专利名称：斑蝥素类衍生物作为抗肿瘤药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药化合物领域，具体的说涉及一类化合物作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是死亡率仅次于心脑血管疾病的慢性疾病。现有的抗肿瘤药物疗效并不理想，毒副作用也较大。近年来分子肿瘤学的研究进展为肿瘤治疗提供了新的治疗途径，新靶点的发现，使抗癌药物的发展走上靶向治疗之路。然而，开发一种全新药物花费昂贵，周期长。随着中药现代化的发展，越来越多的中药有效成分的发现及其作用机理的明确，为有效寻找抗癌药物提供了许多潜在的丰富资源。现代分子构效关系理论的发展也为以某种分子为靶点设计合成药物提供了有力的支援。因此，利用计算机辅助设计，对已知作用靶点的天然抑制剂进行结构改造，以寻找有效的抗癌药物，成为寻找抗肿瘤药物的策略之一。
蛋白可逆磷酸化是生命活动最基本和最重要的调节机制，属于翻译后修饰，影响着细胞许多重要功能，例如基因表达，糖代谢，细胞周期，细胞凋亡，细胞信号神经介质传导和DNA复制等等。肿痛是多基因变化导致细胞周期紊乱，细胞失控性生长所致的一类疾病。蛋白磷酸酶2A(PP2A)正是通过调节蛋白的可逆磷酸化功能，在细胞周期中起负调控作用的一个重要因子。PP2A能通过抑制CDK活化的激酶(CAK)的活性或cdc25的去磷酸化而抑制cdk/cyclin复合物的活化，因而在细胞周期中起负调节功能。
迄今只有少数的PP2A抑制剂被发现，如okadaic acid，microcystinLR，tautomycin等(参考文献McCluskey A.，et al.J Med Chem 200245(6)1151-75)，却都因毒性大，没有临床应用价值，而唯一显示有临床价值的PP2A抑制剂是斑蝥素及其同类物。宋代名医杨士瀛的《仁济直接方论》中提出斑蝥可治肿瘤。1953年在美国人工合成了斑蝥素，中国对此药研究显示其可有抗肿瘤作用，但泌尿系统及肝毒性大，不能用于临床。80年代，王广生等合成去甲斑蝥素，毒性有所减少，临床用于肝癌、胃癌、结肠癌等肿瘤的辅助治疗。但由于对其作用机理研究较少，亦缺乏知识产权保护，一直未能成为主流抗癌药物。
1992年旅美中国学者李燕明发现斑蝥素在细胞内的作用靶点为PP2A。斑蝥素及其同系物作用于PP2A这一发现开启了重新评价斑蝥素作用及应用的大门。由于其结构简单，易于改造，澳大利亚的McCluskey和Sakoff等已经开始合成新的斑蝥素同系物的工作。其工作集中于探索系列化合物对纯化的PP2A抑制作用的构效关系，其中也发现部分化合物对肿瘤细胞的生长有抑制作用，但目前的工作仍处于实验室研究中。
发明内容
本发明的目的是针对上述抗肿瘤药物存在的问题，提供一类斑蝥素类衍生物在制备用作抗肿瘤药物中的应用。该斑蝥素类衍生物能够抑制肿瘤细胞的生长和抑制蛋白磷酸酶2A的活性。
研究人员经过大量的科学研究，证实了斑蝥素类衍生物能够抑制肿瘤细胞生长和抑制蛋白磷酸酶2A活性，在制备用于抑制肿瘤细胞生长和抑制蛋白磷酸酶2A活性的药物中有非常重要的应用，斑蝥素类衍生物的结构通式如(I)所示 其中，R1为H，R2为CH，X为O，Y为O；或R1为H，R2为CH2，X为O，Y为H2；或R1为CH3，R2为CH2，X为(OH)2，Y为O；或R1为CH3，R2为CH2，X为S，Y为O。
上述斑蝥素类似物为去甲去氢斑蝥素、去甲脱氧斑蝥素、斑蝥酸或硫杂斑蝥素。
上述的肿瘤细胞为人口腔上皮癌细胞、人胃腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、白血病细胞或肺癌细胞。
去甲去氢斑蝥素去甲脱氧斑蝥素斑蝥酸 硫杂斑蝥素本发明的有益效果本发明经过大量的实验研究发现斑蝥素类衍生物能抑制肿瘤细胞生长，并抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性。其具有开发成针对新靶点蛋白磷酸酶2A的抗癌药物的潜能，在制备治疗人口腔癌、胃癌、肝癌、结肠癌、白血病和肺癌等恶性肿瘤药物方面具有重要的开发应用前景。
图1为化合物硫杂斑蝥素对PP2A酶动力学的影响图；图2为斑蝥素对PP2A酶动力学的影响图。
具体实施例方式
实施例1去甲去氢斑蝥素(ZWN-01)的合成在圆底烧瓶中，加入恰好使1.45g(15.0mmol)顺丁烯二酸酐溶解的无水乙醚20.0mL，再加入呋喃8.10g(120.0mmol)，密封，室温放置2～3小时，有白色棱柱状晶体析出，继续放置约15小时，待白色固体不再析出为止。过滤除液体，晶体用无水乙醚洗涤5～6次后，室温下干燥，得到2.32g白色固体，产率96.6％。产物经IR谱、1H NMR谱、MS谱测定。分析结果如下IR谱(KBr)3144.8，3095.6，3065.6，3032.8，2296.9，1860.3，1788.9，1597.3，1568.8，1227.5cm-1.
