专利名称：氧化低密度脂蛋白衍生物治疗动脉血栓形成的活性物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种氧化低密度脂蛋白系列衍生物作为治疗动脉血栓形成的应用，还可以用于治疗自身免疫性疾病如抗磷脂综合症或动脉血栓症。进一步的涉及的活性物质为(1)、7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate；(oxLig-1)(2)、7-ketocholesteryl-13-carboxytridecanoate；(13-COOH-7KC)(3)、7-ketocholesteryl-12-carboxy(keto)dodecanoate(oxLig-2)技术背景免疫耐受是一种机体免疫系统对再次接触的特异性抗原呈现无应答或低应答的现象。机体对自身抗原通常呈自身耐受。机体自身免疫耐受的崩溃，产生自身抗体等自身免疫应答，形成自身免疫性疾病。在自身免疫性疾病中，口服耐受是用于描述减弱自身免疫疾病的免疫应答的免疫术语。通过给动物喂食“致病抗原”而产生的耐受，由于对免疫应答的麻痹作用，可以消除或减弱疾病的发生。口服耐受已经应用于自身免疫疾病领域中，如给与风湿性关节炎患者口服胶原蛋白II和热休克蛋白HSP-65进行口服免疫耐受治疗时，促使机体的自身免疫耐受恢复，患者的病情得到了显著的抑制和改善，此外，在糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎等疾病中，应用口服免疫耐受治疗方法也开展了人体实验。所以，对于自身免疫性疾病的治疗来说致病性自身抗原的确认是至关重要的。
隶属于系统性红斑狼疮症的抗磷脂综合症(antiphospholipidsyndrome；APS)正是一种临床上十分难治的一类自身免疫性疾病，其临床的主要症状就是动脉硬化以及动静脉血栓的形成、胎盘血管的病变导致的习惯性流产和血小板减少等症状。血清学特征为大量自身抗体的存在。其中抗心磷脂抗体由于与血栓形成、血小板减少、系统性红斑狼疮、习惯性流产等凝血系统改变密切相关，所以抗心磷脂抗体可作为系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的辅助诊断指标及抗磷脂综合症诊断依据之一，也可作为临床上预测血栓形成趋势的标志。
研究证实抗心磷脂抗体(aCL)的真正抗原并不是心磷脂Cardiolipin，而是存在于血清中的一种糖蛋白β2-glycoprotein I(β2-GPI)。所以抗心磷脂抗体也被称为抗β2-糖蛋白I(β2-glycoprotein I；β2-GPI)抗体。Romero(Br.J.Rheumatol.37883-888，1998.)等报告指出，抗β2-糖蛋白I(β2-GPI)抗体可能是APS患者发生动脉血栓的一种标志，抗心磷脂抗体(aCL)既抗β2-GPI抗体导致的血栓形成机理仍然不明，主要有A.凝固亢进细胞膜由磷脂双分子层构成，疏水部分朝向细胞膜内侧。血小板和血管内皮细胞的细胞膜外侧主要富含有神经磷脂(鞘磷脂)，内侧则主要由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等阴性磷脂组成。血小板受到活化时如果血管内皮细胞受到破坏，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸即向着细胞膜外侧移行，血液凝固开始。β2-GPI通过与移行到细胞膜外侧的阴性磷脂酰丝氨酸的结合而与血管内皮细胞结合，产生抑制血液凝固的作用。但是，APS患者血清中存在的抗β2-GPI抗体与β2-GPI的结合消除了β2-GPI的抗血液凝固作用。所以APS患者发生血液凝固亢进。虽然多数学者倾向于这种可能的发病机制，但in vivo有关抗β2-GPI抗体与这些细胞结合的证据几乎没有，而且，从理论上讲，由于糖蛋白和糖脂的空间位阻作用及带阴离子磷脂仅限于细胞膜的胞浆内面，因而这种结合是不可能的。
B.动脉硬化关于动脉硬化，虽然有血栓学说、血浆浸润学说、流体力学动脉壁代谢异常学说、脂质学说等多种假说，但任何一种单一的假说都不能解释动脉硬化的发生机理。在1976年，Ross(N.Engl.J.Med.295369-377.1976.)等提出了伤害反应学说(response-to-injuryhypothesis)，后来在1986年(N.Engl.J.Med.314488-500，1986).和1993年(Nature.362801-809，1993)Ross对这一学说又进行了修改和补充。既动脉硬化的发生是血管壁细胞与血液细胞在多种炎症性细胞因子和增殖因子作用下，发生相互作用所产生的一种动脉壁对血管损伤的炎症反应过程。单核-巨噬细胞系统是细胞防御中的主要细胞。在动脉硬化发病初期过程中，在各种炎症、细胞因子及增殖因子作用下，单核细胞分化成熟为巨噬细胞，巨噬细胞表面的Scanvenger receptor能够不受调控的识别吞噬氧化后的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的胆固醇酯，形成泡沫细胞，这种泡沫细胞是组成动脉硬化巢的主要成分。而LDL的氧化(oxLDL)被认为是引起粥状动脉硬化和血栓形成的独立危险因子。
