一种丹参提取物、其制备方法、药物制剂及检测方法

专利名称：一种丹参提取物、其制备方法、药物制剂及检测方法
技术领域：
本发明涉及中药材有效部位提取物，具体涉及一种新的丹参提取物、其制备方法、含其的药物制剂及检测方法。
背景技术：
随着人口老年化趋势的增加，心脑血管疾病的发病率在增长，血液粘度增加，胸中憋闷，冠心病，心绞痛和心肌梗塞的现象较多。全世界每年有6000万病人接受肝素治疗(其中我国占1000万以上)，以防各种血栓栓塞疾病，这些症状用化学药治疗效果不尽理想，且不能兼治，中药丹参为唇形科植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，味苦，性微寒，善入心及心包经，归心、肝经，具祛瘀止痛、活血通脉、清心除烦。对丹参的药理作用的研究，自七十年代初便开展了广泛深入的研究。文献报导，具有抗氧化、抗凝、抗血栓、抗心脑缺血及调节血脂作用，对多种实验性心、肝、肺等组织损伤均有明显的保护作用，具有抗炎、增强免疫功能等多方面的药理活性。由丹参水提取物制成的“丹参注射液”，经临床应用20多年来，在治疗冠心病、心绞痛等缺血性疾病方面，临床应用取得良好效果，得到了充分肯定。对上述慢性调理性疾病，可以兼治多种症状，防治结合，取得事半功倍的效果。
几十年来，配制小针用的丹参提取物一直沿用水煮醇沉的工艺，水煮后得到的大量水提液约是药材重量的20倍，需要反复浓缩和醇沉，每次醇沉都要在冷库放置3-5天，滤过后又要浓缩，费时费事，消耗大量能源和大量乙醇，生产周期长达20多天。更为重要的是在醇沉过程中使丹参素损失达50-60％，提取物中丹参素仅占总固物量的5-10％，远达不到《中药注射剂研究的技术要求》中规定的“主成分占总固体物量不得少25％”的要求，即原工艺提取的丹参提取物中仍含有大量的无效的色素、鞣质、蛋白质和树脂状物质等。就目前丹参制剂而言，因为有效成份的含量低且不稳定，再加上药材的质量不稳定因素，使丹参制剂的质量参差不齐，临床疗效的影响较大。CN1352985公开了丹参提取物的新的制备方法，尽管比老的工艺有所改进，但制备的提取物含量依然很低，收率也低(0.4％)，这样的含量还达不到制备成注射液的要求，因此在使用上受到了限制。
现有技术中丹参提取物的含量测定方法误差较大，不能真实地反映各个成分的含量，都比实际偏高较多。丹参质量控制的方法(1)早期，丹参提取物控制质量的方法是测定溶液的紫外吸收值，用紫外吸收值不低于某值作为控制质量的指标，显然，这种方法是非常粗的；(2)后来地标升国标是用HPLC法，用丹参素和原儿茶醛作为对照品计算，250ml(相当于16g药材)含丹参素≥80mg，含原儿茶醛≥12mg，该法仅用丹参素和/或原儿茶醛来评价含有十几种成分的丹参提取物，是不全面的，其误差是很大的；(3)用丹酚酸A和/或B作为对照品测定丹酚酸A和或/B或测定总酚酸作为质量控制的标准，该法仍是用局部评价全部，无论用UV法或HPLC法，对照品丹酚酸A/B与提取物中其他成分的响应值是不同的，因此总体误差还是很大的。

