专利名称：抗微生物trinervitane衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新类别的抗微生物化合物。这些化合物可用于各种目的，例如治疗微生物感染和疾病，和作为消毒剂。
背景技术：
抗生素，对有感染力的微生物具有选择毒性的化合物，为人类提供了巨大的益处，并由于它们在20世纪的推广而挽救了无数的生命而享有声望。当今仍存在对于新的抗生素的持续性的需求，以帮助控制多重耐药的病原体(例如多重耐药的金色葡萄球菌或抗万古霉素的肠球菌)，或对治疗困难的病原体例如结核分枝杆菌(肺结核的病原体)提供改进治疗。选择性的毒性化合物也可用作兽医学抗生素和生长增强剂，其中需要研制具有与在人类中使用的作用方式不同的试剂，以及可在医学和工业方法和产品的较宽的范围内用作防腐剂和抗菌试剂。
昆虫和陆地无脊椎动物将面临由许多条件性病原微生物病原体造成的感染，然而它们是在世上已经存在亿万年的成功的生物群，并且现在由数百万的物种所代表，远远超过任何其它大型生物群组。因此昆虫及其它陆地的无脊椎动物必定具有避免或克服潜在的感染的高效方法。
昆虫与哺乳动物及其它生物一样具有基于由血细胞进行的外来物质非特异性噬菌作用的“先天的”免疫系统，并产生一系列抗微生物肽，例如防御素，杀菌肽和樗蚕素(attacins)，以响应通常的微生物诱导物例如脂多糖和(1，3)-β-D-葡聚糖。然而，一直没有从昆虫或任何其它无脊椎动物得到证据，证明存在B-淋巴细胞/T-淋巴细胞类型的纯系、可诱导的免疫系统，其代表哺乳动物对感染起响应。因此昆虫可能具有其它、未被发现的、保护本身免遭微生物侵入的防御系统。
先前几乎没有通过昆虫合成非肽类抗生素的证据。在20世纪50年代，调查了102个北美的节肢动物物种[1]，显示仅仅有两种活性提取物，并且推测这些提取物由于存在醌而具有活性，活性化合物不具有抗生素的价值。近来由韩国叶蜂[2]中分离出抗微生物化合物，p-羟基肉桂醛，然而没有提供这些化合物的哺乳动物毒性的数据。
在1997和1999年间，本申请的申请人汇集了从澳大利亚东海岸收集的大量陆地无脊椎动物，对它们进行了提取，并对提取物的生物活性进行了筛选。结果，申请人从一种长鼻兵尉蚁Nasutitermestriodiae中鉴定出了抗生素trinervitadienes(WO 01/90035)。
由于微生物对已知的抗生素的耐药性提高，因此存在对于可用作抗微生物剂的其它化合物的需求。
发明公开本发明人鉴定出了具有抗微生物活性的新的trinervitanes。
在一方面，本发明提供了下式的化合物式(1)
其中化合物在选自下列的碳原子之间包括至少一个双键C1和C14，C9和C10，和C7和C8；和其中；每个 独立地表示单或双键或环氧键，和(i)取代基A1至A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基，低级醇基团，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基，或(ii)任何一个或多个取代基对A1和A2，A1和A3，A2和A3，A2和A4，A3和A4，A3和A5，A4和A5，A4和A6，A5和A6，A5和A7，A6和A7，A6和A8，A7和A8，A7和A9，A8和A9，A8和A10，A9和A10，A9和A11，A10和A11，A10和A12，A11和A12，A12和A13，A12和A13，A12和A14，A13和A14，A1和A13，A1和A14，和A2和A14形成取代的或未取代的杂环基团，其中任何不形成取代或未取代的杂环的取代基，包括A15和A16，独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基团，低级酰氧基，低级醇基，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基；和其中A1或A7可以不存在；和其中任何一个A2，A3，A5，A6和A8至A15，可以通过单或双键或环氧键键合至式(1)的环结构；和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物盐；条件是，化合物不是7(8)，11(12)，15(17)-trinervitatriene-2α，3α-二醇。
在优选实施方案中，化合物在选自C1和C14、和C9和C10碳原子之间包括至少一个双键。
在进一步的优选实施方案中，式(1)的化合物具有三个、四个或更多双键。更优选，化合物至少在选自下列的碳原子之间包括双键；i)C1和C14，C9和G10，和C8和A8，ii)C1和C14，C15和A15，和C8和A8，或iii)C1和C14，C15和A15，和C7和C8。
更优选，化合物至少在C1和C14之间包括双键。
优选，A1，A2，A3，A5，A6，A7，A9，A10，A11，A13，A14和A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2和OR。更优选，A1，A2，A3，A5，A6，A7，A9，A10，A11，A13，A14和A16独立地选自H，OH和OR。R在基团OR中是本文中所定义的低级烷基(优选，甲基或乙基)或低级酰基。更优选，A7和/或A16是H。
优选，A4和A12独立地选自低级烷基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基和低级醇基团。更优选，A4和A12独立地选自甲基，羟甲基，甲酰基和羧基。更优选，A4和A12是甲基。
优选，A8和A15选自低级烷基，低级链烯或低级炔。更优选，A8和A15选自甲基和CH2。最优选，A8和A15是CH2。
还优选至少两个所述的A1至A16是OH或OR基团，其中R如以上所定义。更优选，至少A2和A3是OH。
在另一个优选实施方案中，该化合物包括下式式(1)
其中化合物在选自C1和C14、C9和C10、C7和C8的碳原子之间包括至少一个双键；和其中；每个 独立地表示单或双键或环氧键，和其中取代基A1至A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基，低级醇基团，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基，和其中A1或A7可以不存在；和其中任何一个A2，A3，A5，A6和A8至A15，可以通过单或双键或环氧键键合至式(1)的环结构；和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物；条件是，化合物不是7(8)，11(12)，15(17)-trinervitatriene-2α，3α-二醇。
在另一个优选实施方案中，该化合物包括下式式(2)
其中； 表示单或双键；和其中取代基A2，A3，A4，A7，A8，A12，A15和A16如以上关于式(1)的定义，和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物。
在另一个优选实施方案中，该化合物包括下式式(3) 其中取代基A2，A3，A4，A8，A12，A15和A16如以上关于式(1)的定义，和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物。
更优选，化合物选自(9E)-1(14)，8(19)，9(10)，15(17)-trinervitatetraene-2β，3α-二醇(P)；1(14)，8(19)，15(17)-trinervitatriene-2β，3α-二醇(Q)；和1(14)，7(8)，15(17)-trinervitatriene-2β，3α二醇(R)。
优选，化合物是基本上纯化的形式。本发明的化合物可以通过已知的化学方法合成。在某些情况下，化合物可以从象白蚁属白蚁中基本上提纯。
更优选，化合物从澳桉象白蚁(Nasutitermes exitiosus)的兵蚁中基本上提纯。在其它情况下，本发明的化合物是通过在从天然来源例如从白蚁处获得的化合物上进行标准化学反应得到的，然后进行官能化，得到所需要的化合物。
