发酵和培养的方法、植物发酵提取物、植物发酵提取物粉末以及含有植物发酵提取物的组合物的制作方法

专利名称：发酵和培养的方法、植物发酵提取物、植物发酵提取物粉末以及含有植物发酵提取物的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于获得可添加到与包括人在内的哺乳动物(具体是家畜、宠物动物等)、鸟类(具体是饲养的鸡、宠物鸟等)，两栖类动物、爬行动物、鱼(具体是水养的鱼、宠物鱼等)和无脊椎动物相关的药物、动物药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料和沐浴剂中的安全的免疫增强剂的发酵和培养的方法、生产植物发酵提取物的方法、通过发酵和培养方法得到的含有免疫增强剂的植物发酵提取物、从植物发酵提取物得到的含有免疫增强剂的粉末和含有植物发酵提取物的植物发酵提取物组合物。
背景技术：
为包括人在内的哺乳动物(具体是家畜、宠物动物等)、禽类(具体是饲养的鸡、宠物鸟等)、两栖类动物、爬行动物、鱼(具体是水养的鱼、宠物鱼等)和无脊椎动物建立包括预防感染技术的疾病预防和治疗方法迫在眉睫。而且，迫切需要不仅能实现上述目的而且可不用化学物质、没有环境污染、不产生抗性细菌和不在人体内蓄积的方法。本发明人等针对上述问题，发现来源于植物的免疫增强剂，例如小麦的水提取物可安全地实现疾病预防和治疗作用(专利文献1，非专利文献1)。同样为了达到上述目的，本发明人等发现可使用从小麦的共生细菌成团泛菌(Pantoea agglomerans)中得到的低分子量脂多糖(非专利文献2)。同时，近来研究已经表明脂多糖以外的多种物质显示出免疫增强效果，这些含有免疫增强剂的天然材料已经引起了关注。
微生物发酵技术不但在食品领域还在广泛领域被普遍运用。发酵广泛用于包括葡萄酒的酒类生产、酱油和豆酱生产、如奶酪的发酵奶制品生产和药物生产。用来发酵的微生物有许多，米麦芽(真菌)酵母和乳酸菌是具有代表性的，但使用革兰氏阴性细菌是罕有报导的。一般而言，发酵是一种有机物在微生物作用下分解的现象，广意上是指通过微生物生产有用的物质(非专利文献3)。使用微生物发酵的典型包括葡萄酒酿制。葡萄酒酿制是用附在葡萄皮上面的葡萄酒酵母的发酵技术，其产品是酒精。在使用微生物发酵技术中，已经知道使用革兰氏阴性细菌的发酵有用甲烷细菌的甲烷发酵、用醋酸菌的醋酸发酵和用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)从龙舌兰块茎中得到乙醇的发酵(龙舌兰酒发酵)，但是对使用可食用植物作为原料和使用以与该植物有共生关系为特征的微生物来发酵培养的方面知之甚少，且从未关注过将免疫增强剂作为发酵产品。再进一步，以生产免疫增强剂为目的的发酵和培养方法从来未受关注。
一方面，当使用微生物进行发酵时，通常发酵底物的营养条件要满足微生物的成长。即，必需存在可供微生物作为营养的物质，即含有充分的诸如葡萄糖和果糖的单糖作为碳源。因此，像葡萄这样含有丰富果糖的水果不需要任何加工即可用作发酵底物。不过在其他情况下，微生物发酵需要预处理如加热和酶处理。例如，上面讲到的运动发酵单胞菌是龙舌兰酒发酵中使用的微生物。在这种情况下，通过加热从非食用植物龙舌兰块茎中得到的多糖，使之分解成可发酵的单糖，随后这些单糖由微生物发酵得到发酵产品酒精。因此，用典型的微生物进行发酵培养时，诸如淀粉的多糖不适合作为发酵底物。例如，已有报道成团泛菌不能分解淀粉(非专利文献4)。
我们已经证明小麦粉的水提物中含有增强免疫性的活性成分(非专利文献5)。我们也证明了食用谷物(小麦，稻米)、海藻(褐藻、海带、羊栖菜(褐藻)和紫菜)和豆类(大豆和赤豆)含有这种活性成分(非专利文献6)。已被发现这种生物活性对人类和小鼠的疾病(糖尿病、高脂血、遗传性过敏皮炎、癌症)有预防作用，还能有效预防鱼、甲壳纲动物和鸡的感染(专利文献1，非专利文献1)。不过，想要通过小麦粉的水提物得到上述效果，必须摄取大量的小麦粉。
一方面，成团泛菌是与小麦共生生存的细菌，因为这种细菌向小麦提供了磷和氮，它被认为对小麦培育有用(非专利文献7)。同时，成团泛菌不仅在小麦上也在梨和苹果表皮上沉积。在欧洲已经证明了当这种细菌沉积时，可预防由真菌引起的腐烂病，正在进行用这种细菌作无毒、环保杀真菌剂的开发(非专利文献8)。共生现象是这样定义的“异种生物体一起生存的现象。在这种情况下，通常就意味着经常保持行为上的或生理上的紧密关系。因此，这并非仅指在同一生活环境下生存的概念。依据对共生伴侣而言的生命意义和重要性、关系的可持续性和共生伴侣的空间位置，共生现象分类和划分成不同的种类。通常，共生现象根据从共生对象处得到好处/坏处的有无，主要分为互利共生、偏利共生和寄生。三类”(非专利文献9)。已经知道成团泛菌从任何地区任何小麦中可分离得到(非专利文献5)，也可从水果中分离得到(非专利文献10，11)。已有报告说成团泛菌通过产生抗生素保护植物免受真菌和其他细菌侵害(非专利文献12，13)并且进行固磷和固氮(非专利文献7)。因此，成团泛菌一直被认为存在于植物中并扮演了一个有利于植物的角色。这样，它的生存方式被视为是“共生”而不是“寄生”。另外，我们已经证明增强免疫性的活性成分存在于成团泛菌中。我们还发现从这种细菌中获得的低分子量脂多糖对人类和小鼠的疾病(糖尿病、高脂血、遗传性过敏皮炎、癌症)有预防作用，还对鱼、甲壳纲动物和鸡的感染有预防作用(专利文献3，非专利文献2)。

在这种情况下，我们有了一个构想，就是建立一个用成团泛菌生产植物发酵提取物的方法，以此作为安全、廉价地生产免疫增强剂的方法。也就是，我们关注(1)使用培养液中所含的主要蛋白成分来源于植物的的培养基，低成本培养成团泛菌，同时发酵植物成分以及(2)制备富含包含有成团泛菌的植物或发酵产品的材料，从而着眼于为包括人在内的哺乳动物(具体是家畜、宠物动物等)、禽类(具体是饲养的鸡、宠物鸟等)、两栖类动物、爬行动物、鱼类(具体是水产养殖的鱼、宠物鱼等)和无脊椎动物开发药物、动物用药物、准药物、化妆品、功能性食品、食品、饲料和沐浴剂。不过这并不意味着与植物共生生存的微生物能够直接用植物成分例如来源于可食用植物的原料作为发酵底物。例如，小麦粉是淀粉和小麦粉中存在的相似成分的复合有机物，但是分离出的与小麦共生生存的微生物成团泛菌隔着小麦外皮并不与之直接接触。这样，不能通过细菌与小麦的共生关系证明成团泛菌是否能发酵和用小麦粉培养。事实上，根本不知道，也无报告说成团泛菌能够同化小麦粉。相反地，根据公知事实，已经记述了成团泛菌不能用小麦淀粉来作为发酵底物。