发明内容
本发明公开了一种新的丹参有效部位的提取物及其制备方法，也公开了含有这种提取物的药物制剂，还公开了这种提取物的新的含量测定方法。
本发明的丹参有效部位提取物(下称丹灵)含丹参素28-38％、原儿茶醛9-18％、丹酚酸B 29-38％，以上百分比均为占总固体物的重量百分比。有效部位总量占总固体物的82％(重量百分比)以上，这是迄今已有的丹参提取物远远达不到的，同时这个重量百分比也是用了本发明的检测方法测出的量，相对有技术测定的方法要精确得多，如果用现有技术中的紫外检测，本发明的有效部位总量占总固体物量可达200％以上，此也佐证了原UV法的不合理性。
本发明的提取物用以下方法制备得到用水加温提取，过滤，调pH1～5，过大孔树脂柱，水洗后乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，再干燥，即得。干燥可用喷雾或减压等方法干燥。另外，如果本提取物用于制备成注射制剂的话，可省去干燥这一部，直接溶于水中再制成各种注射制剂。
上述大孔树脂优选DB301、DB101和AP250中的一种或两至三种联用。最优选为仅用其中的一种树脂。
上述pH优选为2-3。最优选的是pH为2.0-2.4。
上述pH调节剂优选为5％的盐酸或5％的氢氧化钠。
上述制备方法，其中提取时用水量为药材的7-15倍，提取次数为1-3次。最优化为2次。
上述洗脱用乙醇的浓度优选为50％-95％。最优选的浓度是75％。
在对丹参有效部位提取和分离工艺的方法学研究中，将丹参水煮得到的水提液冷却、酸化、滤过，滤液直接经大孔树脂柱吸附，然后用乙醇洗脱，回收洗脱液中的乙醇至尽，得丹参提取物，具体方案如下取丹参药材，粉碎，加水煎煮2次(2h，1.5h)，合并水提液，滤过，滤液调节pH，放置2-4小时，滤过，滤液过大孔树脂柱，水洗，用乙醇洗脱，见有丹参素流出时，开始收集流出液，直至无丹参素时止，合并收集的醇溶液，减压回收乙醇至尽，即得丹灵，其主要质量指标如下丹参素≥80mg/ml；丹参素收率(以药材计)≥0.5％儿茶醛≥12mg/ml；儿茶醛收率(以药材计)＞0.15％如果进一步干燥得固体，则含丹参素28-38％、原儿茶醛9-18％、丹酚酸B 29-38％，另含有一定量的其他酚酸类有效部位，均为重量百分比。
总有效部位量占总固体物量≥82％；总有效部位收率(以药材计)＞1.3％。
本发明的制备方法及其所得产物与原水煮醇沉的工艺相比，生产周期大大地缩短，质量得到稳定和提高，省时省事，节省了大量的乙醇和能源，成本明显降低，设备的利用率提高，使丹参提取方法和制备成的注射剂的质量提高到一个新的水平，色泽和澄明度得到明显的改善，使中药提取规模工业化生产成为可能。
用本法制备的丹灵，可用于制备注射用丹灵/丹灵氯化钠注射液/丹灵葡萄糖注射液和口服制剂。配制注射剂方法先将丹灵加水稀释，加辅料溶解后，再加针用活性炭煮沸30分钟，脱炭，再按输液生产的常规方法配制；配制口服制剂取丹灵加入适量辅料，喷雾制粒，从而制成缓释、控释、肠溶和滴丸等剂型。该法制得的产品有效部位含量得到了明显的提高，质量稳定可控，有利于工业化生产。
本发明提供的总有效部位含量测定方法是目前测定有效部位最接近实际质量的测定方法，即分别用原儿茶醛、丹参素、丹酚酸B作为对照品，计算这三种成分的含量。具体是先用液-质联用或气-质联用法确定提取物中各成分的保留时间及与各保留时间相对应的质谱和分子量，与文献报道的成分逐一对照，先给各成分定性，从而确定各有效成分。进而对各成分用HPLC进行分离和鉴定，最后用对照品对照计算出总有效部位的含量。原儿茶醛、丹参素、丹酚酸B这三种成分之和约占总有效部位的70-90％。除这三种成分以外的其他已证明是有效成分的总和用丹酚酸B(因为丹酚酸B的响应值比较适中)为对照品计算含量，约占总有效部位的10-30％。无法确认是有效成分的峰均不计算。上述计算的四部分之和即为总有效部位的量。用上述方法计算的总有效部位含量，相对来说，是比较合理，比较准确的。
本课题组对多种方法制备的丹参提取物进行了含量测定，所用测定方法为本发明的新的测定方法，被测物分成三组，一组为传统的水煮醇沉工艺制得的丹参提取物(简称老工艺)、一组为CN1352985A中实施例1所报道的方法制得的提取物(简称已知专利工艺)、一组为本发明的丹参提取物(简称新发明工艺)，各技术参数见表1表1 丹参提取物新老工艺主要技术参数比较表

