专利名称：一种注射型组织工程骨及其构建与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，具体是涉及一种注射型组织工程骨及其构建与应用。
背景技术：
目前，组织工程骨大多构建为支架材料负载细胞生长因子再复合种子细胞的模式。支架材料和生长因子的选择是组织工程学研究的重点内容。支架材料作为种子细胞载体，有负载细胞和缓释生长因子的作用，目前常用的支架材料多为固体类材料，其在组织工程骨的构建中已取得了令人瞩目的效果。但是，也不同程度地存在难以塑形、负载生长因子和种子细胞操作复杂、负载率不高、细胞易流失等缺陷。因此，注射型或水凝胶类材料是目前骨组织工程研究的热点。常用于骨组织工程领域的细胞生长因子有BMP、TGF-β、bFGF、VEGF等，均为外源性蛋白(异种或异体蛋白因子)。从这些生长因子的构建方法分析，包括异体骨提取和基因重组两种，其构建复杂、价格昂贵。例如，申请号为02114509.1的中国专利申请“以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料”公开了一种以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料，其采用的就是重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子。从免疫学角度看，目前常用的各类生长因子均为外源性(非自体)蛋白或多肽类，不同程度存在免疫排斥反应。研究开发构建简单、价格低廉、无免疫排斥的自体生长因子用于组织工程骨的构建，是组织工程骨进一步临床应用亟待解决的重要问题。
富血小板血浆(Plate Rich Plasma，PRP)是从全血中分离出来的含高浓度血小板的血浆。近年来的研究发现，从自体静脉血中提取的富血小板血浆(PRP)中含有多种高浓度的有利于促进骨再生的生长因子，如血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等。当PRP与氯化钙及凝血酶混合后，可促使其中血小板α颗粒释放出这些生长因子。这些生长因子对骨缺损的愈合有明显的促进作用。PRP中各种生长因子浓度比例与体内正常浓度比例相似，生长因子之间有最佳协同作用。但单纯应用PRP于局部，这些生长因子易因血循环而流失，只能在较短时间内起作用。目前，已有将PRP与固体材料如TCP或同种异体骨等复合用于口腔颌面外科修复骨缺损的报导。但将PRP与注射型材料复合用于组织工程方面则未见报导。
发明内容
针对上述现有技术状况，为了克服现有的组织工程骨难以塑形及复合细胞操作复杂及昂贵的外源性细胞因子等不足，本发明提供一种注射型组织工程骨，该组织工程骨为可注射形材料负载自体PRP再复合自体骨髓基质细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，且使用自体细胞生长因子，不存在免疫排斥问题。
本发明所述的一种注射型组织工程骨，由溶液一与溶液二组成，其中，溶液一是将自体富血小板血浆即PRP与浓度为80-100mg/ml的纤维蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，在其中加入细胞密度为5×106～10×107/ml的骨髓基质干细胞；溶液二是氯化钙和凝血酶的混合溶液，其中，氯化钙浓度为40mmol/ml，凝血酶浓度为400～1000U/ml；使用时以双联注射器分别抽取溶液一和溶液二，以体积比为9∶1～1∶1的比例混合注射，形成凝胶状组织工程骨，其中PRP所占的体积比为10～30％。
所述纤维蛋白原溶液是以浓度为2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纤维蛋白原而得到的。