植物中含有的糖类经常保留为淀粉的形式，这点在可食用植物中很显著，特别是可食用谷物。通常，微生物没有高度同化淀粉的功能。在这点上，已经知道一部分兼性革兰氏阴性细菌能够发酵淀粉。例如已知Erwinia能同化淀粉。不过在所述的这个发酵中，当发酵淀粉时，希望的是通过添加可在另一个最佳培养基中大量培养的微生物以利用该微生物的淀粉酶活性，从未想过联合进行使用淀粉实施培养本身和发酵。在常规技术中，它被看作仅以有效利用微生物淀粉酶活性为目的的发酵，没有计划用淀粉作为底物来培养微生物。一方面，在本发明实施例中，公开了一种除了用淀粉作为唯一碳源的微生物培育以外的发酵产品的生产，本发明与常规技术的重要区别在于本实施例不仅仅是发酵而是发酵和培养。

在另一方面，如果某特定微生物保留了分解淀粉的功能，这并不直接表明该微生物能用淀粉作底物来生长。在培养上，在也以微生物生长为目的的情况下，在培养开始时加入的微生物数量是极少的。在这情况下，即使微生物轻微具有淀粉酶活性，该活性对于充分分解底物而言太微弱，无法实现微生物的生长。事实上，人们认为许多微生物不能用淀粉作为唯一碳源而生长。
但是，如果用成团泛菌在主要成分是小麦粉的培养基中进行发酵和培养，低成本地生产富含免疫增强剂的植物发酵提取物(在下文中，将用成团泛菌在主要成分是小麦粉的培养基中发酵和培养而生产出的植物发酵提取物称为小麦发酵提取物)，作为具体的例子，应该能够为畜牧业在水产业领域提供环保、安全的可有效预防感染的药物、动物用药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料和沐浴剂。本发明是以上述的成团泛菌用小麦粉作为底物生长的发现为契机并且进行了大量实验而完成的。
本发明提供的植物发酵提取物是一个总称，其包括进行发酵和培养获得的培养液本身、通过固/液分离培养液而得到的液体成分和对固/液分离得到的固体成分进行提取而得到的液体成分等。也就是说，植物发酵提取物包括根据本发明所述发酵和培养方法获得的培养液本身、和用全部或部分培养液可能制备得到的所有提取物。这自然不用说，植物发酵提取物能通过干燥成植物发酵提取物粉末或在适当溶液含有生理盐水的磷酸盐缓冲液中将植物发酵提取物粉末溶解成任意浓度而被利用。
日本未审查专利申请公报No.H3-218466[专利文献2]日本未审查专利申请公报No.H8-198902[专利文献3]WO 00/57719[专利文献4]日本未审查专利申请公报No.H6-78756[专利文献5]日本未审查专利申请公报No.H4-187640 日本未审查专利申请公报No.H4-49240[专利文献7]日本未审查专利申请公报No.H4-99481[专利文献8]日本未审查专利申请公报No.H5-155778[非专利文献1]Inagawa，H.et al.，Biotherapy 5(4)，p617-621，1991[非专利文献2]Soma G.et al.，“Tumor necrosis FactorMolecular and Cellular Biology and Clinical Relevance”p203-220，1993[非专利文献3]Yamada T.et al.，“Seibutsugaku Jiten”3rded.，p1021，1983[非专利文献4]Gavini，F.et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.，39，p337-345，1989[非专利文献5]Nishizawa T.et al.，Chem.Pharm.Bull.，40(2)，p479-483，1992[非专利文献6]Inagawa H.et al.，Chem.Pharm.Bull.，40(4)，p994-997，1992[非专利文献7]Neilson A.H.，J.Appl.Bacteriol.，46(3)，p483-491，1979[非专利文献8]Nunes C.et al.，Int.J.Food Microbiol.，70(1-2)，p53-61，2001[非专利文献9]Yamada T.et al.，“Seibutsugaku Jiten”3rded.，p287-288，1983[非专利文献10]Nunes C.et al.，J.Appl.Microbiol.，92(2)，p247-255，2002[非专利文献11]Asis C.A.Jr.et al.，Lett.Appl.Microbial.，38(1)，p19-23，2004[非专利文献12]Vannester J.L.et al.，J.Bacteriol.，174(9)，p2785-2796，1992[非专利文献13]Kearns L.P.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，64(5)，p1837-1844，1988发明内容[发明所要解决的问题] 如前面所述，免疫增强剂多为包含在植物本身中和与植物共生生存的微生物的成分或者产物中。因此，想要获得来源于摄食安全的天然产品的免疫增强剂，从可食用植物本身中提取成分(例如，鲎阳性糖脂类，专利文献1)或有效培养与可食用植物共生生存的微生物来获得其成分或产物(例如，低分子量脂多糖。专利文献2)是有用的。但是，在可食用植物中的免疫增强剂含量是非常低的，想要通过食用来达到免疫增强作用，就必须摄取极其大量的食物，而且，一般不容易保持免疫增强剂适当的摄取量。这样，并不能指望这种效果。此外，从植物中提取免疫增强剂并用作食品或药物时，需要高成本，并实用性差。
一方面，当关注在与植物共生生存的微生物时，与小麦共生的细菌成团泛菌含有作为有效成分对免疫刺激有效的低分子量脂多糖。但是，到目前为止，为了提取低分子量脂多糖，需用昂贵的培养基来培养成团泛菌，培养基中所含的主要蛋白如NZ胺、胰蛋白胨或水解酪蛋白氨基酸来源于动物。因此价廉地提供可广泛使用的免疫增强剂是有困难的。同时，不能否认可能混入诸如来源于BSE动物的未知有害物。