从表1可知，本发明的丹参提取物比现有技术提取物有效部位含量有了很大的提高，不仅含量高，而且用本发明提取的收率也比现有技术高得多。
具体实施例方式
实施例1丹灵的制备丹参16.0kg水 12倍量共制2500ml取丹参药材，粉碎成粗粉，加12倍量的水煎煮2次(2h，1.5h)，合并水提液，滤过，滤液调节pH为2.2，放置3小时，滤过，滤液过大孔树脂柱DB301，水洗树脂柱至流出液几乎无色，流尽柱中的水，用50％乙醇洗脱，见有丹参素流出时，开始收集流出液，直至无丹参素时止，合并收集的醇溶液，减压回收乙醇至尽，喷雾干燥即得。
测得各成分的重量百分比为丹参素30％；原儿茶醛10％；丹酚酸B31％。
总有效部位量占总固体量为83％。
注A.按上法制备的丹灵已由南京医科大学临床药理研究所经药效学、一般药理、急性毒性、长期毒性和特殊安全性等试验证实，本品的疗效确实、毒副作用较小，为一安全有效的药物；B.所用树脂溶剂残留量已经江苏省理化测试中心测定，各项检测指标均符合规定。
实施例2丹灵的制备丹参16.0kg水 14倍量共制2500ml取丹参药材，粉碎成粗粉，加14倍量的水煎煮2次(2h，1.5h)，合并水提液，滤过，滤液调节pH为2.0，放置3小时，滤过，滤液过大孔树脂柱DB301和DB101，水洗树脂柱至流出液几乎无色，流尽柱中的水，用60％乙醇洗脱，见有丹参素流出时，开始收集流出液，直至无丹参素时止，合并收集的醇溶液，减压回收乙醇至尽，喷雾干燥即得。
测得各成分的重量百分比为丹参素35％；原儿茶醛12％；丹酚酸B30％。
总有效部位量占总固体量为85％实施例3注射用丹灵冻干粉针剂的制备量取由实施例1方法得到的丹灵，按表2的处方，加水溶解，加甘露醇，针用活性炭搅拌20分钟，脱炭，经0.22μm微孔滤膜滤过，在无菌洁净的环境下，灌装于15ml西林瓶中，照冷冻干燥常规方法，冷冻干燥48小时，扎盖，印字，包装。
表2 注射用丹灵冻干粉针剂的处方组成(1000瓶)

实施例4丹灵氯化钠注射液的制备量取由实施例1方法得到的丹灵，再按表3处方称取氯化钠，加新鲜制备的注射用水溶解，加0.1％针用活性炭搅拌20分钟，脱炭，经0.22μm微孔滤膜滤过后，灌装于250ml输液瓶中，加塞扎盖，于115℃灭菌，全检，包装即得。
表3 丹灵氯化钠注射液的处方组成(250ml×1000瓶用量)

实施例5丹灵葡萄糖注射液的制备量取由实施例1方法得到的丹灵，再按表4处方称取葡萄糖，加新鲜制备的注射用水溶解，加0.1％针用活性炭搅拌20分钟，脱炭，经0.22μm微孔滤膜滤过后，灌装于250ml输液瓶中，加塞扎盖，于115℃灭菌，全检，包装即得。
表4 丹灵葡萄糖注射液的处方组成(250ml×1000瓶用量)

实施例6丹灵滴丸的制备量取由实施例1方法得到的丹灵，加1倍量的乙醇稀释，搅匀，喷雾干燥得丹灵粉，再按表4处方称取丹灵粉和聚乙二醇6000，热熔后按滴丸的一般制备方法制成滴丸，全检，分装，包装即得。
表4 丹灵滴丸的处方组成

实施例7丹参的有效部位的含量测定法1)有效部位的确认据文献报道，丹参水溶性成分如上所述，各成分的结构式、分子式和分子量亦有文献报道(肖培根主编新编中药志化学工业出版社2002年1月212页；陈惠芳主编植物活性成分词典第一、二册中国医药科技出版社2001年7月)。为此我们先采用液-质联用的方法对本品中的各成分进行了分离并测定分子量，根据测得的分子量，对液-质色谱图中各成分峰进行定性，并确定丹灵(有效部位)中各成分在色谱图中的相对保留时间，再用相对保留时间对供试品溶液在液相色谱图中的各成分进行定位。以求出丹灵(有效部位)的总量。丹灵(有效部位)中各成分确认的研究内容如下(1)仪器与试剂仪器 Agilent1100LC/DAD/MSD试剂 甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯。
(2)色谱条件色谱柱Kromasil C18(4.6×250mm 5μm)柱温25℃ 流速1.0ml/min流动相A1％冰醋酸水溶液B1％冰醋酸甲醇溶液线性梯度洗脱0～55分钟 A∶B＝9∶1～0∶10；55～65分钟A∶B＝0∶10进样量20μl检测波长279nm质谱条件离子化方式ESI(-)质量扫描范围m/z 105-1000传输电压70V干燥气流速10.0L/min 喷雾气压力40psig干燥气温度350℃ 毛细管电压4000V(2)测定方法精密量取丹灵(丹参提取物)1ml，置250ml量瓶中，加水适量，摇匀，滴加10％的氢氧化钠溶液边加边振摇至溶液澄清，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取此溶液20μl注入液-质联用仪，记录色谱图，结果见表5。
表5 不同批号样品中各成分的相对保留时间表