在动脉粥样硬化的发生发展中，众多的理论研究和实验结果证实了LDL的氧化扮演了非常重要的角色，为了探索动脉粥样硬化的发病机理，在体外研究中，几种主要的LDL的实验模型是MDA-LDL、acetylated-LDL和Cu2+-LDL，在这些实验模型中，Cu2+-LDL显示了作为体外实验模型的优势，Cu2+能够诱导LDL氧化，导致LDL结构的高度破坏，产生了多种oxLDL的氧化产物。Cu2+所导致的LDL的破坏和产生的氧化产物与几种细胞(如血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等)诱导的LDL氧化以及从动脉硬化巢中所提取的oxLDL具有非常相似的性质和结果，而且在动脉硬化巢中提取出来的oxLDL展示了与Cu2+-oxLDL相似的物理和免疫学性质。而MDA是一个亲水性的短链乙醛结构，它很容易从LDL中分离和扩散，在透析之后，oxLDL的TBARS分离物减少到无法检测的低水平。所以，这已经成为一种共识，即将Cu2+-oxLDL作为一种体内外实验研究动脉硬化的自身抗原。
β2-GPI是抗磷脂综合症抗心磷脂抗体的主要抗原，具有结合如心磷脂(cardiolipin)等阴性磷脂、活化血小板及雕亡细胞膜表面暴露出来的磷脂酰丝氨酸的性质。近年来，通过对β2-GPI的变异蛋白质及体外合成多肽的研究以及结晶构造体的解析，发现β2-GPI的第五个domain上，特别是C281KNKEKKC288领域存在着与脂质结合的部位，更确切地说，结晶构造体表明，在第五个domain上K317与T318的位置如果发生断裂，β2-GPI与磷脂的结合活性消失。最近，George等报告在对LDL受体缺乏小鼠进行β2-GPI免疫之后，发现β2-GPI促选了小鼠动脉壁脂肪斑的形成。还报告在人动脉硬化巢中含有丰富的β2-GPI，并且是与CD4-阳性淋巴细胞共存。Lin等报告冠心病(CAD)患者血清LDL升高的同时，HDL、apoA-1和β2-GPI显示了低于正常人的水平。越来越多的证据表明β2-GPI卷入了脂蛋白和脂质的代谢中。这些结果和现象与Ross等提倡的伤害反应学说相加在一起，表明既不仅是各种细胞因子和免疫细胞，而且β2-GPI也显示了对动脉硬化发生和发展过程中重要的调节作用。
Hasunuma(Clin.Exp.Immunol.，107；569-573，1997.)等首次报告了β2-GPI和抗β2-GPI抗体与巨噬细胞介导的Cu2+-oxLDL吞噬摄取的相关性研究结果。in vitro实验中通过添加β2-GPI，呈现β2-GPI浓度依赖性的抑制oxLDL的摄取吸收。这一结果表明，β2-GPI与oxLDL的结合，可能竞争性地阻碍了巨噬细胞表面清道夫受体(Scavenger receptor)与oxLDL的结合，这一现象同样在Scavenger receptor的另一种磷脂的脂质体(Liposome)中得到证实，表明β2-GPI可能本身是一种抗动脉硬化的蛋白质。相反，上述实验在添加抗β2-GPI抗体之后，巨噬细胞吞噬摄取oxLDL呈现显著的增强。
中国专利99814030.9利用oxLDL、β2-GPI以及热休克蛋白组合物口服诱导免疫耐受治疗血管性疾病，然而，口服诱导免疫耐受药物中的oxLDL是使用完整的oxLDL颗粒，而且其活性衍生物为溶血卵磷脂然而，β2-GPI与oxLDL的结合是由什么结构位点来介导，仍然不清楚。当使用完整的oxLDL进行免疫时，如果所使用的颗粒含有大量的引起动脉粥样化免疫反应的结构时，可能会产生不良效果。所以，鉴定和分离oxLDL作为有效抗原的抗原决定基，显得十分的重要。
发明内容
本发明就是要解决氧化低密度脂蛋白衍生物作为预防和治疗动脉粥样硬化和血栓形成药物的活性问题，更有效的发挥药效及更有效与β2-GPI结合发挥药效，提供了一种预防和治疗动脉粥样硬化和血栓形成的oxLDL衍生物及与β2-GPI作为自身抗原的药物组合物。