鉴于上述问题，本发明目的在于提供可使用安全的材料，价廉和有效地获得免疫增强剂的发酵和培养方法；通过该方法得到的植物发酵提取物、从植物发酵提取物中得到的植物发酵提取物粉末和含有植物发酵提取物粉末的植物发酵提取物组合物。

本发明中的发酵和培养方法的特征在于，用专门与植物共生生存的兼性厌氧革兰氏阴性细菌发酵来源于可食用植物原料，同时培养兼性厌氧革兰氏阴性细菌。
通过用兼性厌氧革兰氏阴性细菌以淀粉为碳源发酵可实现用简单的方法进行发酵和培养。
希望兼性厌氧革兰氏阴性细菌是兼性厌氧杆菌。
兼性厌氧杆菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。
兼性厌氧杆菌属于泛菌属(Pantoea)、沙雷氏菌属(Serratia)或肠杆菌属(Enterobacter)。
通过使用兼性厌氧杆菌成团泛菌，可以以淀粉为碳源。
希望可食用植物是食用谷物、海藻、豆类或其混合物。
还希望来源于食用谷物的原料是小麦粉，米粉，小麦麦麸粉，米糠或酒糟。特别是因为小麦粉含有作为蛋白质来源的谷蛋白，所以甚至在不使用来源于动物的原料的情况下也可以有效地发酵和培养。
希望来源于海藻的原料是褐藻粉，裙带菜(裙带菜孢子叶)粉或海带粉。
当来源于豆类的原料是豆腐渣滓时，它富含蛋白质。因而，甚至在不使用来源于动物的原料的情况下也可以有效地发酵和培养。
发明中植物发酵提取物的特征在于是由发酵和培养的方法获得的。
发明中植物发酵提取物粉末的特征在于是由发酵和培养的方法获得的。
发明中植物发酵提取物组合物的特征在于组合了植物发酵提取物或植物发酵提取物粉末。
植物发酵提取物组合物可以是药物，动物用药物，准药物，化妆品，食品，功能性食品，饲料或沐浴剂。
希望植物发酵提取物有以下的理化性质。
植物发酵提取物甚至在多粘菌素B存在的情况下显示出巨噬细胞活化能力。植物发酵提取物具有免疫增强作用。
根据本发明，因为可在不含有来源于动物的成分的培养基中进行培养，所以不存在来源于动物成分的杂质的污染。因此，不可能有未知有害物质例如来源于BSE污染，并且可以提供安全性高和廉价地生产能用于多种预期用途的植物发酵提取物的制造方法和安全、廉价地提供了含有免疫增强剂的植物发酵提取物或植物发酵提取物粉末；而且可以提供培养液；免疫增强剂和提取物和提取物粉末；以及含有提取物或提取物粉末的药物、动物用药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料和沐浴剂。
这是未曾被想到也没有从常规发酵技术的发现中轻易地推测到的事实，即用专门与植物共生生存的兼性厌氧革兰氏阴性细菌发酵来自于可食用植物的材料，同时培养兼性厌氧革兰氏阴性细菌，实现以简单的方法进行发酵和培养。
特定物质可用从巨噬细胞是否产生TNF(TNF诱导活性)作为显示免疫增强效果的指示剂。而且，可用产生的TNF的量对免疫增强效果定量。因此，用来源于小麦粉的鲎阳性植物糖脂类和来源于成团泛菌的低分子量脂多糖检测巨噬细胞的TNF的产生。通过用多粘菌素B处理来源于小麦粉的鲎阳性植物糖脂类和来源于成团泛菌的低分子量脂多糖来终止巨噬细胞中的TNF的产生。可是，很多实施例显示甚至当用多粘菌素B处理本发明的植物发酵提取物时，TNF仍从巨噬细胞中产出。这表明发酵和培养获得的植物发酵提取物具有性质不同于用作原料的植物本身和发酵所用的微生物本身中的成分所产生的免疫增强效果的免疫增强效果。


图1是含有小麦发酵提取物的饲料抑制锦鲤疱疹出现的结果示意图。
具体实施例方式在下文详细描述适合本发明的实施方案。
I.用成团泛菌生产植物发酵提取物方法的基本特征本发明中，我们第一次发现用淀粉作为碳源成团泛菌能直接生长，并且发明了使用成团泛菌廉价地生产富含作为发酵产物和培养产物的免疫增强剂的小麦发酵提取物的方法。据此能为有效预防人类感染和在畜业及水业提供环保安全的准药物、化妆品、食品、功能性食品和饲料。
1成团泛菌的分离将小麦粉悬浮于水中，取上清液涂布于L肉汤琼脂培养基上，然后培养，出现微生物菌落。在这些菌落中，用标准方法鉴定微生物。例如，通过筛选革兰氏染色阴性、葡萄糖厌氧代谢反应阳性和氧化酶活性阴性的菌落和使用ID测试/EB-20(日水制药制造)筛选出与标准成团泛菌具有相同性质的那些菌落。可从物理化学研究所，生物资源中心获得标准的成团泛菌(非专利文献4)。在下面的描述中，除非另外指定，百分比是重量值。
2免疫增强活性评价在本实施方案中，作为小麦发酵提取物显现的免疫增强效果的指示剂，通过巨噬细胞产生TNF产评价定对巨噬细胞的活化能力。
3来源于成团泛菌的低分子量脂多糖希望含有通过成团泛菌发酵和培养而得到的作为免疫增强的活性成分之一的来源于成团泛菌的低分子量脂多糖。低分子量脂多糖具有比一般使用的高分子量型脂多糖(典型脂多糖)更显著的安全性和更高的生物活性。因而，测定低分子量脂多糖的含量。专利文献2详细描述了低分子量脂多糖。本实施例涉及小麦发酵提取物，但本发明不意味着植物局限于小麦以及免疫增强剂局限于低分子量脂多糖。
可用公知方法培养成团泛菌(专利文献2，非专利文献8)，但培养基所含蛋白的主要成分来源于动物，培养基成本高。而且，当功能性食品和功能性饲料被给予动物或经皮使用时，在食品安全方面存在以BSE为代表的来源于动物的杂质污染的问题，除此之外，生产成本高而且方法实用性差。因而，作为为获得具有免疫增强作用的安全廉价的天然产物的大量研究的结果，本发明人完成了如实施例所示的用成团泛菌发酵和培养以获小麦发酵提取物的方法。培养基所含蛋白的主要成分以往来源于动物，但本发明用的是来源于植物的。典型地，将通过用消化酶分解蛋白例如来源于牛奶的酪蛋白得到的产物加入培养液中。这种情况下，每升培养基的基本成本是约250日元，但如果这能用小麦粉替代，基本成本变为约16日元。尚未见高度浓缩并协同地融合来源于植物的免疫增强活性和与之共生微生物的免疫增强活性二者的发酵。
发明的内容将在下面实施例中描述，但本发明不局限于以本实施例所描述的成团泛菌作为微生物，也不局限于以小麦作为可食用植物或以小麦粉作为原料。本发明也能适用于通过典型方法从其他富含免疫增强剂的可食用植物中获得的原料，例如褐藻、可食用谷物(包括小麦粉、米粉、小麦麦麸粉、米糠或来源于食用谷物原料的酒槽)、海藻(包括褐藻粉、裙带菜粉或来源于海藻原料的海带粉)和豆类(包括来源于豆类原料的豆腐渣滓)。众所周知这些植物含有蛋白和糖类。这些植物能适用于成团泛菌的发酵和培养。众所周知本土细菌(indigenous bacteria)，例如沙雷氏菌属或肠杆菌属(Enterobacter)的细菌与这些植物共生生存(非专利文献4)。当然发酵用的微生物包括与这些植物共生生存的兼性厌氧革兰氏阴性细菌。