注(1)表中数据为“丹灵(有效部位)中各个成分峰的保留时间/丹参素峰保留时间”(2)()即为每个成分的相对保留时间结论多批样品经测定后，表中的平均相对保留时间即为丹灵(有效部位)中各成分在液相色谱图中定位用的相对保留时间。
2)丹灵(有效部位)的含量测定仪器、试剂及对照品仪器HP-1100高效液相色谱仪，VWD检测器，惠普G2170AALC色谱工作站。
试剂甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯。
对照品丹参素钠及原儿茶醛均由中国药品生物制品检定所提供丹酚酸B对照品自制(结构经质谱和核磁确认)色谱条件色谱柱Kromasil C18(4.6×25cm 5μm)流动相A1％冰醋酸的水溶液，B1％冰醋酸的甲醇溶液线性梯度洗脱0～55分钟 A∶B＝9∶1～0∶10；55～65分钟 A∶B＝0∶10检测波长279nm 流速1ml/min
流动相的选择 因在采用HPLC的等度洗脱时，有效成分出峰时间较长，且丹参中所含大分子量的丹酚酸类组分即有效成分不能被洗脱，故选用了梯度洗脱。在梯度洗脱中，考虑到丹参水溶性成分中多为酚性酸类物质，故在流动相中加入了一定比例的冰醋酸；尝试不同的梯度洗脱，以使洗脱时间较短、基线较平稳，分离的效果较佳。测定条件即为本品指纹图谱的色谱条件。
检测波长的确定取丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B对照品各适量，分别加水制成一定浓度的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)在200～400nm波长范围内扫描。
结论由UV图可看出，丹参素在279nm波长处有较强吸收，而原儿茶醛及丹酚酸B在279nm波长处也有吸收，故拟定检测波长为279nm。
3)空白试验 取空白溶剂20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
结论由图谱可见空白溶剂对样品测定无干扰。
4)柱效及分离度取供试品溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算丹参素峰与相邻成分峰、原儿茶醛峰与相邻成分及丹酚酸B峰与相邻成分峰之间的分离度及理论板数。
结论丹参素峰、原儿茶醛峰及丹酚酸B峰各与相邻成分峰之间的分离度均大于1.5，理论板数按丹参素峰计算为23676，测定结果均符合规定。
工作曲线丹参素工作曲线；原儿茶醛工作曲线见一般药学文献。
丹酚酸B工作曲线 取丹酚酸B对照品，加水制成3.683mg/ml溶液，作为贮备液，分别精密量取贮备液0.5、0.8、1.0、1.2及1.5ml于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，照含量测定项下的方法，测其峰面积(S)。求得回归方程S＝23.736C+225.92，r＝0.9997(n＝5)，结果见表6。
表6 工作曲线测定结果

结论当浓度在184.2μg/ml～552.4μg/ml范围内，线性关系良好。
精密度试验 取丹参素对照品溶液，连续进样5次，记录色谱图，结果见表7。
表7 精密度试验结果

结论精密度试验结果RSD为0.45％，精密度较好。
稳定性试验 取同一份供试品溶液，于不同时间，取20μl注入液相色谱仪，记录其色谱图，照含量测定项下方法，测其含量，结果见表8。
表8 稳定性试验结果

结论稳定性试验结果RSD为1.37％。
加样回收试验 取已知丹参素、原二茶醛及丹酚酸B含量的丹灵5份，分别加入一定量的丹参素对照品，原二茶醛对照品及丹酚酸B对照品，照含量测定项的方法分别测定含量，结果见表9-11。
表9 丹参素回收试验结果