1H NMR谱(300MHz，d6-Acetone)，d3.38(s，2H)，5.36(s，2H)，6.63(s，2H)FAB-MS谱m/z166([M]+，10％)。
实施例2去甲脱氧斑蝥素(CH-06)的合成冰浴下20.1mg(0.5mmol)NaBH4加入10.0mL THF中。搅拌均匀。溶于5.0mL的80.2mg(0.5mmol)去甲斑蝥素逐滴搅拌中的上述体系中，滴加完毕后移除冰浴，室温下搅拌10分钟。再加入1N的盐酸2.0mL，然后加水，经无水乙醚萃取、浓缩、柱层析纯化得40.2mg白色固体。产率为54.8％。产物经IR谱、1H NMR谱、MS谱测定。
分析结果如下IR谱(KBr)3224.7，2989.7，2958.3，2920.5，2881.1，1763.5，1198.1，816cm-1.
1H NMR谱(300MHz，CDCl3)，d4.88(d，J＝4.5Hz 1H)，4.54(d，J＝4.8Hz 1H)，4.43(dd，J＝9.0，4.2Hz，1H)，4.11(dd，J＝9.3，4.2Hz 1H)，2.81～2.69(m，2H)，1.88～1.72(m，2H)，1.62～1.47(m，2H).
FAB-MS谱m/z154([M]+，100％)实施例3斑蝥酸(LY-07)的合成在50mL圆底烧瓶中，放置斑蝥素196.2mg(1.0mmol)，加入蒸馏水20.0mL，加热至回流0.5小时，过滤、水洗、真空干燥、柱层析纯化得172.4mg白色固体。产率为80.5％。产物经1H NMR谱测定。分析结果如下1H NMR谱(300MHz，CDCl3)，d1.24(s，6H)，1.73～1.82(m，4H)，4.71(t，J＝2.4Hz，2H).
实施例4硫杂斑蝥素(LY-08)的合成干燥的斑蝥素196.2mg(1.0mmol)与Na2S·9H2O 480.0mg(2.0mmol)在室温下混和于小臼中研磨，直到混合物为淡绿色的粘稠物，同时伴随有臭鸡蛋味的气体放出。小心将反应混合物加入冰冷的10％盐酸中，经氯仿萃取、冷水洗涤，浓缩有机相、柱层析纯化得76.4mg白色固体。产率为36％。产物经1H NMR谱测定。分析结果如下1H NMR谱(300MHz，CDCl3)，d1.24(s，6H)，1.69～1.85(m，4H)，4.74(t，J＝2.4Hz，2H)实施例5斑蝥素类衍生物的体外抗肿瘤细胞增殖实验所选的细胞株包括人口腔上皮癌KB-3-1，人胃腺癌MGC803，肝癌HepG2，结肠癌LoVo，白血病HL-60和肺癌Glc82细胞株等。取对数生长期肿瘤细胞制成一定浓度的细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入一定浓度的待测药物，对照孔不加药物，每个浓度设4个平行孔。培养68小时加入MTT100ug/孔，继续培养4小时，弃去培养液，加入200ul二甲基亚砜，震荡15分钟完全溶解后，用酶标仪测定570/630nm双波长吸光光度值，用Logit法计算抑制50％细胞生长时的药物浓度(IC50)。实验重复3次，结果见表1。去甲去氢斑蝥素对胃癌细胞，白血病细胞和肺癌细胞的生长有抑制作用；去甲脱氧斑蝥素对口腔鳞癌细胞有抑制作用；斑蝥酸和硫杂斑蝥素对口腔鳞癌，胃癌，肝癌，结肠癌，白血病以及肺癌细胞的生长均有抑制作用，IC50值与阳性对照斑蝥素相若。
表1为斑蝥素类衍生物的体外抗肿瘤细胞生长活性(IC50，μM)样品 KB-3-1 MGC803 HepG2 LoVo HL-60 Glc82Cantharidin*2.7 5.4±0.4 19.1- 2.7 1.2Norcantharidin*69.5±8.5 161.9±56.9 212.9±26.2 - 15.7 5.3