本发明所述的注射型组织工程骨的各组分的浓度及比例都是经过实验摸索得到的最佳结果，因此在注入体内后会在20-30秒内迅速形成具有生物活性的凝胶状组织工程骨。
所述的骨髓基质干细胞的来源优选是取自自体红骨髓，经体外用全骨髓培养法培养增殖，细胞密度达到108数量级。
所述的PRP优选是取自自体静脉血，以二次离心法提取而得的富血小板血浆。
所述提取自体RPR的二次离心法包括以下步骤将抗凝血于20℃以3000r/min第一次离心10分钟，吸取上清及白膜层下3mm成分；同样温度下以3600r/min第二次离心15分钟，弃上层3/4上清，剩余部分即为PRP。
所述的纤维蛋白原为商品化产品，可购自广州倍绣生物技术有限公司或同类公司。
本发明的另一目的是提供一种注射型组织工程骨的构建方法。
本发明所述的注射型组织工程骨的构建方法，包括以下步骤A.材料准备
(1)种子细胞抽取红骨髓，以全骨髓培养法(金丹、裴国献等，骨髓基质细胞体外培养骨发生潜能及条件研究中华创伤骨科杂志，2000年第一期)分离培养骨髓基质细胞，所用的培养基为含15％胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至108数量级；(2)自体RPR取自体静脉血，以二次离心法提取富血小板血浆即PRP，置-70℃冰箱保存备用；以抑肽酶溶液溶解纤维蛋白原，使成溶液态，配制氯化钙-凝血酶混合溶液，其中，氯化钙浓度为40mmol/ml，凝血酶浓度为400～1000IU/ml；所述提取自体RPR的二次离心法包括以下步骤将抗凝血于20℃以3000r/min第一次离心10分钟，吸取上清及白膜层下3mm成分；同样温度下以3600r/min第二次离心15分钟，弃上层3/4上清，剩余部分即为PRP。
(3)纤维蛋白原溶液以抑肽酶溶解纤维蛋白原，使其成溶液态；(4)氯化钙-凝血酶混合溶液配置氯化钙-凝血酶混合溶液，其中，氯化钙浓度为40mmol/ml，凝血酶浓度为400～1000IU/ml；B.将自体RPR与纤维蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，超声振荡使混合均匀，得到含PRP的纤维蛋白原溶液；C.取体外增殖培养的骨髓基质干细胞，以5×106-1×108个/ml细胞密度加入步骤B所得的含PRP的纤维蛋白原溶液中，轻振荡使其混匀，得到含PRP及骨髓基质细胞的纤维蛋白原溶液，置37℃孵箱，待用；D.以双联注射器分别抽取步骤C的含PRP及骨髓基质细胞的纤维蛋白原溶液以及氯化钙-凝血酶混合溶液，通过混合针头注射，注射时含PRP及骨髓基质细胞的纤维蛋白原溶液与氯化钙-凝血酶溶液比例为9∶1～1∶1，形成粘着力较强的凝胶，其中PRP所占的体积比为10～30％，即获得所述的注射型组织工程骨。
本发明的另一目的在于提供上述注射型组织工程骨的用途。
本发明所述的注射型组织工程骨可用于制备治疗骨缺损和骨不连以及促进骨折愈合的移植物。
本发明利用纤维蛋白原溶液遇氯化钙-凝血酶混合溶液后形成纤维蛋白凝胶(fibringlue，FG)的原理，将PRP与高浓度纤维蛋白原溶液混匀后再加入氯化钙-凝血酶混合溶液，形成的纤维蛋白凝胶不仅具有封闭创面、止血、促进愈合、生物粘合等多种功能，还因其特有的纤维蛋白网状结构使其可作为药物或生长因子缓释载体。这样，在纤维蛋白凝胶形成的过程中，PRP也释放出各种生长因子。这些生长因子存在于纤维网格状凝胶中，随着纤维蛋白的降解而逐渐释放出来，可在局部维持较长期的有效生长因子浓度。溶液态的纤维蛋白原也使种子细胞的复合更为简单，且其形成的凝胶有较强的粘着能力，使种子细胞不易流失，纤维蛋白胶可注射使用，可用于微创手术或非手术治疗骨缺损和骨不连以及促进骨折愈合。
本发明所设计的技术方案是将纤维蛋白原与催化剂(氯化钙、凝血酶)等材料分开包装，术前先将PRP或MSCs与纤维蛋白原溶液混合，该过程操作简单，种子细胞与PRP液态材料易于复合，且分布均匀；术中使用时再将这种混合液与催化剂用二联注射器注入体内；在体内形成凝胶状FG，其粘着性强，使种子细胞与PRP不易流失。