结论加样回收试验结果，平均回收率为100.2％。
表10 原二茶醛回收试验结果

结论加样回收试验结果，平均回收率为100.09％。
表11 丹酚酸B回收试验结果

结论加样回收试验结果，平均回收率为99.17％。
重复性试验 取同一批号供试品6份，照含量测定项下方法，测其含量，结果见表12。
表12 重复性试验结果

结论本品重复性试验结果RSD为3.17％。
丹灵(有效部位)含量测定方法照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部VI D)试验。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以1％冰醋酸水溶液为流动相A，以1％冰醋酸甲醇溶液为流动相B；流速为每分钟1.0ml，梯度洗脱，检测波长为279nm，丹参素峰、原儿茶醛峰及丹酚酸B峰各与相邻成分峰之间的分离度均应符合规定，理论板数按丹参素峰计算应不低于2500。
测定法 精密吸取丹灵(丹参提取物)1ml，置250ml量瓶中，加水适量，摇匀，滴加10％的氢氧化钠溶液边加边振摇至溶液澄清，再加水稀释至刻度，摇匀。作为供试品溶液；另取丹参素钠、原儿茶醛及丹酚酸B对照品各适量，加水溶解并制成每1ml中含丹参素160μg、原儿茶醛25μg及丹酚酸B239μg的混合溶液作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，梯度洗脱，0～55分钟时，流动相A∶流动相B＝9∶1～0∶10，55～65分钟时，流动相A∶流动相B＝0∶10，记录色谱图，供试品溶液色谱图中丹灵(有效部位)各成分峰的位置按下表中的相对保留时间确定。分别量取丹参素峰面积、原儿茶醛峰面积和丹灵中(有效部位)其它成分峰面积的和，按外标法以峰面积分别计算出供试品中丹参素、原儿茶醛含量，并以丹酚酸B对照品为对照，计算丹灵中(有效部位)其它成分含量。三者含量之和即为丹灵(有效部位)总含量。丹灵(有效部位)各成分的相对保留时间见表13。
表13 丹灵(有效部位)各成分的相对保留时间表

注同一个名称(如丹酚酸A)出现两个不同的相对保留时间，是因为它有两个立体异构，余类推。
供试品含量测定根据丹灵(有效部位)含量测定方法，对三批样品的有关含量进行了测定，结果见表14。
表14 三批供试品含量测定表

与差之和计算无效率。
(三)、观察方法1、单用本发明的止痒酊(肤尔舒止痒酊)，共478例，用药前对患者临床症状、体征进行评价，用计分法记录，要求患者持续用药1周，停药3天后复诊判定止痒效果。
2、三种药物分组对照观察采用单盲法，共2000例随机分为三组，使三种病机会均等的进入各组，进行对照观察。A组60例，用本发明的止痒酊治疗，B组73例，用皮炎宁酊(呼和浩特中药厂生产，成份不详，批号93054)治疗，C组67例，用消炎止痒水(参照河南卫生厅，1984年编《河南省药品标准》配制，主要成分为蜀羊泉.龙葵.冰片.徐长卿等)治疗。治疗和观察方法同前。
3、安全性观察记录副作用，必要时停用该药.。
结果一、478例止痒效果观察结果见表1表1 478例止痒效果观察 例(％)

二、200例三种药物止痒效果对照观察结果见表2。
权利要求
1.一种丹参有效部位提取物，其特征是含丹参素28-38％、原儿茶醛9-18％、丹酚酸B29-38％，以上百分比均为占总固体物的重量百分比。
2.权利要求1的提取物的制备方法，包括用水加温提取、过滤、过树脂柱、水洗后乙醇洗脱、洗脱液回收乙醇至尽、干燥，其特征是水提过滤液在过树脂前调pH1～5，树脂柱选用大孔树脂。
3.权利要求2的制备方法，大孔树脂选自DB301、DB101和AP250中的一种或两至三种联用。
4.权利要求2的制备方法，其中pH为2-3。
5.权利要求2的制备方法，其中pH为2.0-2.4。
6.权利要求2的制备方法，其中pH调节剂为5％的盐酸或5％的氢氧化钠。
7.权利要求2的制备方法，其中用水量为药材的7-15倍，提取次数为1-3次。
8.权利要求2的制备方法，其中洗脱用乙醇的浓度为50％-95％。
9.一种药物组合物，含有权利要求1所述的丹参有效部位提取物及药学上可接受的载体。
10.权利要求1的提取物的含量测定方法用儿茶醛、丹参素、丹酚酸B作为对照品，先用液—质联用或气—质联用法确定提取物中各成分的保留时间及与各保留时间相对应的质谱和分子量，从而确定各有效成分，进而对各成分用HPLC进行分离和鉴定，最后用对照品对照计算出总有效部位的含量。
全文摘要
本发明涉及中药材有效部位提取物，具体涉及一种新的丹参提取物、其制备方法、含其的药物制剂及检测方法。本发明丹参有效部位提取物含丹参素28－38％、原儿茶醛9－18％、丹酚酸B 29－38％，由于其有效部位含量高，因此可以制备成注射液用于临床，治疗冠心病、心绞痛等缺血性疾病。本发明还公开了新的检测方法。
文档编号A61P9/00GK1679811SQ20051003778
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月4日 优先权日2005年2月4日
发明者邢为藩 申请人:邢为藩