II本发明重点总结(1)小麦发酵提取物作为通过小麦、与之共生的细菌成团泛菌和它们的组合产生的发酵产物的融合而得到的具有免疫增强作用的物质，是新的，但本发明不局限于此。
(2)用革兰氏阴性细菌成团泛菌生产植物发酵提取物是新的，但本发明不局限于此。
III生产小麦发酵提取物的具体方法(1)通过标准方法从小麦粉中分离出成团泛菌(非专利文献1)。一旦分离和鉴定，细菌可被保存在50％的甘油中。
(2)制备0.05～5％食盐，0.005～1mol磷酸盐缓冲液，或混合盐溶液(0.5～10％磷酸二氢钠、0.05～5％磷酸一氢钾、0.05～5％氯化钠、0.05～5％氯化铵)。
(3)小麦粉以0.05～10％的浓度悬浮于水中。
(4)制备0.2～3mol氯化镁溶液。
(5)制备0.2～3mol氯化钙溶液。
(6)某些情况下，(2)～(5)的溶液用高压锅等灭菌。
(7)(2)～(5)的溶液以适当剂量混合，加水制得0.1～5％的小麦粉悬浮液。某些情况下，通过加碱性溶液或酸性溶液使pH为中性。
(8)某些情况下，通过向(7)中按每升培养基加10～50000单位加入淀粉酶，并在10～80℃温育1～24小时以此可以部分消化小麦淀粉。
(9)将在(1)中分离的成团泛菌加入(7)或(8)。
(10)使(9)在1～40℃发酵。某些情况下，发酵容器可以静置或振摇。或者可以间隔几小时进行搅拌。
(11)使(10)发酵6小时至一周。当发酵进行时，小麦粉溶液变成黄色。
(12)(11)发酵期间可以选加碱性溶液，使pH为中性，也可以加小麦粉悬浮液或无机盐。
(13)终止发酵，通过离心(1000～5000rpm，10～60分钟)收集作为沉淀的固体成分。沉淀可以直接当作小麦粉发酵产物用于饲料或用作与饲料混合的原材料。
(14)在生产小麦发酵提取物时，悬浮(13)于水或盐缓冲液中，在80～140℃加热10分钟～6小时。可以通过离心或过滤除去固体成分。可以再加入水或盐缓冲液到除去的固体成分中重复加热提取几次。
(15)根据所期望的用途，可将在(14)中生产的小麦发酵提取物进一步简单纯化。就是以盐例如氯化钠以最终浓度0.05～1mol/L加到(14)的提取物中，随即以提取物1～3倍的量加入溶剂例如乙醇，沉淀出现。可以通过离心收集该沉淀。沉淀可以进一步用溶剂例如乙醇洗涤。当它被干燥时，可制得粉末。
A.涉及生产小麦发酵提取物方法的实施例[实施例1] 成团泛菌在小麦粉培养基中的生长研究为了证实用小麦粉作为碳源能否使与小麦本土共生的细菌成团泛菌生长，对小麦粉固体培养基中的成团泛菌生长进行检测。
(1)制得作为碳源含有0.5％的小麦粉的M9琼脂培养基。
(2)从LB琼脂培养基中挑出的一个成团泛菌菌落，将其悬浮于1ml PBS中。继而将其稀释10倍～10,000倍，将0.1ml的每个等分接种到(1)中M9琼脂培养基。
(3)37℃培养6天后，观察到菌落的出现。结果，在以稀释10000倍的0.1ml接种的有盖培养皿中观察到约300个菌落。
这证实了成团泛菌能利用小麦粉作碳源。
小麦发酵提取物的生产(1)向0.5g小麦粉中加入(5ml)蒸馏水以悬浮，加0.1ml悬浮液到L肉汤琼脂培养基上，在37℃培养过夜。
(2)分离黄色菌落，通过标准方法鉴定细菌，分离成团泛菌，将其悬浮于50％的甘油溶液中，在冰箱中保存。将贮存物的一部分用于LB琼脂培养基上，其在37℃静置以制得成团泛菌的单独菌落。
(3)2升培养瓶中，加入64g磷酸二氢钠七水合物，15g磷酸一氢钾，2.5g氯化钠，及5g氯化铵，然后加入纯化水制得总体积1升(无机盐混合溶液)。向13.1g氯化镁二水合物加入纯化水制得总体积100ml(氯化镁溶液)。向11.1g氯化钙加入纯化水制得总体积100ml(氯化钙溶液)。纯化水(4L)加到一个5L锥形瓶中(纯化水)。上述溶液和纯化水都通过高压锅灭菌(TOMY BS-325，120℃，20分钟)。
(4)小麦粉(24g)(日清制粉公司制造)和纯化水加到一个1L锥形瓶中制得总体积600ml。在同样高压灭菌后，加入3mgα-淀粉酶(SIGMA，杆菌属，酶活性为1500～3000单位/mg蛋白)，65℃水浴加热12小时(淀粉酶处理的小麦粉溶液)。
(5)所制备的溶液以表1所示的数量置于一个3L灭菌过的摇瓶中制得小麦粉培养基。
[表1]

(6)接种物的准备将一个从在(2)的小麦粉中分离出的成团泛菌菌落加到10ml与先前准备的(5)成分相同的小麦粉培养基中，在37℃轻柔搅拌发酵过夜(12～15小时)来准备用于小麦粉发酵的接种物。
(7)全部量的(6)加入(5)中，在37℃搅拌发酵20～30小时。发酵液的pH通过加氨水调节校准到pH 7。无菌下，150ml淀粉酶处理的小麦粉溶液加入到37.5ml无机盐混合溶液中，同样地发酵20～30小时。重复同样的操作发酵总计65～80小时。
(8)离心小麦粉发酵溶液(日立，高速冷冻离心机，SCR-20B，5000rpm，20分钟，4℃)，收集沉淀。
(9)向(8)的沉淀中加入磷酸盐缓冲液，悬浮制得总体积100ml，等分的每33ml移入一个50ml离心管中，沸水浴加热提取30分钟。加热终止后，溶液冷却至室温，离心(日立，高速冷冻离心机，SCR-20B，10000rpm，20分钟，20℃)。离心后，82ml浅黄色上清液倾注到另一容器中收集起来。
(10)向80ml(9)的上清液中加入氯化钠溶液(8.9ml，5mol)。当加入178ml乙醇时，出现白色混浊。将其在冰箱(-90℃)中静置过夜，再将溶液离心(日立，高速冷冻离心机，SCR-20B，10000rpm，20分钟，4℃)。除去上清液，得到沉淀。向沉淀加入10ml 70％冷乙醇，悬浮后，离心溶液(日立，高速冷冻离心机，SCR-20B，10000rpm，20分钟，20℃)，洗涤沉淀。风干沉淀并溶解于蒸馏水中，得11ml小麦发酵提取物。
(11)测量干重将0.3ml移入一个已称重的1.5ml塑料管中，冻结后，用冷冻干燥机进行冻干，从而称重7.45mg。因此，(10)中小麦发酵提取物干重是每1ml溶液中24.8mg和每11ml总量中273mg。