本发明所设计的技术方案中，在纤维蛋白原溶液中加入一定量的抑肽酶，其主要作用为调控FG的降解以增强FG的稳定性。研究中发现，术中FG注入体内后约20秒形成果冻状凝胶，术后4周时尚有少部分FG残留，术后8周时FG已完全降解。术后动物无发热、伤口溃烂等全身表现，植入部位组织亦未发现明显水肿和炎性。这表明该复合材料无毒、无明显抗原性。
综上所述，从自体全血中提取PRP，其制备简便，价格低廉。自体PRP中富含多种有利于骨修复的生长因子如PDGF、TGF-β、VEGF等，均为自体来源，不会产生免疫排斥反应和疾病传播，所构建的注射型组织工程骨既符合经典的“细胞因子+支架材料+种子细胞”的骨组织工程模式，又可灵活应用注射型材料和自体生长因子二者的优点，操作简单，使用方便，粘着力较强，可塑性好，可在体内任意塑型成损伤部位的形状，使新骨形状完全恢复成原有的生理状态，成骨效果明确，可适用于各种不规则骨缺损、骨不连治疗，且可在局部注射应用，也可用于非手术方法治疗骨折，具有广阔的临床应用前景。
图1为本发明所述的注射型组织工程骨的扫描电镜图。
图2为术后4周时的桡骨正位X片，自左至右分别为A、B、C组。
图3为术后8周时的桡骨正位X片，自左至右分别为A、B、C组。
图4为术后12周时的桡骨正位X片，自左至右分别为A、B、C组。
图5为术后16周时的D组桡骨正位X片。
图6为术后12周时的A组(实验组)桡骨组织学切片；图7为术后12周时的C组(对照组)桡骨组织学切片。
具体实施例方式
现结合实验将本发明和实施效果作进一步说明。
实施例一骨髓基质干细胞的培养和诱导分化。
新西兰大白兔，由南方医科大学(原第一军医大学)南方医院动物所提供，采用速眠新、氯胺酮和阿托品复合液肌肉注射麻醉。双侧髂骨处抽取红骨髓3ml，肝素溶液抗凝，混入DMEM培养基，混匀后1000r/min离心10min，吸弃悬浮脂肪细胞及部分上清，过100目滤网，加DMEM完全培养基(含15％胎牛血清)接种。37℃，5％CO2孵箱培养，3天后全量换液，以后2～3天半量换液1次，待细胞铺满瓶底80％后以0.25％胰蛋白酶消化，传代培养以DMEM条件培养基(含10％胎牛血清，50ug/ml抗坏血酸，10-8ol/L地塞米松，10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠)诱导向成骨细胞分化，常规3天换液1次。取传4代内细胞(细胞密度达到108数量级)备用。所述的完全培养基含15％胎牛血清，条件培养基含10％胎牛血清，50ug/ml抗坏血酸，10-8mol/L地塞米松，10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠。
实施例二PRP的提取。
无菌条件下抽取兔耳背中央动脉血5ml，以10％枸椽酸钠0.5ml抗凝。20℃温度下以第一次以3000r/min离心10分钟，吸取上清及白膜层下3mm成分。同样温度下第二次离心3600r/min离心15分钟，弃上层3/4上清，剩余部分即为PRP。旋涡震荡器轻震使混匀。高倍显微镜下计数其血小板含量并与全血比较。本法构建的PRP中血小板数量较全血提高了4倍多。每5ml全血约制成PRP0.6ml，-70℃冰箱保存备用。
实施例三注射型组织工程骨的构建。
注射型组织工程骨由溶液A与溶液B组成。溶液A是以抑肽酶溶液溶解纤维蛋白原并与PRP以3～6∶1比例混合，在其中加入按实施例一所述方法经体外诱导分化增殖的骨髓基质干细胞，其细胞密度为5×106-1×108/ml。抑肽酶浓度为2000～6000U/ml。溶液B为氯化钙和凝血酶溶液，其氯化钙浓度为40mmol/ml，凝血酶浓度为400U/ml。使用时以双联注射器分别抽取溶液A和溶液B。以溶液A、B比例9∶1～1∶1混合注射。注入体内时在20-30秒内形成果冻状凝胶，在体外也成形成凝胶。