优选，盐是药学/兽医学可接受的盐。式(1)化合物的合适的药学/兽医学可接受的盐包括无毒盐，例如酸加成盐例如无机酸加成盐(例如盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，等等)、有机酸加成盐(例如甲酸盐，乙盐酸，三氟乙酸盐，等等)，与氨基酸成的盐(例如精氨酸盐，等等)，金属盐例如碱金属盐(例如钠盐，钾盐，等等)和碱土金属盐(例如钙盐，镁盐，等等)，铵盐，有机碱加成盐(例如三甲胺盐，三乙胺盐，等等)等等。
本发明的化合物还包括不同的晶体形式。
本发明的化合物还包括本文中通过具体分子式表示的异构体。这些异构体包括旋光异构体，立体异构体和几何异构体。
在另一个方面，本发明提供了治疗患者的微生物感染或疾病的药学和/或兽医学制剂，所述制剂包括了与合适的药学/兽医学可接受的赋形剂混合的按照式(1)至(3)的任一项的化合物。
在进一步方面，本发明提供了组合物，包括与至少一种稀释剂的混合的按照本发明的化合物。
本发明的化合物具有抗微生物活性，并因此可有效用作例如人类或兽医学或水生物的抗生素，用作工业或其它工艺中的防腐剂/消毒剂，农药，或用作食品防腐剂。
由此，在进一步方面，本发明提供了一种治疗或预防患者的微生物感染或疾病的方法，方法包括给予患者有效量的、具有下式的化合物
式(1) 其中化合物在选自C1和C14、C9和C10、C7和C8的碳原子之间包括至少一个双键；和其中；每个 独立地表示单或双键或环氧键，和(i)取代基A1至A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基，低级醇基团，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基，或(ii)任何一个或多个取代基对A1和A2，A1和A3，A2和A3，A2和A4，A3和A4，A3和A5，A4和A5，A4和A6，A5和A6，A5和A7，A6和A7，A6和A8，A7和A8，A7和A9，A8和A9，A8和A10，A9和A10，A9和A11，A10和A11，A10和A12，A11和A12，A11和A13，A12和A13，A12和A14，A13和A14，A1和A13，A1和A14，和A2和A14形成取代的或未取代的杂环基团，其中任何取代基(包括A15和A16，不形成取代或未取代的杂环)独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基团，低级酰氧基，低级醇基，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基；和其中A1或A7可以不存在；和其中任何一个A2，A3，A5，A6和A8至A15，可以通过单或双键或环氧键键合至式(1)的环结构；和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物。
还提供了本发明的化合物在制备治疗或预防患者的微生物感染或疾病的药物中的用途。
此外，在另一个方面，本发明提供了用于表面(例如硬表面例如厨房工作台上面，浴室瓷砖等等)或溶液的消毒方法，所述方法包括将所述表面或溶液与有效量的、具有下式的化合物接触式(1) 其中化合物在选自C1和C14、C9和C10、C7和C8的碳原子之间包括至少一个双键；和其中；每个 独立地表示单或双键或环氧键，和(i)取代基A1至A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基，低级醇基团，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基，或(ii)任何一个或多个取代基对A1和A2，A1和A3，A2和A3，A2和A4，A3和A4，A3和A5，A4和A5，A4和A6，A5和A6，A5和A7，A6和A7，A6和A8，A7和A8，A7和A9，A8和A9，A8和A10，A9和A10，A9和A11，A10和A11，A10和A12，A11和A12，A11和A13，A12和A13，A12和A14，A13和A14，A1和A13，A1和A14，和A2和A14形成取代的或未取代的杂环基团，其中任何取代基(包括A15和A16，不形成取代或未取代的杂环)独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基团，低级酰氧基，低级醇基，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基；和其中A1或A7可以不存在；和其中任何一个A2，A3，A5，A6和A8至A15，可以通过单键或双键或环氧键键合至式(1)的环结构；和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物。
本发明的抗微生物化合物对革兰氏阳性和革兰氏阴性两种细菌、以及真菌和原生动物是有效的。
还提供了包括本发明化合物的试剂盒。试剂盒优选进一步包括稀释剂，稀释剂或者是在与化合物的混合物中的，或者可以在独立的小瓶中，由此可以在使用之前与化合物混合。
优选，以适合于施加或给予动物或植物的组合物形式提供化合物。
在进一步的实施方案中，试剂盒包括其它抗微生物化合物，例如在WO 01/90035中描述的那些。
优选，试剂盒进一步包括试剂盒的信息和/或使用说明书。
显而易见的，本发明的一个方面所优选的特色和特征适用于本发明的许多其它方面。
贯穿说明书的词“包括”、或变型例如“包括(s)”或“包括(ing)”，可理解为包括所述的要素、整数或步骤，或一组要素、整数或步骤，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或一组要素、整数或步骤。
在下文中，通过下面的非限制性实施例和参考附图描述本发明。
附图的简要说明
图1从澳桉象白蚁兵蚁(N.exitiousus soldier)制备的抗微生物提取物的反相HPLC谱图。
图2从澳桉象白蚁工蚁制备的非活性提取物的反相HPLC谱图。
图3通过反相HPLC的化合物P的纯度。
图4化合物P的质子核磁共振谱(在CDCl3中)。
图5化合物P的APT谱图(在CDCl3中)。
图6化合物P的COSY谱图(在CDCl3中)。
图7化合物P的HMQC谱图(在CDCl3中)。
图8化合物P的HMBC谱图(在CDCl3中)。
图9化合物P的NOESY谱图(在CDCl3中)。
发明的详细说明定义术语“低级”是指具有1，2，3，4，5或6个碳原子的基团，除非另有规定。
在术语″低级烷氧基″、″低级烷硫基″、″低级烷基氨基″、″低级烷基磺酰基″、″低级烷基亚磺酰基″和″低级烷基磺酰氧基″中的合适的“低级烷基”和低级烷基部分可以是直链或支链的，例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，己基等等。
合适的“低级链烯”基团包括但不局限于，CH2，CHCH3，CHCH2，CHCHCH3等等。此外，合适的“低级炔”基团包括但不局限于，CCH，CCCH3等等。
合适的“低级烷氧基”基团包括但不局限于，甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，叔丁氧基等等。
合适的“低级羧基”包括，但不局限于，羧基，羧甲基，羧乙基，羧丙基，羧异丙基，羧丁基，羧异丁基，羧基叔丁基等等。
合适的“低级醛”基团包括但不局限于，选自例如甲醛，乙醛，丙醛、异丙醛，丁醛，异丁醛，叔丁醛等等的醛基。
合适的“低级酮”基团包括但不局限于，选自例如乙酮，丙酮等等的酮基。
合适的“低级酯”基团包括，但不局限于，甲酸酯，乙酸酯，丙酸酯，异丙酸酯，丁酸酯，异丁酸酯，叔丁酸酯等等。
合适的“低级酰氧基”基团包括，但不局限于，乙酰氧基，丙酰氧基，丁酰氧基等等。
合适的“低级醇”基团包括，但不局限于，甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，异丁醇，叔丁醇等等。
合适的“低级烷硫基”基团包括，但不局限于，甲硫基，乙硫基，丙硫基，丁硫基等等，和低级烷硫基取代的低级烷基例如甲硫基甲基，甲硫基乙基，甲硫基丙基，甲硫基丁基，乙硫基甲基，乙硫基乙基，乙硫基丙基，乙硫基丁基等等。