(12)用同样方法独立地生产小麦发酵提取物8次，以蛋白定量BSA为标准蛋白，用Bradford法测量每个样本中的蛋白量。纯化的鲎阳性糖脂类(专利文献1)和低分子脂多糖(专利文献2)用作对比物。测量结果如表2所示。表2-5和表7中，小麦发酵提取物对应的数值表示干燥每1g上述(10)中所得小麦发酵提取物所得的mg重量。
(13)测量糖含量以葡萄糖为标准糖通过苯酚硫酸方法测量糖含量。测量结果如表3所示。
(14)测量核酸含量测量稀释100倍的样本在210～340nm的吸收。用260nm的吸收值减320nm的吸收值得到的值以及50μg/10D的DNA吸收来计算最大含量。测量结果如表4所示。
(15)通过鲎化验测量鲎活性物质含量为了测量，所用Toxi-color系统由生化学工业公司提供，并且用生化学工业公司的ET-1作标准鲎活性物质。测量结果如表5所示。
(16)碘-淀粉反应用时将碘试剂1N(向12.7g碘和25g碘化钾加入10ml水，混匀，再加水定容至100ml)用水稀释200倍。将其(5μL)加到0.1ml预先溶解为1mg/mL的小麦发酵提取物中，混匀。在小麦发酵提取物中，溶液立即从浅紫变为深紫色(阳性)。在鲎阳性糖脂类和低分子量脂多糖中，同样的操作没有导致这样的颜色变化(阴性)。以上结果总结在表6中。
上述结果显示，显而易见小麦发酵提取物在蛋白含量、糖含量、核酸含量(除了鲎阳性糖脂类因为没有数据)、鲎阳性物质含量和碘-淀粉反应方面与鲎阳性糖脂类和低分子量脂多糖不同，很显然本物质是新的。上述结果简单总结在表7中。即本实施例的植物发酵提取物是新的，其显示的下列理化性质与鲎阳性糖脂类和低分子量脂多糖不同。小麦发酵提取物显示蛋白含量5～15％，糖含量20～45％，核酸含量10～35％，鲎阳性物质含量10～40％，碘-淀粉反应阳性及甚至在多粘菌素B存在的情况下可显示巨噬细胞活化能力。
[表2]发酵提取物的蛋白含量
发酵提取物的糖含量
[表4]发酵提取物的核酸含量
[表5]发酵提取物的鲎活性物含量
[表6]发酵提取物的碘-淀粉反应
小麦发酵提取物与相似产品间的不同点总结

过小比小麦发酵提取物数值范围(平均值±标准偏差)低相当多的数值过多比小麦发酵提取物数值范围(平均值±标准偏差)高相当多的数值[实施例3] 小麦发酵提取物的免疫增强作用将用作人巨噬细胞的急性骨髓性白血病细胞系THP-1(1×106/250μL，含10％胎牛血清的RPMI1640培养基)置于48孔平板中，先预培养30分钟。随即加入250μL培养基(最终体积500μL)以使每个样本最终浓度为1～10000ng/mL。设立样品中含有多粘菌素B(12.5μg/mL)的组。培养4小时后，收集培养上清液和细胞。用L-929通过细胞毒素测试测量上清液的TNF活性。结果如表8所示。用小麦发酵提取物甚至在多粘菌素B存在的情况下也可使巨噬细胞产生TNF，但用低分子量脂多糖和鲎阳性糖脂类，在多粘菌素B存在的情况下巨噬细胞不能生产TNF。从这点，显而易见小麦发酵提取物具有不同于低分子量脂多糖和鲎阳性糖脂类的生物活性。
由小麦发酵提取物导致的巨噬细胞TNF的产生和由多粘菌素B导致的抑制作用(小麦发酵提取物的TNF诱导活性)
B.小麦发酵提取物用到饲料的应用例[实施例4] 含有小麦发酵提取物的养鸡饲料(肉鸡饲养死亡率的抑制作用的大规模研究)制得含430μg/kg实施例2制备的小麦发酵提取物的饲料。每组用约5500～6000只适于烤焙的商业鸡。供给对照试验组不含小麦发酵提取物的饲料。供给孵出3周的鸡含小麦发酵提取物的饲料，每天供应至孵化后7周。每天统计死亡鸡数。丢弃不符合发货标准的鸡。结果如表9所示。试验组(饲料含小麦发酵提取物)去除率低，是1.9％，对照组是3.3％。试验组饲养率是98.1％，对照组是96.7％。因此，观察到饲养率增长了1.4％。对试验组和对照组的实际发货鸡数和去除鸡数进行显著性差异检验，在x2检验中观察p＜0.0001的显著性差异。从上面看出含有小麦发酵提取物的饲养肉鸡的饲料有预防感染作用。
含小麦发酵提取物的肉鸡饲养饲料的作用
含小麦发酵提取物的养鱼饲料(在鲱露天试验中的感染预防作用)为了检验预防感染作用，用含实施例2所产小麦发酵提取物的饲料喂养露天检测的约5200条/组的鲱。结果如表10所示。未给予对照组的链球菌死亡率达4.8％。在每天摄食100μg/kg(每1kg体重和每天)的组(试验组)中，观察到与未给予组(对照组)相比，死亡率显著降低(p＜0.0001)。
[表10]露天试验中含小麦发酵提取物的饲料对鲱的预防感染作用
含小麦发酵提取物的养鱼饲料(对锦鲤疱疹(koi herpes)的感染预防作用)(1)鲤鱼用体重70g的黑鲤鱼。按20条鲤鱼/组进行测试。
(2)制备锦鲤疱疹病毒向1g死于锦鲤疱疹感染的鲤鱼的鳃加入10ml Hanks平衡盐溶液(HBSS)，匀浆，用0.45μm滤膜过滤，其滤液制得病毒溶液。
(3)锦鲤疱疹病毒的感染腹腔注射上述滤液(600μL/100g体重)。
(4)制备含小麦发酵提取物的饲料以0、5、10和20mg/kg的比例向商用饲料混合实施例2所制备的小麦发酵提取物。
(5)喂养方法一天一次按各1％重量的饲料/体重给。对应于小麦发酵提取物的量为0、50、100或200μg/kg体重/天。
(6)实验供给鲤鱼一周含小麦发酵提取物的饲料，再让其感染病毒，随后供给10天含小麦发酵提取物的饲料。观察感染病毒后10天内的鲤鱼存活率。结果如图1所示。
第6天结束时没有供给小麦发酵提取物的组中鲤鱼全部死亡。同时，感染后的第10天供给小麦发酵提取物的组中存活率显现显著提高(Kaplan Meier方法，logrank检验，风险性百分比是0.01％或更小)。具体而言，供给100μg/kg体重/天小麦发酵提取物的组的存活率为65％。
C.小麦发酵提取物用到化妆品和沐浴剂的应用例[实施例7]含小麦发酵提取物护手霜的生产 将约10％实施例2所制备的小麦发酵提取物与脂溶基质1的软膏按表11所述的配方混合来得到软膏。

含小麦发酵提取物保湿霜的制备1.含小麦发酵提取物保湿霜的配方所用成分如表12所示。在70℃加热溶解组合A，组合B与纯化水以1∶4的量混合并在70℃加热/溶解，组合C与纯化水以1∶4的量混合并在70℃加热/溶解，二者加入到A中。这个混合物通过匀浆机充分混匀后再冷却至40℃。组合D再加入其中，pH调至6.8。随后，加入适量剩余纯化水和实施例2所制备的小麦发酵提取物，混匀得到乳液。小麦发酵提取物先以5mg/mL溶解在纯化水中，取0.1ml加入100g乳液中。