如图1所示，扫描电镜观察凝胶为纤维网格状结构，其内可见较多骨髓基质细胞和血小板。
实施例四构建桡骨骨缺损模型取健康新西兰大白兔，6个月龄，体重2-3kg，采用速眠新、氯胺酮和阿托品复合液肌注麻醉。无菌条件下，手术显露右侧桡骨中段，连同骨膜切除桡骨1.5cm，造成节段性骨缺损模型。
实施例五动物植入实验。
实验设计36只健康新西兰大白兔，由南方医科大学(原第一军医大学)南方医院动物所提供，按实施例四构建桡骨骨缺损模型，随机分为A、B、C三组，每组12只。所有动物术前一周按实施例二所述方法抽取耳背中央动脉血提取自体富血小板血浆(Plate Rich Plasma，PRP)。A组于术前1～2月按实施例一所述方法制备骨髓基质干细胞(MSCs)，术前30分钟将消化计数后的MSCs按实施例三所述方法构建成注射型组织工程骨，植入自体桡骨1.5cm节段性骨缺损，为实验组。B、C两组分别植入PRP+FG、FG于同样骨缺损处为对照组。纤维蛋白胶(fibrin glue，FG)是将纤维蛋白原与氯化钙、凝血酶混合后形成的一种凝胶状物。A、B、C三组逐层缝合切口，术后三天肌注青霉素40万u/日。另取4只桡骨同样部位和大小骨缺损旷置作为空白组，即D组。
术后4、8、12周时拍摄桡骨正位X线片。用放射影像学评分和图像分析X线阻射影比较骨缺损的修复情况。
检测方法(1)大体观察严密观察新西兰大白兔术后的一般情况。术后4、8、12周每组各处死2只动物取材，观察组织工程骨的表面变化、骨痂形成、骨缺损修复情况及周围组织反应。
(2)放射学检查A、B、C三组动物于术后4、8、12周均摄右桡骨正位x光片(投照距离1m，投照条件46KV，50mA，曝光时间0.14s)，D组于术后12、16周摄片，观察骨缺损愈合情况。所有照片依据Yang等(Yang CY，Simmons DJ，Lozano R.The healing of graftscombining freeze-dried and demineralized allogeneic bone in rabbits.Clin Orthop.1994，298289)的评分标准进行放射学评分。骨缺损部位x线阻射密度测定参照文献(阳富春，杨志明等，猕猴组织工程化骨构建及其修复异体骨缺损的放射学评估，中国临床康复2004；8(2)223-225)。
结果(1)大体观察术后所有兔切口未见红肿、渗血及浓性分泌物，切口均一期愈合。术后4周，A组、B组骨缺损处为大量淡红色质硬纤维组织充填，切开纤维组织见其内仍有少量胶状物，桡骨远近断端见大量纤维骨痂，A组骨痂多于B组，C组缺损处稍凹陷，为质软纤维组织生长，缺损区中心部仍有部分FG残留，未见明显骨痂。各组骨缺损周围肌肉均未见水肿。术后8周，A、B组骨缺损区均见大量连续性骨痂，呈膨胀性生长，其直径超过正常桡骨；两者无明显区别，材料已完全吸收；C组缺损仍为纤维组织充填，见少量散在骨痂生长。各组周围组织未见异常反应。术后12周，A组两只兔骨缺损处均完全愈合，局部为正常有骨膜骨组织，塑形良好，难以区分断端。B组一只兔缺损完全愈合，塑形好，另一只兔缺损处为新生骨痂充填，断端模糊。C组见远近两断端各有部分骨痂生长，骨缺损中间部仍为纤维组织。周围组织正常。D组术后16周处死时观察骨缺损大小基本同前，两骨端硬化，骨髓腔封闭，纤维组织充填髓腔，无明显骨痂生长。
(2)X片观测如图2至图4所示，A组术后4周骨缺损处呈斑片状阻射影，断端仍清晰，两断端部密度稍高。术后8周时两断端模糊，骨缺损处为连续性高密度阻射影，桡骨外部骨痂清晰，缺损处内侧尺骨皮质密度增高。12周时骨缺损处呈均匀一致高密度影，有7只兔桡骨双侧骨皮质连续，髓腔贯通，说明术后12周时骨缺损完全愈合。B组术后4周骨缺损处为连续性絮状阻射影，断端清晰。术后8周骨缺损区模糊，为连续性高密度阻射影，骨痂量增多。12周时骨缺损消失，5只骨皮质连续，塑形好，髓腔复通。C组术后4周缺损区大部呈透光影，仅断端周围见絮状阻射影。8周时见断端清晰，缺损区有小片状阻射影。术后12周见缺损区仍清晰，仅见两端有少量骨痂生长。如图5所示，D组术后16周骨缺损区仍呈透亮影，骨断端硬化、模糊，说明空白组术后16周骨缺损均无愈合。