合适的“低级烷基氨基”基团包括，但不局限于，甲氨基，乙氨基，丙氨基，丁氨基等等，和单或二(低级烷基)氨基取代的低级烷基例如甲氨基甲基，甲氨基乙基，甲氨基丙基，甲氨基丁基，乙氨基甲基，乙氨基乙基，乙氨基丙基，乙氨基丁基，二甲氨基甲基，二甲氨基乙基，二甲氨基丙基，二甲氨基丁基，二乙氨基甲基，二乙氨基乙基，二乙氨基丙基，二乙氨基丁基等等。
合适的“低级烷基磺酰基”基团包括，但不局限于，甲磺酰基，乙磺酰基，丙磺酰基，丁磺酰基等等。
合适的“低级烷基亚磺酰基”基团包括，但不局限于，甲基亚磺酰基，乙基亚磺酰基，丙基亚磺酰基，丁基亚磺酰基等等。
合适的“低级烷基磺酰氧基”基团包括，但不局限于，甲基磺酰基氧基，乙基磺酰基氧基，丙基磺酰基氧基，丁基磺酰基氧基等等。
合适的取代或未取代的杂环基团包括，但不局限于，具有5至8个原子(包括由式(1)结构贡献的2-3个碳原子在内)的碳和氧主链的基团，包括环状缩醛和环状碳酸酯。这样的杂环基团可以被一个或多个OH、O、SH、NH2、低级烷基、低级链烯、低级炔、低级烷氧基、低级羧基、低级醛基、低级酮基、低级酯基、低级酰氧基、低级醇基、低级烷硫基、低级烷氨基、低级烷基磺酰基、低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基所取代。
本文中提供的通式(1，2和3)描述了形成环状结构的碳原子，如碳1至16。如本文中所定义的，通式代表的化合物可以包括进一步的、作为取代基A1至A16一部分的碳原子。对于本文中提供的特殊的化合物和“碳骨架”(例如，化合物P，Q，R，S，T和U；和碳骨架V，W，X和Y)，这些进一步的碳原子被具体地编号。例如，在式(1)的A8位的甲基，在化合物R中表示为C19。当涉及现有技术分子时，使用类似的碳编号系统。例如，作为技术人员可能会知道，7(8)，11(12)，15(17)-trinervitatriene-2α，3α-二醇通常在式(1)中表示为7(8)，11(12)，15(A15)-trinervitatriene-2α，3α-二醇。
本文中使用的术语“基本上提纯”是指，已经与天然状态下和化合物相关的脂类、核酸、多肽及其它污染分子分离的化合物。优选，基本上提纯的化合物从与其天然相关的组分中至少释放出60％，优选至少释放出75％，最优选释放出至少90％。
化合物的“有效量”是必需或足够治疗或预防抗微生物生长的量。有效量可以根据如患者的身材和重量、疾病类型、微生物浓度等等这样的因素变化。普通技术人员能够研究上述因素，并且不用过多的实验就可以完成有效量的测定。
该“患者”可以是任何易于遭受微生物特别是细菌感染的生物机体。优选患者是脊椎动物或植物。更优选，脊椎动物是鱼、鸟或哺乳动物。更优选，哺乳动物是人类、家畜动物(例如羊，母牛，马，山羊，等等)或陪伴动物(例如猫，狗等等)。
分离，衍生化和合成至少一些本发明的化合物是天然存在的、已经从当地的澳洲白蚁处获得的trinervitanes，并且可能在其它国家存在相同的相关物种。较大数量的、治疗用途需要的这些和相关的天然trinervitanes，可以从合适白蚁的培养群体处获得，或者由实验室合成所需要的化合物。天然原料的类似物，即本文描述的类型，可以从天然原料进行化学转化得到，或者通过全合成得到，如果这样的途径可能更有效的话。
利用Robinson增环反应和McMurry偶合，已经实现了trinervitane双萜的三环母核的合成，得到在1(15)、8(9)或1(15)、8(19)位带有烯烃官能团的、氧化的trinervitadiene产物[21]。此外，在7(8)、11(12)、15(17)-位带有烯烃官能团的trinervitatriene-2，3-二醇已经通过化学模型试验所建议的这种天然产物[10，22，23]的生源途径进行合成。使用本领域熟知的和在文献[参见例如28，29]中描述的化学反应对这些路线扩展或改型，或者再次使用本领域熟知的在文献[参见例如28，29]中描述的化学反应对有目的设计的合成路线进行发展，可方便地得到天然trinervitanes和其类似物。
抗微生物组合物和其用途本发明的化合物具有抗微生物活性，并因此用作例如人类或兽医学或水生物的抗生素，在工业或其它工艺中的防腐剂/消毒剂，农药(包括可以施用于植物以控制微生物感染的那些组合物)，或食品防腐剂。进一步的应用包括，但不局限于，在环境状态下抑制微生物病原体的生长，减少或防止包括洗涤液、油膏等等医学媒介的微生物集群现象。
还提供了一种处理/(消毒和清洁)医学内置器械的方法，包括给予有效量的、包括本发明化合物的组合物。这些器械可优选包括，例如，任何内置器械例如导管、整形外科器械和植入物。
按照本发明的化合物可用于对付导致不同传染病的大量微生物，并可有效用于预防、减轻或医治由这些病原体所引起的疾病。
本发明化合物能有效对抗的细菌或细菌类微生物的例子包括，但不局限于，杆菌例如枯草杆菌，炭疽杆菌，蜡样芽胞杆菌；葡萄球菌例如酿脓链球菌，溶血性链球菌，粪链球菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌；消化链球菌例如淋病奈瑟菌，大肠杆菌，柠檬酸细菌种，志贺菌属种，肺炎杆菌，肠细菌属种，沙雷氏菌属种，变形菌种，铜绿假单胞菌，流感脑膜炎杆菌，不动杆菌属种，弯曲杆菌属种，和衣原体属种例如沙眼衣原体和肺炎衣原体。
可以使用本发明的方法治疗或预防微生物的感染或疾病，这些感染或疾病选自例如包括外科创伤的创伤细菌感染、肺感染(例如肺结核)、皮肤感染和全身细菌感染。例如，可以用本发明的抗微生物化合物治疗或预防的疾病包括，但不局限于，炭疽热，食物中毒，毛囊炎，疖，痈，丹毒，蜂窝织炎，淋巴管炎/淋巴腺炎，瘭疽，皮下脓肿，汗腺炎，痤疮聚集，感染性的粉瘤，肛周脓肿，masitadenitis，外伤之后浅表的继发感染，灼伤或手术外伤，咽喉炎，急性支气管炎，扁桃腺炎，慢性支气管炎，支气管扩张，弥漫性细支气管炎，继发感染的慢性的呼吸系统疾病，肺炎，肾盂肾炎，膀胱炎，前列腺炎，附睾炎，淋菌性尿道炎，非淋菌性尿道炎，胆囊炎，胆管炎，细菌性痢疾，肠炎，子宫附件炎，子宫内的感染，前庭大腺炎，睑炎，睑腺炎，泪囊炎，睑板腺炎，角膜溃疡，中耳炎，窦炎，牙周病，冠周炎，颌炎，腹膜炎，心内膜炎，败血病，脑膜炎，和皮肤感染。
本发明的化合物还对导致兽医学疾病的不同微生物有效，例如属于埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、巴斯德氏菌属、嗜血杆菌属、博代菌属、葡萄球菌属和支原体属的那些微生物。兽医学疾病的说明性例子包括家禽的疾病，例如大肠杆菌病，鸡白痢病，鸟类的paratyphosis，禽霍乱，传染性鼻炎，staphylomycosis，和支原体病；猪的疾病，例如大肠杆菌病，沙门氏菌病，巴斯德氏菌病，嗜血杆菌感染，萎缩性鼻炎，渗出性表皮炎，和支原体病；牛的疾病，例如大肠杆菌病，沙门氏菌病，出血性败血症，支原体病，牛触染性胸膜肺炎，和牛乳腺炎；狗的疾病，例如大肠杆菌性脓毒病，沙门氏菌病，出血性败血症，子宫积脓，和膀胱炎；猫的疾病，例如渗出性胸膜炎，膀胱炎，慢性鼻炎，和嗜血杆菌感染；和小猫的疾病，例如细菌腹泻和支原体病。
本发明还提供了一种治疗和/或预防寄生虫感染的方法，特别是由原生虫寄生虫引起的感染。包括在原生虫寄生虫之中的是贾第鞭毛虫属，毛滴虫属，利什曼虫属，锥虫属，短膜虫属，匐滴虫属，细滴虫属，组织滴虫属，艾美球虫属，等孢属(Isopora)和疟原虫属的那些寄生虫。由疟原虫属所引起的寄生虫感染的例子是疟疾。
本发明还提供了一种治疗和/或预防真菌感染的方法。这种真菌感染(真菌病)可以是，例如，皮肤、皮下或全身感染。浅表真菌病包括头癣，体癣，脚癣，甲真菌病，perionychomycosis，花斑糠疹，口腔鹅口疮，及其它念珠菌病(candidoses)例如阴道、呼吸道、胆、eosophageal，和尿路念珠菌病(candidoses)。全身的真菌病包括全身和粘膜皮肤念珠菌病，隐球菌病，曲霉病，毛霉菌病(藻菌病)，巴西芽生菌病，北美芽生菌病，组织胞浆菌病，球孢子菌病，和孢子丝菌病。真菌感染包括由瓜枝孢，絮状表皮癣菌，烟曲霉，及其它曲霉属，酒曲菌属和Microspermum ypseum引起的感染。