2.含小麦发酵提取物保湿霜的效果此霜被43名男女使用，并进行了问卷调查。结果，对于保湿效果，18人回答确实有保湿效果，18人回答有轻微保湿效果，2人回答没有保湿效果，5人没有作答(一个样本体征检验p＜0.0001)。对于粗糙皮肤的改善效果，6人回答确实有效，13人回答轻微有效，无人回答没有效果，24人没有作答(一个样本体征检验p＜0.0001)。对于使用后皮肤状况变坏，无人回答变坏。此霜被4个有轻度遗传性过敏症的人使用，并进行了问卷调查。对于遗传过敏性皮炎的改善效果，3人回答它确实有效，1人回答它轻微有效(一个样本体征检验p＜0.125)。此外，1人回答痤疮疤痕迅速痊愈。此霜被9人在剃须后使用，并进行了问卷调查。8人回答它有效地减少剃须后的疼痛，防止干燥和提早治愈剃刀伤口(一个样本体征检验p＜0.01)。另外，此霜被2个患有由年龄引起的肩部僵直的人用于肩部来减轻疼痛。1人回答它有效。
另外，此霜被烧伤患者使用。在双手皮肤烧伤程度相同的患者身上，一手用含实施例2所制备的小麦发酵提取物的霜，另一手用不含实施例2所制备的小麦发酵提取物的霜。用含小麦发酵提取物的霜处理的手明显愈合快些。此霜被包括此案例在内的10名烧伤患者使用。从而，在含小麦发酵提取物的护肤霜处理的所有部位比不含小麦发酵提取物的护肤霜处理的部位伤口愈合快些(Fisher确切概率p＜0.001)。从上面看出小麦发酵提取物显示治疗烧伤的作用。
含小麦发酵提取物化妆水的生产1.含小麦发酵提取物化妆水的配方所用成分如表13所示。实施例2所产小麦发酵提取物先以5mg/mL溶解在纯化水中，取0.1ml加入100g化妆水中。

2.含小麦发酵提取物化妆水的效果此化妆水被5名女性使用，并进行了问卷调查。结果，3名女性回答它有不错的保湿作用，2名女性回答它有一般的保湿作用。所有的这些女性没有皮肤问题。
含小麦发酵提取物沐浴剂的制备以改善身体机能为目的，制造含小麦发酵提取物的沐浴剂。沐浴剂的基础成分如表14所示。
[表14]
将110μg实施例2制备的小麦发酵提取物加到上述成分中制得含小麦发酵提取物的沐浴剂。将含有提取物的沐浴剂和不含提取物的沐浴剂任意地给102个受检者，他们用来在(160-200升)浴缸中洗澡，并进行问卷调查[(1)身体的保温程度，(2)洗澡后感到寒冷的不快感，(3)解疲效果，(4)易睡度，(5)肩部僵直的痊愈程度，(6)对肌肉疼痛的作用，(7)对神经疼痛的作用，(8)对腰部疼痛的作用，(9)对寒冷温度敏感性的作用，(10)对脚癣的改善作用，(11)对干燥皮肤的改善作用，(12)对遗传过敏性皮炎的作用]。结果，观察到在(1)身体的保温程度(10％)，(2)洗澡后感到寒冷的不快感(7.9％)，(6)对肌肉疼痛的作用(13％)，(8)对腰部疼痛的作用(16％)，(9)对寒冷温度敏感性的作用(10％)及(11)对干燥皮肤的改善作用(7.3％)方面，比对照改进了7％或更多(Mantel-Haenszel检验p＜0.04)。从上述结果观察到用小麦发酵提取物当沐浴剂可产生缓和肌肉疼痛的效果和改善身体保温。
D.将小麦发酵提取物用到功能性食品中的应用例[实施例11] 含小麦发酵提取物糖果的生产(1)作为原材料，糖粒，淀粉糖浆，水和实施例2所制备的小麦发酵提取物的混合物以5∶5∶5∶1的比例混合，在120-160℃加热煮化。
(2)在用来冷却的钢板上冷却(1)中所得物，伸展成棒状，模铸成约1g的粒状以获得糖果。
将适量该糖果置于20ml水中，加热溶解。测得在此溶液中作为小麦发酵提取物活性成分的脂多糖的量是4.6μg/g。此糖果被6名患有感冒和喉咙痛的男女摄取。其后，进行了有关喉咙痛的问卷调查。对于喉咙痛，6人都感到喉咙痛减轻(一个样本体征检验p＜0.03)。
含小麦发酵提取物的酒精分解功能性食品的生产实施例2所制备的小麦发酵提取物与作为酒精分解功能性食品的商用产品混合，并检测是否观察到缓和咽喉痛的新作用。
商用产品商标“Nonde oiki”成分如表15所示。
[表15]
现在的“Nonde oiki”含有甘茶蔓(Gynostemma pentaphylla)提取物和绿茶提取物，但仅含约0.002μg/包的植物提取物活性成分之一的脂多糖。因此，所希望的是通过添加适量富舍脂多糖的小麦发酵提取物以获得新的功能。期望混合1-30μg/2g/包的小麦发酵提取物(如小麦发酵提取物5-150μg)活性成分之一的脂多糖。因而，首先，生产每包混合50μg小麦发酵提取物的产品。在“Nonde oiki”的生产过程中，每100g产品加入2.5mg小麦发酵提取物。结果，生产出每2g产品中含50μg小麦发酵提取物的新产品。

以20名在饮酒和卡拉OK后咽喉痛的成年男女为实验对象，将常规的”Nonde oiki”和含小麦发酵提取物的”Nonde oiki”分别给10人服用，并检测对公知作用分解酒精能力的增强作用和对咽喉痛的缓和效果。其后马上进行有关对咽喉痛的缓和效果的问卷调查。结果，观察到接受含小麦发酵提取物“Nonde oiki”的10人中有8人减轻，但是接受常规“Nonde oiki”10人中有2人减轻。因而，观察到与对照相比的统计上的显著差异(Fisher确切概率p＜0.012)。
E.涉及小麦发酵提取物医疗效果的实施例[实施例13] 含小麦发酵提取物的甘油溶液的制备(对遗传过敏性皮炎的治疗效果)每日2或3次将含50μg/ml实施例2所制备的小麦发酵提取物的50％甘油溶液以每次服药2～3ml的剂量给药于9名患有难治的遗传过敏性皮炎的男女病人(25～34岁)，在他们的脸，手，腿，躯干，颈部，手臂和背部上观察到皮疹，受检者症状是中度至严重。受检者症状(搔痒症)据病人自诉分为轻度，中度和严重的级别。自使用起2周至2月后，病人再次就诊，并评价效果。结果，完全反应的病例(皮疹显著改善和受检者症状几乎消失)是4个(44％)，部分反应的病例(皮疹轻微改善和受检者症状减轻)是4个(44％)，没有变化的病例是1个(11％)，变坏的病例是0个(一个样本体征检验p＜0.03)。从上面结果确定有效率是89％。
小麦发酵提取物的止痛作用实施例2所制备的小麦发酵提取物溶解在蒸馏水中，并将其按每只小鼠0.2ml给用灌胃器使小鼠口服。90分钟后，给小鼠腹腔注入0.7％醋酸。在观察小鼠5分钟后，算出30分钟内引起的扭动数。结果如表16所示的与蒸馏水对照相比抑制30％扭动数的每个样本所需的。来源于小麦发酵提取物的低分子量脂多糖的有效活性是1，小麦发酵提取物的有效活性是7，显示小麦发酵提取物显现卓越的止痛作用。