(3)X线片影像学评分结果A、B、C组正位照片骨缺损修复评分从表1可看出，A组和B组在4、8、12周均较C组的放射影像学评分为优(P＜0.05)，但A组和B组相比较无明显差异(P均＞0.05)。正位片骨缺损部位阻射密度测量值从表2可看出，A、B、C组在4、8、12周的骨缺损阻射密度测量值有显著性差异(P＜0.05)，在新生骨痂形成的多少和密度方面，A＞B＞C。
表1 关于骨缺损修复的正位照片评分(X±s，n＝8)
表2 关于骨缺损部位阻射密度测量值(X±s，n＝8)
实验结果表明A、B组在Yang氏放射学评分及缺损区骨痂阻射密度测量方面均优于单纯FG组，而A、B两组间虽在放射学评分上无明显差别，但在骨痂形成质量上，A组优于B组。从该结果分析，PRP有明显的促进骨缺损修复作用，而种子细胞的添加对增进骨痂形成起重要作用。
如图6和图7所示，组织学切片观察见实验组为正常骨组织结构，并有髓腔形成，对照组为纤维组织结构，无明显成骨。
结论PRP对骨缺损愈合有明显促进作用，复合PRP的注射型材料与MSCs构建组织工程骨可修复兔桡骨节段性骨缺损。
在骨折的自然愈合过程中，嵌入骨折断端部位的血凝块起着重要作用，其中血凝块中的纤维蛋白和血小板聚集过程中释放的各种生长因子起主导作用。本发明中的PRP，是在术前一周抽取自体全血，经二次离心法制备出来的，其血小板浓度较全血提高了4倍余。随着FG的降解，这些生长因子逐渐释放出来并可在局部维持较长期有效浓度。Obarrio等人的研究(Obarrio J J，Arauz-Dutari J I，Chamberlain T M，etal.The use ofautologous growth factors in periodontal surgical l therapyPlateletgelbiotechnology-casereports.IntJPeriodontics Restorative Dent，2000；20(5)486)以及Soory等人的研究(Soory M，Virdi H.Implications of minocycline，platelet-derivedgrowth factor，and transforming growthfactor-bet on inflamma-tory repair potentialin the periodontium.J Periodontol，1999；70(10)1136)发现，在骨髓基质干细胞和骨祖细胞膜上存在PDGF、TGF-β1和TGF-β2受体。PRP中的PDGF和TGF-β可能通过与靶细胞(MSCs和骨祖细胞)膜上的受体结合发挥作用，促进MSCs和骨祖细胞向成骨细胞分化，从而增强新骨再生，加速骨缺损的修复。而PRP中的VEGF有促进新生血管形成作用，组织工程骨的血管化是促进新骨再生的基础，大量新生血管的形成为种子细胞提供丰富的营养，亦可促进骨缺损的修复。
基于上述分析，本发明所述的注射型组织工程骨可用于制备治疗骨缺损和骨不连以及促进骨折愈合的移植物。
权利要求
1.一种注射型组织工程骨，其特征在于由溶液一与溶液二组成，其中溶液一是将自体富血小板血浆即PRP与浓度为80-100mg/ml的纤维蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，在其中加入细胞密度为5×106～10×107/ml的骨髓基质干细胞；溶液二是氯化钙和凝血酶的混合溶液，其中，氯化钙浓度为40mmol/ml，凝血酶浓度为400～1000U/ml；使用时以双联注射器分别抽取溶液一和溶液二，以体积比为9∶1～1∶1的比例混合注射，形成凝胶状组织工程骨，其中PRP所占的体积比为10～30％。