本领域技术人员将认识到，可以将本发明的化合物有效地并入到不同范围的组合物中。例如，可以将化合物配制，以便用于给予动物，包括人类，或并入个人护理包括身体护理和口腔护理产品例如除臭剂、皂、洗发剂、牙膏、嗽口水等等产品的范围中。用于本发明方法的合适的制剂，可以由熟练的技术人员、利用标准方法很容易地制备。
本发明还提供了一种用于清洁表面例如硬表面、织物或非织物表面的清洁组合物。本发明的组合物可以清洁和/或清洗的表面的例子包括抽水马桶，浴盆，排水管，高椅，台面(例如暴露于肉，蔬菜的)，肉类加工房间，肉店，通风道，空调器，地毯，纸或织物产品处理，尿布和有益健康的通风机。
清洗产品可以是以卫生间滴剂的形式，用于防止和除去污染，并在卫生间清洁器的边缘下。
在另一个实施方案中，组合物用作洗涤液，特别是用于隐形眼镜的清洗成分中。由此可以通过给予包括有效量的本发明的化合物，将隐形眼镜清洗和消毒。
可以将本发明的化合物结合到个人护理产品和皮肤护理产品中。本发明的化合物可以在表皮绷带和洗剂的制备中使用。在另一个可选择的实施方案中，可以将本发明的化合物加入到刮脸后的修复水或洗剂中。
本发明的药学和/或兽医学制剂包括合适的“赋形剂”，这样就可以将制剂给予动物，优选人类。
还提供的是可以施用于植物而对植物没有不利影响的组合物。
在另一个方面，组合物可以包括合适的稀释剂，其中组合物实际上可能对例如动物是有毒的。这种组合物可以用于工业装置的表面消毒等等。合适的稀释剂为本领域技术人员所熟知。
在一个实施方案中，将本发明的化合物配制成乳状液。乳状液是包括两个不互溶液体或“相”例如油和水的精细分配或胶态的分散体，其中一种(内相或不连续相)在另一种(外相或连续相)之内分散成小滴。由此，水包油型乳状液由作为内相的油和作为外相或连续相的水构成，油包水乳剂则相反。
可以利用标准微液化技术形成包括本发明的化合物的多种乳化系统，包括标准乳状液和微滴乳状液。
通常，乳状液包括油相和水相，乳化剂，乳液稳定剂，和任选的增稠剂，防腐剂，着色剂，调味剂，pH值调节剂和缓冲剂，螯合剂，维生素，防泡沫剂，张力调节剂和抗氧化剂。合适的乳化剂包括(其中括号数字指的是优选的亲水亲油平衡值(HLB))离子表面活性剂例如醇醚硫酸盐，烷基硫酸盐(30-40)，肥皂(12-20)和磺基丁二酸盐；阳离子表面活性剂例如季铵化合物；两性离子表面活性剂例如烷基甜菜碱衍生物；两性表面活性剂例如脂肪族胺硫酸盐，二脂肪族胺硫酸盐，二脂肪族烷基三乙醇胺衍生物(16-17)；和非离子型表面活性剂例如脂肪族或环脂族醇、饱和脂肪酸和烷基酚的聚乙二醇醚衍生物，水溶性聚乙烯氧基在聚丙二醇和烷基聚丙二醇上的加合物，壬基酚聚氧乙醇，蓖麻油聚乙二醇醚，聚丙烯/聚氧化乙烯加合物，三丁基苯氧基聚乙氧基乙氧基-乙醇，lanothin醇，多乙基的(POE)烷基酚(12-13)，POE脂肪酸酯poloxamers(7-19)，POE乙二醇单醚(13-16)，聚山梨酸酯(17-19)和脱水山梨醇酯(2-9)。这些列举并不是用来穷举的，因为其它乳化剂也是合适的。
在另一个实施方案，将本发明的化合物配制成包括与水混溶性溶剂的水溶液组合物。这种与水混溶性溶剂的例子包括，但不局限于，乙醇，异丙醇，二乙二醇单甲醚，二乙二醇丁基醚，二甘醇单乙醚，二乙二醇二丁醚，聚乙二醇-300，聚乙二醇-400，丙二醇，甘油，2-吡咯烷酮，N-甲基2-吡咯烷酮，甘油甲缩醛，二甲亚砜，二丁基癸二酸酯，聚山梨酸酯80，和其混合物。
按照给药途径恰当选择含有本发明化合物的药物制剂的剂型，并通过常规的制备方法制备。典型地，将化合物配制成通过通常使用的途径例如口腔、鼻、直肠、阴道、肌肉内、静脉内给药途径的任一项给予。
为了方便起见，优选将用于人类或兽医学用途的化合物配制成口服剂型，其中化合物或其药学/兽医学可接受的盐，可以与通常已知的结合原料和赋形剂混合。用于口服剂型的例子包括片剂，粉末，颗粒剂，胶囊，溶液，糖浆，酏剂，和油状或水悬浮液。可以直接口服给予动物化合物，或通过与饲料混合给予，或以溶解的形式直接给予动物，或通过与水或饲料混合给予。
可注射的制剂可以含有助剂，例如稳定剂，杀菌剂，和增溶剂。可以将含有这些助剂的可注射溶液放入容器中，并通过例如冷冻干燥进行固化，以制备使用时可以溶解的固体制剂。容器可以含有单一剂量或多剂量。
外用制剂包括溶液，混悬剂，乳状液，油膏，凝胶剂，乳膏剂，洗剂，和喷雾剂。
固体制剂可以含有，除活性化合物之外，可药用的添加剂。例如，将活性化合物与按照需要选自填料、膨胀剂、粘合剂、崩解剂、吸收促进剂、增湿剂和润滑剂的添加剂混合，并配制成固体制剂。
液体制剂包括溶液，悬浮液和乳状液。它们可以含有助剂，例如悬浮剂、乳化剂等等。
对于兽医学用途，可以将化合物按照本领域常规方法配制成粉末，微粒剂，可溶性粉剂，糖浆，溶液，和注射液。
用作人类的药物时，一个成年人每天的化合物剂量可以在1mg至1g范围之内，优选100mg至300mg。
对于兽医学用途，每千克体重每天的剂量通常在1至200mg范围内，优选5至100mg，同时根据施用目的(用于治疗或用于预防)、动物的种类和大小、致病生物的种类和症状的严重度来变化，。
以上所述的每天剂量可以一天一次给予，或以2至4份分开的剂量给予。如果需要的话，日剂量可以超过上述特定范围。
实施例方法和原料粗提物的筛选在生物测试中，以浓度4.0mg/毫升的长鼻兵尉白蚁物种澳桉象白蚁(Hill)(等翅目白蚁科)的工蚁和兵蚁的提取物对抗枯草杆菌(ATCC菌株6633)进行筛选。该试验是由WO 01/90035中描述的一种试验的改型，将其设计成能够检测弱抗微生物活性。在现行使用的试验与先前描述的试验(WO 01/90035)之间唯一的差别是，在现行的情形中，Luria-Bertani琼脂培养基中的细菌细胞密度比以前的说明书中描述的低十倍。改进的试验比最初的方法灵敏大约2.5倍。
通过反相HPLC进行抗微生物组分的分离将十二毫升澳桉象白蚁兵蚁的70％甲醇提取物(含有86mg溶解物)通过反相HPLC分离，使用半制备柱、以4ml/min的流速、和用含有0.05％(v/v)三氟乙酸的水至100％乙腈的梯度洗脱20分钟，然后用100％乙腈进一步洗脱15分钟。在230nm处监测洗脱液的UV吸光度。于35分钟内收集各馏份。将各批次重复分离的相应的馏份集中，在氮气下将集中的馏份蒸发至干。将馏份的残余物再溶解在HPLC级水(从1-8分钟的馏份)、70％的甲醇水溶液(9-15分钟)、或甲醇(16-35分钟)中。测定相当于20μL粗提物的一定量的各个合并馏份对枯草杆菌的抗微生物活性。
三个馏份显示了抗微生物活性，F1(22-23分钟)，F2(23-23.5分钟)，和F3(23.5-24分钟)，并通过HPLC、质谱和核磁共振波谱学加以分析。
HPLC是System Gold，Model 126，Beckman Instruments，Inc.，USA。
半制备柱为250×10mm C18 ODS-AQ，5μm，由YMC Co.Ltd制造，并来源于Sapphire Biosciences，Australia。
通过反相HPLC进行的纯度评价将10μl所选择的馏份或20μl的粗提物注射到分析用反相HPLC柱上。利用如上所述相同的洗脱条件，以0.55ml/min的流速洗脱吸附的原料。通过在230nm处UV吸收和通过在95℃操作的汽化光线散射探测器(ELSD)监测洗脱液。
分析柱为250×3mm C18 ODS-AQ，5μm，由YMC Co.Ltd制造，并来源于Sapphire Biosciences，Australia。
通过反相HPLC进行的抗微生物组分F2的分离将从澳桉象白蚁的兵蚁的提取物中分离的活性馏份F2，进一步通过半制备反相HPLC分离，利用无梯度洗脱，使用乙腈∶水(含有0.05％(v/v)三氟乙酸)55∶45洗脱50分钟。收集四个在保留时间24-26.5分钟、30-32分钟、34-36分钟和36.5-39分钟下洗脱的UV吸收峰的馏份。这些馏份中只有一种，即24-26.5分钟的洗脱物，是生物学活性的。将其蒸干用于进一步分析。