去甲去氢斑蝥素 - 53.4±10.8- -159.3 17.5去甲脱氧斑蝥素 112.0±5.5 ＞200 ＞200 ＞200＞200 ＞200斑蝥酸 0.8±0.22.2±0.7 3.0±2.2 14.7 0.8 1.6硫杂斑蝥素 1.8±0.21.3±0.1 14.7±7.0 98.3 1.1 2.0*斑蝥素(Cantharidin)，去甲斑蝥素(Norcanthafidin)为阳性对照实施例6斑蝥素类衍生物的体外抑制纯PP2A酶活性实验体外抑制PP2A酶活性测定(孔雀石绿法)每孔5μl蛋白磷酸酶作用底物加到96半孔板(底物终浓度250μM)，再加3μl(即0.03单位)PP2A纯品(或PP1)，然后每孔加不同浓度的候选化合物10μl，最后一排不加药，加等体积已去除磷酸根纯净水作为空白对照，37℃孵育30min，每孔加AB混合液80μl显色10min，测定OD630nm。用Logit法计算化合物对PP2A的半数抑制浓度IC50。结果见表2。去甲脱氧斑蝥素对PP2A具有一定的抑制作用；斑蝥酸对PP2A的抑制强于PP1，IC50值与斑蝥素非常接近；硫杂斑蝥素对PP2A和PP1具有较强的抑制作用。
表2为部分斑蝥素类衍生物对PP2A和PP1的活性抑制实验(IC50，μM)样品 PP2A PP1Cantharidin*0.28 1.98Norcantharidin*0.56 1.89去甲脱氧斑蝥素61.85 N -斑蝥酸0.31 1.87硫杂斑蝥素2.85 3.05*斑蝥素，去甲斑蝥素作为PP2A抑制剂的阳性对照实施例7斑蝥素类衍生物对PP2A酶动力学影响实验在利用Malachite Green法测定PP2A酶活性的实验中，对于硫杂斑蝥素(LY-8)设定4组，终浓度分别为2.5uM、1.25uM、0.625uM、0uM；阳性对照斑蝥素终浓度为0.25uM、0.125uM、0.0625uM、0uM。每组内在每反应孔内的底物五肽(Lys-Arg-pThr-Ile-Arg)终浓度为100、150、225、325、450uM。每孔的PP2A均为0.03U。总反应体积为20ul/孔，置于37℃，反应1hr后加入Malachite Green试剂(80ul/孔)显色10min，独立实验重复4次。将测得的OD值换算成反应速度，根据米-曼氏方程的双倒数作图法得出样品对PP2A酶的抑制方式。独立实验重复4次，结果见图1和图2。由图可以看出，硫杂斑蝥素和斑蝥素对PP2A的抑制均属非竞争性抑制方式。
综上所述，上述斑蝥素类似物有发展成为抗肿瘤药物的潜力和前景。
权利要求
1.斑蝥素类衍生物在制备用于抑制肿瘤细胞生长或抑制蛋白磷酸酶2A活性的药物中的应用，所述的斑蝥素类衍生物的结构通式如(I)所示 其中，R1为H，R2为CH，X为O，Y为O；或R1为H，R2为CH2，X为O，Y为H2；或R1为CH3，R2为CH2，X为(OH)2，Y为O；或R1为CH3，R2为CH2，X为S，Y为O。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述斑蝥素类衍生物为去甲去氢斑蝥素、去甲脱氧斑蝥素、斑蝥酸或硫杂斑蝥素。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为人口腔上皮癌细胞、人胃腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、白血病细胞或肺癌细胞。
全文摘要
本发明公开了一类斑蝥素类衍生物作为抗肿瘤药物的应用。本发明的斑蝥素类似物能抑制肿瘤细胞生长并抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性。其具有开发成针对新靶点蛋白磷酸酶2A的抗癌药物的潜能，在制备治疗人口腔癌、胃癌、肝癌、结肠癌、白血病和肺癌等恶性肿瘤药物方面具有重要的开发应用前景。
文档编号A61K31/365GK1686109SQ20051003389
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月1日 优先权日2005年4月1日
发明者冼励坚, 汪波, 蔡于琛, 刘艳, 单宏波, 曾文南, 陈惠雄, 许遵乐, 刘旭辉, 范波涛 申请人:中山大学