2.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨，其特征在于所述溶液一中的纤维蛋白原溶液是以浓度为2000～6000U/ml的抑肽酶溶解纤维蛋白原而得到的。
3.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨，其特征在于所述的骨髓基质干细胞取自自体红骨髓，经体外用全骨髓培养法培养增殖，细胞密度达到108数量级。
4.根据权利要求1所述的组织工程骨，其特征在于所述的PRP是取自自体静脉血，以二次离心法提取而得的富血小板血浆。
5.根据权利要求4所述的组织工程骨，其特征在于所述提取自体RPR的二次离心法包括以下步骤将抗凝血于20℃以3000r/min第一次离心10分钟，吸取上清及白膜层下3mm成分；同样温度下以3600r/min第二次离心15分钟，弃上层3/4上清，剩余部分即为PRP。
6.如权利要求1所述的注射型组织工程骨的构建方法，其特征在于，包括以下步骤A.材料准备(1)种子细胞抽取红骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质细胞，所用的培养基为含15％胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至108数量级；(2)自体RPR取自体静脉血，以二次离心法提取富血小板血浆即PRP，置-70℃冰箱保存备用；以抑肽酶溶液溶解纤维蛋白原，使成溶液态，配制氯化钙-凝血酶混合溶液，其中，氯化钙浓度为40mmol/ml，凝血酶浓度为400～1000IU/ml；(3)纤维蛋白原溶液以抑肽酶溶解纤维蛋白原，使其成溶液态；(4)氯化钙-凝血酶混合溶液配置氯化钙-凝血酶混合溶液，其中，氯化钙浓度为40mmol/ml，凝血酶浓度为400IU/ml；B.将自体RPR与纤维蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，超声振荡使混合均匀，得到含PRP的纤维蛋白原溶液；C.取体外增殖培养的骨髓基质干细胞，以5×106-1×108个/ml细胞密度加入步骤B所得的含PRP的纤维蛋白原溶液中，轻振荡使其混匀，得到含PRP及骨髓基质细胞的纤维蛋白原溶液，置37℃孵箱，待用；D.以双联注射器分别抽取步骤C的含PRP及骨髓基质细胞的纤维蛋白原溶液以及氯化钙-凝血酶混合溶液，通过混合针头注射，注射时含PRP及骨髓基质细胞的纤维蛋白原溶液与氯化钙-凝血酶溶液比例为9∶1～1∶1，形成粘着力较强的凝胶，其中PRP所占的体积比为10～30％，即获得所述的注射型组织工程骨。
7.根据权利要求6所述的注射型组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述提取自体RPR的二次离心法包括以下步骤将抗凝血于20℃以3000r/min第一次离心10分钟，吸取上清及白膜层下3mm成分；同样温度下以3600r/min第二次离心15分钟，弃上层3/4上清，剩余部分即为PRP。
8.如权利要求1至4之一所述的注射型组织工程骨用于制备治疗骨缺损和骨不连以及促进骨折愈合的移植物的用途。
全文摘要
本发明公开了一种注射型组织工程骨及其构建与应用。所述的注射型组织工程骨，由溶液一与溶液二组成，其中，溶液一是将自体富血小板血浆即PRP与浓度为80－100mg/ml的纤维蛋白原溶液以1∶3～6比例混合，在其中加入细胞密度为5×10
文档编号A61P19/08GK1846790SQ200510034120
公开日2006年10月18日 申请日期2005年4月14日 优先权日2005年4月14日
发明者裴国献, 黄爱文, 金丹, 曾宪利, 胡稷杰, 陈书军, 张元平 申请人:南方医院