据1H NMR谱(没有显示)指示，在无梯度分离后，在24和26.5分钟之间洗脱的生物学活性的细馏份仍然是至少两个化合物的混合物。使用相同的等浓度系统，即乙腈∶水(0.05％(v/v)三氟乙酸)55∶45，将次馏份进一步分离，但在这种情况下洗脱30分钟。收集两个在保留时间19.3-21.5分钟和23-26分钟洗脱的、表示为Q和R的两个UV吸收峰的馏份。这些馏份的每个都是生物学活性的，将其蒸干用于进一步分析。
通过反相HPLC进行抗微生物组分F3的分离将从澳桉象白蚁的兵蚁的提取物中分离的活性馏份F3(其不是纯的化合物)，进一步通过半制备反相HPLC分离，使用半制备柱，利用无梯度洗脱，使用乙腈∶水(含有0.05％(v/v)三氟乙酸)55∶45洗脱50分钟。收集四个在21-23分钟、23-24.5分钟、25-27分钟和30-32分钟的保留时间下洗脱的UV吸收峰的馏份。分别含有指定为S、T和U的化合物的第一、第二和第四个洗脱馏份是生物学活性的，将其蒸干用于进一步分析。
结果在改进的生物测试中，从澳桉象白蚁的工蚁制备的提取物是非活性的，而同样物种的兵蚁的提取物给出了15mm直径的透明区。两个提取物在HPLC上的UV和ELSD(没有显示)谱图，从定性方面看在保留时间0-21分钟之间是非常类似的，尽管相应的峰高度不同(比较图1和2)。然而，在保留时间22和27分钟之间两个提取物的差别较大。在兵蚁的提取物中，在该区域通过230nm的UV吸光度检测出几个主峰(图1)，但在澳桉象白蚁的工蚁提取物中没有相应的峰出现(图2)。预计Trinervitane衍生物在该区域可能产生位移。
如在材料和方法中所述，在12mL澳桉象白蚁兵蚁的提取物的分离后，三个馏份F1、F2和F3显示了抗微生物活性。在抗微生物试验中，F1给出4mm直径的不明显的透明区域，F2给出6mm直径的不明显的透明区域，F3含有最高水平的活性，给出9mm直径的非常透明的区域。用HPLC、质谱和NMR谱分析三个馏份。
抗微生物的trinervitatetraene P的结构发现抗微生物馏份F1含有纯化合物，表示为P，如HPLC分析(图3)和1H NMR谱所示(图4)。
可获得大约3毫克的化合物P。化合物的ESMS显示出分别在m/z323和623处的离子，相当于分子量300amu的物种的结合钠的单体和二聚型。EIMS在m/z 300处显示了一个分子离子，并且由于失去一个水分子，在m/z 282处显示了一个子离子。HREIMS确定的分子式为C20H28O2。
APT谱确定了所有20个碳原子的类型和其取代的程度。然后通过HMQC谱，将质子共振对相应的碳原子进行归属，如表1所列。
表1.化合物P的13C和1H NMR谱数据(CDCl3)。
aCOSY谱数据。
bHMQC谱数据。
APT谱(图5)在δ149.7，141.8，137.8，132.4，130.1，124.6，120.3和108.1处确定了八个烯碳原子。由于没有其它不饱和的碳原子，化合物P必定是三环的。在1H NMR谱(图4)中发现的两对烯烃质子，δ5.27和4.97，以及5.05和4.76，通过HMQC谱(表1)显示其与分别为两个亚甲基基团＝CH2的δ120.3和108.1的碳相连。这些数据和分子式表示该化合物具有8(19)、15(17)-trinervitadiene碳架V，其带有两个额外烯键和两个羟基。先前没有报道过具有分子式C20H28O2和碳架V的化合物。
在1H NMR谱中，化合物P显示三个进一步的烯烃质子，δ5.70，5.58，和5.48。通过HMQC谱(表1)确定这些质子和在APT谱中看到的δ132.4、130.1和124.6的烯烃碳之间的连接，其为三个烯烃的次甲基碳(＝CH-)。两个质子，δ5.70和5.58，相互偶合，J＝15.0，表示E-二取代的烯烃[3]，其通过COSY谱(图6)证明。在APT谱中看到的两个带有次甲基碳的羟基-CHOH-(δ79.0和73.0)，通过HMQC谱，与两个在1H NMR谱中的δ3.51和3.90的中场共振态相连。通过COSY谱印证了两个质子信号相互耦合，J＝10.5，表明邻接的二醇链段-CH(OH)CH(OH)-。
碳架V COSY谱证实了次甲基质子δ2.66与相邻的次甲基质子δ2.82偶合，J＝8.0，然后形成一个直链6-自旋系统-CHCHCH2CH2，带有两个连续的亚甲基δ1.97和1.83、和2.12和1.58的质子。烯烃质子δ5.58与相邻的亚甲基质子δ2.20和1.61偶合，其又完成11-自旋系统-CH＝CHCH2CH(CH3)CH2CH＝，带有δ1.70(1.01)、2.46和1.84和5.48处的连续的质子。这些6-和11-自旋系统分别清楚地在碳架V中构成5元环和中间环的C-16，7，6，5和C-9至C-14片段。中间环的片段通过远程耦合来定向的。根据在COSY谱中看到的δ5.70和亚甲基质子δ5.05和4.76之间的烯丙基偶合，将烯烃质子δ5.70定位于C-9处，其又与C-7处的次甲基质子δ2.82进行烯丙基(allylically)偶合。根据在COSY谱中看到的δ5.48和3.90之间的烯丙基的偶合，将烯烃质子δ5.48定位于C-14，δ3.90是邻接的二醇(-CH(OH)CH(OH)-)的质子，其显然是6元环的C-2，3片段。
碳架V和所有上述片段之间的联系的结论性证据，可以从HMBC谱(图8)观察到的远程H-C相关性获得。特别是，五和六元环中的取代基的位置可由CH(OH)-3和C-1、C-5和C-18、CH3-18和C-3、C-5和C-16、CH-7和C-4和C-5、CH-16和C-3和C-17、CH-9和C-11、CH2-17和C-16、和CH3-20和C-13之间的3-键偶合得到。中间环至5元环的联结点可由CH-7、CH-9和CH2-19之间的相应的3-键H、C偶合与CH-16和C-8之间的偶合得到。中间环系至6元环系的联结点可由CH-14和C-15和CH-16和C-1之间的3-键H、C偶合得到。由此确定化合物P为9E-1(14)，8(19)，9(10)，15(17)-trinervitatetraene-2，3-二醇，除了在9(10)的链烯之外，不考虑立体化学。先前没有报道trinervitatetraene。
P的立体化学通过NOESY(图9)和GOESY谱研究。两种类型的NOE谱显示了CH-7、CH-16和CH3-18之间的接近性，并假设它们为按照正常碳架Vα-取向的。在CH-2和CH3-18之间，还观察到相互的overhauser效应，表明CH-2为α-取向，由此在C-2的羟基为β-取向。由邻接的偶合常数值和从文献[4]的数据类推，推断出C-3处的羟基构型。数值J2，3＝10.5Hz表明在C-2和C-3的质子的反式双轴向排列(这种反式-二醇具有J2，3＝8.0-10.0Hz，而顺式-二醇具有J2，3＝4.5-5.0Hz[4-6])。因此C-3处的羟基是α-取向。在C-12处没有看到CH3相关性，但根据所有报道的trinervitanes[4，7]的C-12处甲基，假设它为α-取向。
已经假定所有报道的trinervitanes具有碳架V中描述的绝对构型[8，9]。因此还假定通过overhauser效应所定义的P的相对构型代表绝对构型，即，如在结构P中的9E-1(14)，8(19)，9(10)，15(17)-trinervitatetraene-2β，3α-二醇。
新的抗微生物化合物Q的结构馏份F2是混合物，按照在HPLC上表明的四个峰，其含有至少两种主要的和两种次要的组分，并且在1H NMR谱中是明显的混合物。将馏份进一步分离为两个主要的生物学活性组分(如原料和方法中所述)，用Q和R表示，其在改进的抗微生物试验(原料和方法)中分别给出直径4mm和5mm的透明区。根据1H NMR谱判断，这些化合物是纯的。
化合物P 得到估计0.5mg的化合物Q。在m/z 302处，EIMS显示了一个分子离子，在m/z 284处，由于损失一个水分子，显示了一个子离子。HREIMS确定分子式为C20H30O2。