[表16]小麦发酵提取物对老鼠身上醋酸引发的疼痛的止痛效果
小麦发酵提取物对遗传过敏性皮炎的抑制作用为了检测小麦发酵提取物对遗传过敏性皮炎的作用，引进I型敏感症模型。给BALB/c雄性小鼠(每组3-4只)静脉注入抗单克隆抗体(每只小鼠1μg)。1小时后，实施例2所制备的小麦发酵提取物经皮下注入(腹部)(每只小鼠4μg)或口服(每只小鼠100μg)。又1小时后，20μL含0.25％二硝基氟苯的丙酮-橄榄油(4∶1)混合溶液作为过敏原施用于小鼠耳廓的上下表面。施用1、2、24和48小时后用厚度标准尺测量耳廓厚度。减去刚施用前的厚度得到的值(Δ)是浮肿级。药物服用对过敏原注入后1小时观察到的早阶段反应和24小时后引起的延迟反应的抑制效果是通过下列公式得到的抑制比率求得的。抑制比率＝(1-给药后耳廓浮肿Δ/对照的耳廓浮肿Δ)×100。结果如表17所示。表显示小麦发酵提取物通过皮下注入和口服抑制过敏反应。
小麦发酵提取物对过敏反应的抑制作用
小麦发酵提取物的感染预防作用为了检测小麦发酵提取物的感染预防作用，引入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染模型。给BALB/c雄鼠(6～8周龄)(每组10只)腹腔注入环磷酰胺(CY，200mg/kg)，5天后，皮下注入实施例2所制的小麦发酵提取物。3小时后，静脉注入MRSA(3×107个克隆形成单位(CFU))，检测存活天数。结果如表18所示。表显示小麦发酵提取物显现相比于生理盐水组(对照)有统计上显著差异的预防MRSA感染作用(x2检验p＜0.001)。
[表18]小麦发酵提取物对MRSA感染的预防作用
小麦发酵提取物对转移性癌的治疗作用为了检测小麦发酵提取物对转移性癌的治疗作用，引入Meth A细胞的肺转移性模型。给BALB/c雄鼠(6～8周龄)(每组10只)静脉注入Meth A癌症细胞(1×105个细胞)，12天后，连续4天皮下注入实施例2所制备的小麦发酵提取物。移植细胞后20天，进行尸体解剖，用福尔马林浸泡和固定肺。肉眼观察肺，计算结节数。结果如表19所示。表显示小麦发酵提取物显现相比于生理盐水组(对照)有统计上显著差异的Meth A肺转移性癌治疗作用(t-检验p＜0.001)。
[表19]小麦发酵提取物对Meth A肺转移性癌的治疗作用
F.涉及豆腐渣滓发酵提取物的实施例[实施例18] 豆腐渣滓发酵提取物的生产(1)1.0L水，0.2g磷酸一氢钾，1.15g磷酸二氢钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾加到2升的锥形瓶中。
(2)干燥的豆腐渣滓(20g)加入(1)中。
(3)(2)用高压锅灭菌。
(4)接种物的准备一个从小麦粉分离出的成团泛菌菌落加到5ml 2％与先前准备的成分相同的豆腐渣滓培养基中，在37℃轻轻搅拌发酵过夜(15小时)来准备豆腐渣滓发酵的接种物。
(5)全部量的(4)加入(3)中，在37℃轻轻搅拌发酵48小时。
(6)(5)中豆腐渣滓发酵溶液在高压锅中120℃加热提取20分钟。将其离心(Kubota 8800，2000rpm，10分钟)，收集上清液制豆腐渣滓发酵提取物。
(7)测量干重将0.3ml移入一个已称重的1.5ml塑料管中，冻结后，用冷冻干燥机进行冻干，称重得5.97mg。因此，(6)中豆腐渣滓发酵提取物干重是每1ml溶液中19.9mg和每1000ml总量中19.9g。
(8)以蛋白定量测定BSA为标准蛋白，用Bradford方法测量稀释10倍的样本中的蛋白量。结果如表15所示。
(9)测量核酸含量测量稀释100倍的样本在210-340nm的吸收。用260nm的吸收减320nm的吸收得到的值和按50μg/10D的DNA吸收来计算最大含量。
(10)测量糖含量以葡萄糖为标准糖通过苯酚硫酸方法测量糖含量。。
(11)通过鲎分析测量鲎活性物质含量为了测量，所用Toxi-color系统由生化学工业公司提供，和用生化学工业公司ET-1作标准鲎活性物质。测量结果如表20所示。
[表20]豆腐渣滓发酵提取物的成分含量
豆腐渣滓发酵提取物的免疫增强作用将用作人巨噬细胞的急性骨髓性白血病细胞系THP-1(1×106/250μL，含10％胎小牛血清的RPMI1640培养基)置于48孔平板中，先预培养30分钟。随即，加入250μL培养基(最终体积500μL)以使每个样本最终浓度为100～10000ng/mL。设定含有多粘菌素B(12.5μg/mL)的样本组(没有仅含多粘菌素B的100ng/mL的组)。培养4小时后，收集培养上清液和细胞。用L-929通过细胞毒素测试测量上清液的TNF活性。结果如表21所示。用豆腐渣滓发酵提取物，甚至在多粘菌素B存在的情况下也可使巨噬细胞生产TNF，但用低分子量脂多糖，在多粘菌素B存在的情况下巨噬细胞不能生产TNF。从这点，显而易见豆腐渣滓发酵提取物具有不同于低分子量脂多糖的生物活性。
[表21]巨噬细胞通过豆腐渣滓发酵提取物导致的TNF产生和由多粘菌素B导致的抑制作用(豆腐渣滓发酵提取物的TNF诱导活性)豆腐渣滓发酵提取物的TNF诱导活性和多粘菌素B的抑制作用

N.D.未做 G.涉及米粉发酵提取物的实施例[实施例20] 米粉发酵提取物的生产(1)1.0L水，0.2g磷酸一氢钾，1.15g磷酸二氢钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾加到2升的锥形瓶中。
(2)干燥的米粉(20g)加入(1)中。
(3)(2)用高压锅灭菌。
(4)接种物的准备取一个从小麦粉分离出的成团泛菌菌落加到5ml含2％与先前准备的成分相同的米粉的培养基中，在37℃轻轻搅拌发酵过夜(15小时)来准备米粉发酵的接种物。
(5)全部量的(4)加入(3)中，在37℃轻轻搅拌发酵72小时。
(6)(5)中米粉发酵溶液在高压锅中120℃加热提取20分钟。将其离心(Kubota 8800，2000rpm，10分钟)，收集上清液制米粉发酵提取物。
(7)通过鲎分析测量鲎活性物质含量为了测量，所用Toxi-color系统由生化学工业公司提供，并且用生化学工业公司的ET-1作标准鲎活性物质。米粉发酵提取物中鲎活性物质含量测得为1.7μg/mL。
