa ctg agg ctg101cta agg gca ccc tca ctt act cca gga tga ggg gca tgg tgg caa ttc149tca tcg gtgagtgcag gaatcttgcg ggacttctgc tccaggagac gcaaagtgga 205aattttttga aagtcccgga tcagattagt gtgtgtggcg ccgggacgtt atgaagccgt 265ctaaacgttt ctttatttct cctccttcta tccacag ctt tca tga agc aga gga 320
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1.含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所述核酸序列的片段的分离的单链或双链核酸用于诊断高血压的用途，其特征在于所述片段的长度是至少10个核苷酸/碱基对，并且所述片段包含hsgk1基因内含子2中在732/733位置处有或没有核苷酸G插入的多态性。
2.一种定量诊断高血压的试剂盒，其中包含至少一种如权利要求1定义的分离的单链或双链核酸。
3.一种定量诊断高血压的试剂盒，其中包含至少一种针对hsgk蛋白的区域的抗体，其特征在于hsgk1蛋白中所述区域的存在取决于hsgk编码基因的内含子2中732/733位置处核苷酸G插入的存在。
4.一种诊断高血压的方法，包括下列程序步骤a)取出身体样品，b)合适时，从根据a)的身体样品分离和/或扩增基因组DNA、cDNA或mRNA，c)对在hsgk1基因内含子2中732/733位置处具有核苷酸G插入的等位基因进行定量。
5.如权利要求4的方法，其特征在于a)步骤的身体样品选自血液、唾液、组织和细胞组成的组。
6.如权利要求4或5的方法，其特征在于通过对从身体样品分离的基因组DNA或cDNA进行直接测序而在c)步骤中对等位基因进行定量。
7.如权利要求4至6的方法，其特征在于通过特异性地杂交从身体样品分离的基因组DNA或cDNA而在c)步骤中对等位基因进行定量。
8.如权利要求4至7的方法，其特征在于通过PCR寡核苷酸延伸试验或连接试验在c)步骤中对等位基因定量。
9.sgk家族的人同系物的过表达或功能性分子修饰与Q/T间期长度之间的正相关性用于诊断长QT综合征的用途。
10.单链或双链核酸在诊断长QT综合征中的用途，其中所述核酸包含sgk家族的人同系物的序列或它的长度至少为10个核苷酸/碱基对的片段。
11.如权利要求9或10的用途，其特征在于sgk家族的人同系物是hsgk1基因。
12.如权利要求11的用途，其特征在于核酸、hsgk1基因或它的片段具有至少10个核苷酸/碱基对的长度，并且所述核酸包含hsgk1基因内含子2中732/733位置处有或没有核苷酸G插入的多态性。
13.针对sgk家族中人同系物的底物的抗体用于诊断发展长Q/T综合征的倾向性的用途，该抗体针对的是含有磷酸化形式或未磷酸化形式的磷酸化位点的该人同系物表位。
14.如权利要求13的用途，其特征在于sgk家族中人同系物的底物是Acc No.BAA23711的Nedd4-2。
15.一种诊断长QT综合征的试剂盒，其中包含针对sgk蛋白家族的人同系物的抗体，或在严格条件下能够与sgk基因家族的人同系物杂交的核酸，或者组合性地包含所述抗体和核酸。
16.如权利要求15的试剂盒，其特征在于sgk家族的人同系物是hsgk1基因。
17.sgk家族的人同系物、尤其是hsgk1的功能活化剂或正向转录调节剂用于降低Q/T间期的用途。
18.如权利要求17的用途，其特征在于功能活化剂或正向转录调节剂选自糖皮质激素、盐皮质激素、醛固酮、促性腺激素和细胞因子，尤其是TGF-β。
19.选自由糖皮质激素、盐皮质激素、醛固酮、促性腺激素和细胞因子、尤其是TGF-β组成之组中的物质用于制备治疗和/或预防长Q/T综合征的药物的用途。
20.一种包含至少一种选自糖皮质激素、盐皮质激素、醛固酮、促性腺激素和细胞因子、尤其是TGF-β组成之组中的物质的药物，其用于治疗和/或预防长QT综合征。
全文摘要
本发明涉及含有hsgk片段的单链或双链核酸在诊断高血压中的用途，所述片段的长度至少10个核苷酸/碱基对，并且所述片段包含由hsgk1基因内含子2中732/733位置处的核苷酸G插入的存在或缺乏而产生的多态性。本发明含涉及sgk家族的人同系物的过表达或功能性分子修饰与Q/T间期长度之间的正相关性用于诊断长Q/T综合征的用途，以及sgk基因家族的人同系物的核酸或它的片段用于诊断长Q/T综合征的用途。sgk基因家族的人同系物中单独核苷酸的多态性(单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms＝SNPs)特别可用于诊断长Q/T综合征的先天性倾向。在另一方面，本发明涉及增加sgk家族基因表达的功能活化剂或转录因子在制备治疗和/或预防长Q/T综合征的药物中的用途。
文档编号A61K38/18GK1761760SQ200480007035
公开日2006年4月19日 申请日期2004年2月5日 优先权日2003年2月7日
发明者弗洛里安·朗, 安德勒斯·巴斯亚恩 申请人:弗洛里安·朗