APT谱所定义的四个烯碳原子在δ138.0，123.8，118.4和106.7处(表2)。五个烯烃的质子，δ5.55，5.22，498，4.91和4.79，在1H NMR谱中是明显的(表2)。两对烯烃质子(表2)，δ5.22和4.98，和4.91和4.79，通过HMQC谱显示，分别作为两个亚甲基基团＝CH2连接至δ118.4和106.7碳(表2)。第五个烯烃质子δ5.55没有与这些亚甲基质子耦合，但通过HMQC谱显示，其作为烯烃的次甲基基团(＝CH-)连接至δ123.8碳(表2)，意味着在该化合物中存在三个链烯。由此化合物Q是三环的。这些数据和分子式一起表示化合物具有带有一个额外的烯键和两个羟基的8(19)，15(17)-trinervitadiene碳架V。先前没有报道具有分子式C20H30O2和碳架V的化合物。
1H NMR谱显示在δ3.93和3.76处两个中场的共振(表2)。在APT谱中看到的两个带有次甲基碳的羟基-CH(OH)-(δ73.9和77.0)，通过HMQC谱连接到δ3.93和3.76处的共振(表2)。两个质子的信号相互耦合，J＝10.0，其通过COSY谱证明，暗示存在邻接的二醇片段-CH(OH)CH(OH)-。COSY谱(表2)确定，次甲基质子δ5.55与相邻的、在δ2.63和1.99处的亚甲基质子偶合，形成片段＞C＝CH-CH2-。在COSY谱中看到，在δ1.99和3.93的质子之间的高烯丙基偶合，意味着片段-CH(OH)CH(OH)-C＝CH-CH2-，其显然构成碳架V的C-3、2、1、14、13片段。由于两个化合物的相应的碳原子在类似的化学环境中，通过和P比较(δ52.0和60.7)，在APT谱中看到的两个次甲基碳(δ51.1和61.3)被确定为C-7和C-16。由于在大约δ2.65、2.20和在δ1.2-1.7区域的重叠质子信号，COSY谱很复杂，不能提供进一步有效的相关性。
表2.化合物Q的13C和1H NMR谱数据(在CDCl3中)。
bHMQC谱数据。
cHMBC谱数据。
u未加分析的数据。
骨架V的存在和所有上述片段之间关系的结论性证据，是从许多由HMBC谱记录的远程H、C相关性获得的。特别地，在6，5-元环中取代基的位置，是由CH(OH)-3和CH3-18之间的相应的3-键H、C偶合、CH3-18和C-16、和CH2-17和C-16之间的偶合得到的。中间环至5元环系的联结点可由CH2-19和C-7之间的3-键H、C偶合得到。间环至6元环系的联结点可由CH2-17和C-1之间的偶合得到，证实了片段-CH(OH)CH(OH)-C＝CH-CH2-。由此确定化合物Q是1(14)，8(19)，15(17)-trinervitatriene-2，3-二醇，不考虑立体化学。
通过NOESY和GOESY谱研究Q的立体化学。两种类型的NOE谱显示了CH-2和CH3-18，和CH-7和CH-16之间的接近性。根据碳架V，当CH-7、CH-16和CH3-18被假设为α-取向时，由此CH-2是α-取向，在C-2处的羟基是β-取向。C-3处的羟基构型可由其邻接的偶合常数和从类似的文献数据加以推断[4]。数值J2，3＝10.0Hz表明在C-2和C-3处质子的反式-双轴向排列(这种反式-二醇具有J2，3＝8.0-10.0Hz，而顺式-二醇具有J2，3＝4.5-5.0Hz[4-6])。因此，在C-3处的羟基是α-取向。这是通过将C-2和C-3处质子的化学位移与具有2β，3α二醇官能团的化合物P的化学位移相比较来确定的。C-2处δ3.93质子与P(δ3.90)的质子相似，同时C-3处δ3.76质子移位0.25ppm至比P的质子更低的区域，这可能是由于缺乏P中的9(10)-链烯的屏蔽。在化合物P中，CH-3和烯烃质子CH-9之间的接近性通过NOESY谱显示。没有看到化合物Q中的C-12处的CH3相关性，但根据所有先前报道的trinervitanes[4，7]，它被假设为α-取向。
正如先前所讨论的，已经假定所有报道的trinervitanes具有碳架V中描述的绝对构型[8，9]。因此还假定由overhauser效应定义的化合物Q的相对构型代表绝对构型，即，如在结构Q中的1(14)，8(19)，15(17)-trinervitatriene-2β，3α-二醇。
化合物Q 新的抗微生物化合物R的结构通过F2的再次分级得到估算0.3毫克纯化合物R(原料和方法)。EIMS显示了在m/z 302处的一个分子离子，在m/z 284处，显示由于损失一个水分子的一个子离子。HREIMS确定分子式为C20H30O2，与Q是同分异构。
化合物R的NMR数据由于只可获得少量样品而受到限制。1H NMR谱显示只有三个烯烃质子，δ5.51，5.16和4.97，并且在烯烃甲基的δ1.47处有一个宽单峰(表3)。两个烯烃质子，δ5.16和4.97，通过HMQC谱显示，其连接至作为亚甲基基团＝CH2的δ117.0的碳原子(表3)。如COSY谱所示，烯烃质子δ5.51没有与这些亚甲基质子耦合。烯烃甲基信号显示只与质子δ2.89偶合的高烯丙基，但与三个烯烃质子没有相关性，表明此化合物中存在三个链烯，由此其是三环的。
表3.化合物R的13C和1H NMR谱数据(在CDCl3中)。
bHMQC谱数据。
cHMBC谱数据。
u未加分析的数据。
尽管两个烯烃亚甲基(CH2＝)存在于化合物P和Q中，在化合物R中看到只有一个这种亚甲基，可能意味着碳架V中的8(19)处的链烯从＞C＝CH2位移到7(8)处的＞C＝C(CH3)、或8(9)处的-(CH3)C＝CH-，或从15(17)处的＞C＝CH2位移到1(15)或15(16)处的＞C＝C(CH3)-。R(δ117.0)的烯烃亚甲基碳原子的化学位移与P(δ120.3)和Q(δ118.4)的C-17的化学位移相似，但不同于P(δ108.1)或Q(δ106.7)的C-19的化学位移，确定了15(17)-外向亚甲基官能团的存在。如果链烯从8(19)处的＞C＝CH2位移到8(9)处的-(CH3)C＝CH-，可能实现烯丙基的偶合。此外，所得到的烯烃次甲基质子预计与作为双二重峰的两个相邻的烯丙基质子偶合，偶合常数值类似于WO 01/90035的化合物9中所示的6.0和11.0Hz。显然，在R的1H NMR谱中没有这样的质子。δ5.51质子代之以与作为双多重峰的两个相邻的质子偶合，J＝12.0，类似化合物P和Q的C14，13片段＝CHCH2-，表明链烯可能从骨架V的8(19)位移到碳架W中的7(8)。这些数据和分子式表示化合物R具有带有一个额外的烯键和两个羟基的trinervitadiene碳架W[4，8]。一直没有关于具有分子式C20H30O2和骨架W的天然产物的报道，但这种类型的trinervitane先前已经合成[10]。后面的化合物7(8)，11(12)，15(17)-trinervitatriene-2α，3α-二醇的1H NMR特征，与R的那些特征有很大的差别，由此其是一种新的化合物。
碳架W 1H NMR谱显示在δ3.97和3.27处的两个中场的共振(表3)。由HMQC谱可见，带有次甲基碳的两个羟基-CH(OH)-(δ74.4和74.7)与这些共振有联系(表3)。两个质子的信号相互耦合，J＝10.0，由COSY谱证明，表明邻接的二醇片段-CH(OH)CH(OH)-。COSY谱(表3)证实了次甲基质子δ5.51与相邻的亚甲基质子δ2.61和1.80偶合，形成片段＞C＝CH-CH2-。在COSY谱中看到质子δ1.80和3.97之间的高烯丙基偶合，意味着片段-CH(OH)CH(OH)-C＝CH-CH2-，其清楚地构成碳架W的C-3，2，1，14，13片段。在COSY谱中看到δ2.89和烯烃甲基质子δ1.47之间的高烯丙基的偶合，意味着片段CH-C＝C-CH3，其构成骨架W的C-16，7，8，19片段。由此将质子δ2.89归属为C-16的。由于在大约δ2.65、2.20和在δ1.2-2.2区域的质子的重叠信号，COSY谱很复杂，不能提供进一步的相关性。
碳架W的存在和6，5-元环中的连接的结论性证据，是从在HMBC谱中观察到的一些远程H、C相关性获得的，特别是在CH3-18和C-3、C-16、C-5和C-2之间的3-和4-键偶合。中间环至5，6元环的联结点，是由高烯丙基偶合测定的两个片段-CH(OH)CH(OH)-C＝CH-CH2-和CH-C＝C-CH3得到的。由此将化合物R确定为1(14)，7(8)，15(17)-trinervitatriene-2，3-二醇，不考虑立体化学。