米粉发酵提取物的免疫增强作用将用作人巨噬细胞的急性骨髓性白血病细胞系THP-1(1×106/250μL，含10％胎小牛血清的RPMI1640培养基)置于48孔平板中，先预培养30分钟。随即，加入250μL培养基(最终体积500μL)以使每个样品最终浓度为1～10000ng/mL。建立含有多粘菌素B(12.5μg/mL)的样品组。培养4小时后，收集培养上清液和细胞。用L-929通过细胞毒素测试测量上清液的TNF活性。结果如表22所示。用米粉发酵提取物，甚至在多粘菌素B存在的情况下也可使巨噬细胞生产TNF，但用低分子量脂多糖，在多粘菌素B存在的情况下巨噬细胞不能生产TNF。从这点，显而易见米粉发酵提取物具有不同于低分子量脂多糖和鲎阳性糖脂类的生物活性。
巨噬细胞通过米粉发酵提取物导致的TNF产生和由多粘菌素B导致的抑制作用(米粉提取物的TNF诱导活性)
H.涉及褐藻发酵提取物的实施例[实施例22] 褐藻裙带菜(brown seaweed mekabu)发酵提取物的制备(1)1.0L水，0.2g磷酸一氢钾，1.15g磷酸二氢钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾加到2升的锥形瓶中。
(2)干燥的褐藻裙带菜(20g)加入(1)中。
(3)(2)用高压锅灭菌。
(4)接种物的准备将一个从小麦粉分离出的成团泛菌菌落加到5ml与先前准备的成分相同的2％褐藻裙带菜培养基中，在37℃轻轻搅拌发酵过夜(15小时)来准备褐藻裙带菜发酵的接种物。
(5)全部量的(4)加入(3)中，在37℃轻轻搅拌发酵72小时。
(6)(5)中褐藻裙带菜发酵溶液在高压锅中120℃加热提取20分钟。将其离心(Kubota 8800，2000rpm，10分钟)，收集上清液制褐藻裙带菜发酵提取物。
(7)通过鲎分析测量鲎活性物质含量为了测量，所用Toxi-color系统由生化学工业公司提供，和用生化学工业公司ET-1作标准鲎活性物质。褐藻裙带菜发酵提取物中鲎活性物质含量测得为132μg/mL。
褐藻裙带菜发酵提取物的免疫增强作用将用作人巨噬细胞急性骨髓性白血病细胞系的THP-1(1×106/250μL，含10％胎小牛血清的RPMI1640培养基)置于48孔平板中，先预培养30分钟。随即，加入250μL培养基(最终体积500μL)以使每个样品最终浓度为1-10000ng/mL。设立含有多粘菌素B(12.5μg/mL)的样品组。培养4小时后，收集培养上清液和细胞。用L-929通过细胞毒素测试测量上清液的TNF活性。结果如表23所示。甚至在多粘菌素B存在的情况下，褐藻裙带菜发酵提取物可使巨噬细胞产生TNF，但在多粘菌素B存在的情况下，低分子量脂多糖巨噬细胞不能生产TNF。从这点，显而易见褐藻裙带菜发酵提取物具有不同于低分子量脂多糖和鲎阳性糖脂类的生物活性。
[表23]巨噬细胞由褐藻裙带菜提取物导致的TNF产生和由多粘菌素B造成的抑制作用(褐藻裙带菜提取物的TNF诱导活性)
根据本发明可廉价地生产作为安全的免疫增强剂的植物发酵提取物。通过这种方法获得的植物发酵提取物能用于包括人在内的哺乳动物(具体是家畜、宠物动物等)、鸟类(具体是饲养的鸡、宠物鸟等)、两栖类动物、爬行动物、鱼(具体是水养的鱼、宠物鱼等)和无脊椎动物的药物、动物用药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料和沐浴剂。
权利要求
1.发酵和培养的方法，其特征在于，用专与植物共生生存的兼性厌氧革兰氏阴性细菌发酵来源于可食用植物的原料，并且同时培养所述的兼性厌氧革兰氏阴性细菌。
2.根据权利要求1所述的发酵和培养的方法，其特征在于，所述的原料是专供食用的。
3.根据权利要求1或2所述的发酵和培养的方法，其特征在于，使作为碳源的淀粉发酵。
4.根据权利要求1～3任一项所述的发酵和培养的方法，其特征在于所述的兼性厌氧革兰氏阴性细菌是杆菌。
5.根据权利要求4所述的发酵和培养的方法，其特征在于，所述的兼性厌氧杆菌属于肠杆菌科。
6.根据权利要求4所述的发酵和培养的方法，其特征在于，所述的兼性厌氧杆茵属于泛茵属、沙雷氏菌属或肠杆菌属。
7.根据权利要求4所述的发酵和培养的方法，其特征在于所述的兼性厌氧杆菌是成团泛茵。
8.根据权利要求1～7任一项所述的发酵和培养的方法，其特征在于，所述的可食植物是食用谷物、海藻、或豆类、或其混合物。
9.根据权利要求8所述的发酵和培养的方法，其特征在于，来源于所述食用谷物的原料是小麦粉、米粉、小麦麦麸粉、米糠或酒糟。
10.根据权利要求8所述的发酵和培养的方法，其特征在于，来源于所述海藻的原料是褐藻粉、裙带菜粉、海带粉。
11.根据权利要求8所述的发酵和培养的方法，其特征在于，来源于所述豆类的原料是豆腐渣滓。
12.植物发酵提取物，其特征在于，其是通过根据权利要求1～11任一项所述的发酵和培养的方法得到的。
13.植物发酵提取物粉末，其特征在于，其是从根据权利要求12所述的植物发酵提取物得到的。
14.植物发酵提取物的组合物，其特征在于，其中含有根据权利要求12所述的植物发酵提取物或根据权利要求13所述的植物发酵提取物粉末。
15.根据权利要求14所述的植物发酵提取物组合物，其特征在于，所述的植物发酵提取物组合物是药物、动物用药物、准药物、化妆品、食品、功能性食品、饲料或沐浴剂。
16.根据权利要求12所述的植物发酵提取物，其特征在于，其具有甚至在多粘菌素B存在的情况下显示巨噬细胞活化能力的理化性质。
17.根据权利要求12或16所述的植物发酵提取物，其特征在于，其具有免疫增强活性。
全文摘要
本发明以提供安全和廉价地生产含有高浓度免疫增强剂的植物发酵提取物方法为目的，本发明中发酵和培养的方法是用与如小麦和苹果的植物共生生存的革兰氏阴性细菌成团泛菌来发酵植物成分例如小麦粉。可以显著增加植物所具有免疫增强作用。另外不会被来源于动物成分的杂质所污染，因而非常安全。
文档编号A61K36/88GK1856568SQ20048002777
公开日2006年11月1日 申请日期2004年9月22日 优先权日2003年9月26日
发明者杣源一郎, 河内千惠, 稻川裕之, 西泽孝志, 高桥幸则 申请人:杣源一郎, 生物医学研究集团有限公司