化合物R的立体化学通过NOESY和GOESY谱研究。按照碳架W，两种NOE谱显示CH3-18和CH-16之间的邻近性，并假设它们为α-取向。数值J2，3＝10.0Hz表明在C-2和C-3的质子的反式-双轴向排列(这种反式-二醇具有J2，3＝8.0-10.0Hz，而顺式-二醇具有J2，3＝4.5-5.0Hz[4-6])。因此，C-2和C-3的羟基具有构型βα或αβ。J2，3的值与化合物Q的相同，并与化合物P的类似(J2，3＝10.5Hz)，意味着类似2β，3α二醇构型。这是通过比较C-2和C-3的质子与P和Q中相对应的那些的化学位移来确定的。CH-2的数值δ3.97与trinervitanes P(3.90)和Q(3.93)的值相似，而在δ3.27的CH-3位移到比在P(3.51)和Q(3.76)中的更高场，反映了在中间环中链烯排列的改变。在P和Q中，通过分子模型表明的CH-3和烯烃质子CH2-19之间的邻近性，是通过NOESY数据确定的。按照所有报道的trinervitanes[4]中的C-12构型，将C-12的甲基假设为α-取向。
按照先前对R的绝对构型的详述论点，1(14)，7(8)，15(17)-trinervitatriene-2β，3α-二醇的绝对构型假定为所描述的。
在澳桉象白蚁的兵蚁的提取物中鉴定的其它抗微生物的trinervitane衍生物。
根据HPLC上的四个峰值所表明的，馏份F3含有至少三个主要组分和一种微量组分，并且由1H NMR谱可知，其明显地是混合物。将馏份进一步分离为三个主要的抗微生物组分(原料和方法)。根据其1H NMR谱判断，每个组分是纯的。确定化合物为1(15)，8(9)-trinervitadiene-2β，3α-二醇(S)，1(15)，8(9)-trinervitadiene-3α-醇-2-酮(T)，和1(15)，8(19)-trinervitadiene-2β，3α，9α-三醇2，3，9-三乙酸酯(U)。
化合物R 确定化合物S为1(15)，8(9)-trinervitadiene-2β，3α-二醇，因为它与WO 01/90035中的化合物9在反相HPLC上显示了相同的的保留时间，并且具有相同的1H化学位移。在以前的专利说明书中，这种化合物显示具有抗微生物活性。
化合物S 得到估计0.5mg的纯化合物T。EIMS显示在m/z 302处的分子离子，在m/z 287的失去一个甲基的子离子，并且在m/z 269，进一步损失一个水分子。HREIMS确定分子式为C20H30O2。
化合物T的1H NMR谱(表4)显示其中存在甲基共振，其为在δ1.02的单峰、和在0.67和1.42的双峰。在化合物T中没有发现存在于许多trinervitanes例如本发明化合物P、Q和R和WO 01/90035的化合物6、7和8中的烯烃亚甲基质子。然而，在δ4.80处低场可见J＝10.0和5.0的双二重峰，类似于化合物S(见WO 01/90035的表4)的C-9处的烯烃质子的δ5.29、J＝11.0和6.0的双二重峰，表示碳架X中8(9)-烯。这些数据和分子式表示化合物T具有1(15)、8(9)-trirervitadiene碳架X，其带有两个额外烯键和羰基。
化合物T 化合物U
碳架X
表4.化合物T的1H NMR谱数据(苯d6)。
*见参考文献Valterova等[8]。
有四个已知的具有分子式C20H30O2的trinervitanes，包括这里描述的两个新的二醇Q和R、和两个其它化合物1(15)，8(19)-trinervitadiene-3α-醇-2-酮和1(15)，8(9)-trinervitadiene-3α-醇-2-酮。后面的化合物已经从许多亚族象白蚁亚科中的象白蚁属、Longipeditermes、Lacessititermes、Hospitalitermes、Trinervitermes和Grallatotermes白蚁物种中分离出来[4，8，11-19]。化合物T的关键质子共振和公开的1(15)，8(9)-trinervitadiene-3α-醇-2-酮的一致(表4)。T是一种抗微生物化合物，这证实了在WO 01/90035中得出的结论。
得到估计量0.5mg的纯化合物U。化合物的ESMS显示出分别在m/z 469和915处的离子，相当于分子量446amu的物种的结合钠的单体和二聚型。EIMS没有显示出该物质的分子离子，但相反由于损失一个，两个，和三个分子的乙酸而导致的在m/z 386，326，和266处存在子离子。HREIMS确定该组合物的第一个子体离子为C24H34O4，相当于母体分子式为C26H38O6。
化合物U的1H NMR谱(表5)显示甲基的共振为在δ2.04，2.08，2.13和1.08处的四个单峰，在1.74的双峰，和在0.89处J＝6.5的双峰。头三个信号相当于乙酸酯的甲基共振态。该谱显示在δ5.58，5.54，5.52，5.31和5.24处的五个低场质子。在δ5.31和5.24处的信号是单峰，与亚甲基基团＝CH2的质子相似，其典型地在该区域内显示信号。其余三个低场质子可以认为是乙酰氧基次甲基信号-CHOAc-。这些数据和分子式说明化合物T具有1(15)、8(19)-trinervitadiene碳架Y，其带有三个额外乙酸酯基团。
碳架Y
表5.化合物U的1H NMR谱数据(CDCl3)。
*见Valterova等人的参考文献，[8]。
先前已经报道了trinervitadiene三醇的三乙酸酯具有分子式C26H38O6。1(15)，8(19)-trinervitadiene-2β，3α，9a-三醇2，3，9-三乙酸酯公开为WO 01/90035的式10。1(15)，8(19)-trinervitadiene-2β，3α，13α-三醇2，3，13-三乙酸酯和1(15)，8(19)-trinervitadiene-2β，3α，14α-三醇2，3，14-三乙酸酯已经从象白蚁亚科中的许多种类的白蚁物种，象白蚁属白蚁，longipeditermes，lacessititermes，和Hospitalitermes中分离出来[5，12，14-16]。通过化合物U的关键质子共振确定它为1(15)，8(19)-trinervitadiene-2β，3α，9α-三醇2，3，9-三乙酸酯。根据其抗微生物活性可分离出U，在WO 01/90035中预见了其抗微生物活性。
讨论可由澳桉象白蚁兵蚁制造的提取物中制得三环双萜，而在相应的由同样物种的工蚁制造的提取物中则不存在。该结论证实了一种先前的观察结果，即只有白蚁兵蚁可制备trinervitanes[7]。
本文中所描述的工作详细说明了三种新的trinervitanes(P，Q和R)的分离和结构测定，并鉴别了另外得自于澳洲白蚁澳桉象白蚁(N.exitiosus)的三种已知的trinervitanes(S，T和U)。三种新的trinervitanes，尽管具有相对普通的2β，3α二醇氧化模式，但具有先前在具有trinervitane碳骨架的化合物中所没有观察到的结构特征。所有三种新的trinervitanes都具有抗微生物活性。证实了先前观察到的化合物S的抗微生物活性，也证实了先前所预见的化合物T和U的抗微生物活性。
表6概述了在鼻形兵蚁生物分类学内trinervitanes双键变体的分布。属象白蚁属白蚁的物种以前已经提供若干trinervitadienes，其烯位置通常在1(15)，8(9)或1(15)，8(19)[7]，且偶而在11(12)，15(17)[13，20]。以前没有报道在自然界中存在具有多于两个双键的trinervitanes。相应地以前没有观察到抗微生物活性，将抗微生物活性归因于带有大于两个烯键的trinervitane衍生物。只合成出了一个具有较多数目双键的trinervitane，7(8)，11(12)，15(17)-trinervitatriene-2α，3α二醇[10]。然而，化合物P具有四个双键，而Q和R具有三个双键。在P的1(14)和9(10)位，Q的1(14)位，和R的1(14)和7(8)位存在双键，在天然的trinervitanes中是新的，尽管以前已经合成出了在7(8)位具有烯的trinervitadiene[10，21]。
由于仅获得了相对小量的化合物，没有对化合物P，Q，R，T和U的抗微生物药效定量的测定。然而，所使用的筛选试验表明，P，Q，R，T和U具有定性的、与以前从N.triodiae中分离出的trinervitadienes类似水平的抗微生物活性。
本领域技术人员将理解可在不背离本发明的精神和范围的情况下，如所概括地描述的那样，对如具体实施方案所示的本发明进行许多改变和/或修改。因此目前的实施方案在各个方面是作为例证性的加以考虑的，而非限制性的。
所有上述讨论到的出版物都被以其全部引入到本文中。
已经包括在本说明书内的文献、报告、原料、装置、文章等等的任何讨论，仅仅是用来提供本发明的上下文关系。任何或所有构成了现有技术基础的一部分的内容或与本发明相关的领域的普通常识，当其在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在时，将不被看作是一种许可。
表6.在象白蚁亚科白蚁生物类别之中trinervitane双键的数量和位置的分布注释1(14)和9(10)是在trinervitane衍生物中新的双键位置，7(8)是在天然trinervitane衍生物之中新的双键位置。
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权利要求
1.具有下式的化合物式(1) 其中化合物在选自C1和C14、C9和C10、C7和C8的碳原子之间包括至少一个双键；和其中；每个 独立地表示单键或双键或环氧键，和(i)取代基A1至A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级链烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基，低级醇基，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基，或(ii)任何一个或多个取代基对A1和A2，A1和A3，A2和A3，A2和A4，A3和A4，A3和A5，A4和A5，A4和A6，A5和A6，A5和A7，A6和A7，A6和A8，A7和A8，A7和A9，A8和A9，A8和A10，A9和A10，A9和A11，A10和A11，A10和A12，A11和A12，A11和A13，A12和A13，A12和A14，A13和A14，A1和A13，A1和A14，和A2和A14形成取代的或未取代的杂环基团，其中不形成取代的或未取代的杂环的任何取代基，包括A15和A16，独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基团，低级酰氧基，低级醇基团，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基；和其中A1或A7可以不存在；和其中任何一个A2，A3，A5，A6和A8至A15，可以通过单或双键或环氧键键合至式(1)的环结构；和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物；条件是化合物不是7(8)，11(12)，15(17)-trinervitatriene-2α，3α-二醇。
2.权利要求1的化合物，在C1和C14之间包括至少一个双键。
3.权利要求1的化合物，在选自C1和C14，和C9和C10的碳原子之间包括至少一个双键。
4.按照权利要求1到3任一项的化合物，具有至少三个双键。
5.权利要求1的化合物，至少在选自下列的碳原子之间包括双键i)C1和C14，C9和C10，和C8和A8，ii)C1和C14，C15和A15，和C8和A8，或iii)C1和C14，C15和A15，和C7和C8。
6.按照权利要求1到5任一项的化合物，其中A1，A2，A3，A5，A6，A7，A9，A10，A11，A13，A14和A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2和OR。
7.权利要求6的化合物，其中基团OR中的R是低级烷基或低级酰基。
8.权利要求6的化合物，其中A7和/或A16是H。
9.按照权利要求1到8任一项的化合物，其中A4和A12独立地选自低级烷基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基和低级醇基。
10.权利要求9的化合物，其中A4和A12独立地选自甲基，羟甲基，甲酰基和羧基。
11.权利要求10的化合物，其中A4和A12是甲基。
12.按照权利要求1到11任一项的化合物，其中A8和A15选自低级烷基，低级链烯或低级炔。
13.权利要求12的化合物，其中A8和A15选自甲基和CH2。
14.权利要求13的化合物，其中A8和A15是CH2。
15.权利要求1的化合物，其中A1至A16中至少两个是OH或OR。
16.权利要求15的化合物，其中基团OR中的R是低级烷基或低级酰基。
17.权利要求15的化合物，其中至少A2和A3是OH。
18.权利要求1的化合物，包括下式的化合物式(1) 其中化合物在选自C1和C14、C9和C10、C7和C8的碳原子之间包括至少一个双键；和其中；每个 独立地表示单键或双键或环氧键，和其中取代基A1到A16独立地选自H，OH，O，SH，NH2，低级烷基，低级烯，低级炔，低级烷氧基，低级羧基，低级醛基，低级酮基，低级酯基，低级酰氧基，低级醇基，低级烷硫基，低级烷基氨基，低级烷基磺酰基，低级烷基亚磺酰基和低级烷基磺酰氧基，和其中A1或A7可以不存在；和其中任何一个A2，A3，A5，A6和A8至A15，可以通过单或双键或环氧键键合至式(1)的环结构；和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物；条件是，化合物不是7(8)，11(12)，15(17)-trinervitatriene-2α，3α-二醇。
19.权利要求1的化合物，包括下式的化合物式(2) 其中； 表示单或双键；和其中取代基A2，A3，A4，A7，A8，A12，A15和A16如以上关于式(1)的定义，和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物。
20.权利要求1的化合物，包括下式的化合物式(3) 其中取代基A2，A3，A4，A8，A12，A15和A16如以上关于式(1)的定义，和其旋光异构体，水合物，溶剂化物和/或盐或衍生物。
21.根据权利要求1-20任一项所述的化合物，其中盐是药学和/或兽医学可接受的盐。
22.权利要求1的化合物，选自(9E)-1(14)，8(19)，9(10)，15(17)-trinervitatetraene-2β，3α-二醇(P)；1(14)，8(19)，15(17)-trinervitatriene-2β，3α-二醇(Q)；和1(14)，7(8)，15(17)-trinervitatriene-2β，3α-二醇(R)。
23.一种用于治疗患者的微生物感染或疾病的药学和/或兽医学制剂，所述制剂包括与合适的药学/兽医学可接受的赋形剂混合的按照权利要求1到22的任一项的化合物。
24.一种组合物，包括与至少一种稀释剂混合的权利要求1到22的任一项的化合物。
25.一种治疗或预防患者的微生物感染或疾病的方法，该方法包括给予或对患者施用有效量按照权利要求1到22任一项的化合物。
26.权利要求1到22任一项的化合物在制备治疗或预防患者的微生物感染或疾病的药物中的用途。
27.一种消毒表面或溶液的方法，所述方法包括使所述表面或溶液与有效量的按照权利要求1到22任一项的化合物接触。
28.一种试剂盒，包括按照权利要求1到22的任一项的化合物。
全文摘要
本发明涉及一种新类别的抗微生物化合物。这些trinervitane化合物可用于各种目的，例如治疗微生物感染和疾病，和作为消毒剂。
文档编号A61K31/047GK1771215SQ200480009411
公开日2006年5月10日 申请日期2004年2月3日 优先权日2003年2月4日
发明者R·W·里卡德斯, C·赵, S·C·特罗维尔 申请人:联邦科学及工业研究组织