本发明氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的药物，其特征在于其中的氧化低密度脂蛋白衍生物是一种结构为7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物，7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物单独或与β2-GPI联合组成的药物。因此，本发明提供了一种预防和治疗动脉粥样硬化和血栓形成的oxLDL衍生物与β2-GPI作为自身抗原的药物组合物，这一组合物包括Cu2+-oxLDL活性衍生化合物7-酮胆固醇酯的一种或几种ω-COOH衍生物，以及它们与β2-GPI的混合物。研究结果表明介导β2-GPI与oxLDL特异性结合的是一种结构为7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物。oxLDL与β2-GPI特异性结合的抗原决定基结构--7-酮胆固醇酯ω-COOH系列衍生物，这些抗原决定基由于能够进行化学合成，较之oxLD具有性质稳定、价廉低成本易于操作和储存等优点。
7-酮胆固醇酯ω-COOH系列衍生物与β2-GPI作为自身抗原因此，本发明人首先分离了与β2-GPI特异性结合的来源于oxLDL的一种配体，将其命名为oxLig-1，通过LC-MS及NMR方法确定其化学结构为7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate。随后本发明人又分离了另一种来源于oxLDL的配体，将其命名为oxLig-2，质谱分析其化学结构为7-ketocholesteryl-12-carboxy(keto)dodecanoate。同时化学合成了另外一种与β2-GPI特异性结合的配体，将其命名为13-COOH-7KC，其化学结构为7-ketocholesteryl-13-carboxytridecanoate；研究表明，这些配体介导了oxLDL与β2-GPI的特异性结合，并且结合的活性中心就是这些配体结构中7-酮胆固醇的第三位所连接的短链脂肪酸末端的羧基团，毫无疑问，oxLDL的阴性基团即7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物直接卷入了oxLDL与β2-GPI的特异性结合以及巨噬细胞吞噬摄取oxLDL的过程。
体外实验还表明β2-GPI分别与7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物oxLig-1、oxLig-2和13-CooH-7KC的复合物与致病性自身抗体尤其是IgG型血栓高危险性自身抗体特异性结合，经由巨噬细胞吞噬摄取，同时临床检测实验数据表明，β2-GPI与oxLig-1结合的复合物循环于SLE尤其是抗磷脂综合症和动脉血栓患者血液中，抗心磷脂抗体与抗β2-GPI-oxLig-1抗体呈现了很好的相关性，提示β2-GPI与oxLig-1的这种结合与磷脂与β2-GPI的结合位点可能是一致的。这一系列衍生物与心磷脂一样，可能与β2-GPI的C281KNKEKKC288特异性区域结合，诱导了β2-GPI第四结构域的抗原决定基暴露，导致致病性自身抗体与之结合，诱发动脉硬化与血栓的发生和发展。
上述结果表明了oxLDL抗原决定基7-酮胆固醇酯ω-COOH系列衍生物中的一个或多个通过与血清糖蛋白β2-GPI的特异性结合诱导了体内的保护性免疫性反应，可能激活了抗动脉粥样硬化免疫反应的原因。
因此，含有这些抗原决定基的衍生物与β2-GPI的复合物作为抗磷脂综合症的致病性自身抗原意味着在人类中研究出抗动脉粥样硬化和血栓形成的免疫疗法或“诱导口服免疫耐受”的可能性，进一步的，这些衍生物与β2-GPI的组合物作为自身抗原可以用于治疗人类的动脉粥样硬化和血栓形成。
本发明人从抗磷脂综合症动脉硬化与血栓形成发明机理中存在针对oxLDL的免疫应答和β2-GPI与oxLDL结合的复合物循环于SLE尤其是动脉血栓患者和抗磷脂综合症患者血液中，抗心磷脂抗体与抗β2-GPI-oxLDL抗体呈现了很好的相关性之间的相互关系，并结合在小鼠和兔中oxLDL的活性疫苗可以阻止粥样动脉硬化的发生、β2-GPI口服耐受减轻抗磷脂综合症发病以及风湿性关节炎等自身免疫性疾病口服自身抗原进行口服免疫耐受治疗取得显著效果、尤其是本发明所得出的结果等事实，得出以下结论oxLDL衍生物单独或与β2-GPI联合用于包括人类在内的抗磷脂综合症时，是完全可行的，可以诱导免疫耐受，导致动脉硬化和血栓形成的进度减慢。
按照本发明，7-酮胆固醇酯ω-COOH系列衍生物的三种活性物质oxLig-1、oxLig-2和13-CooH-7KC，由于共同享有与β2-GPI结合的活性中心结构，均能够与β2-GPI特异性结合，导致抗β2-GPI抗体的特异性识别免疫反应，所以，7-酮胆固醇酯ω-COOH系列衍生物的三种活性物质无论oxLig-1、oxLig-2和13-CooH-7KC单独或与β2-GPI的混合组合物均能够降低抗磷脂综合症小鼠模型自身抗体效价，减弱自身抗体诱导的动脉硬化与血栓形成，有助于促使自身免疫耐受恢复，减少和减弱动脉硬化与血栓形成的发生和发展。
本发明还提供了一种治疗和预防动脉粥样硬化和血栓形成的方法，既口服给与上述药物组合物，诱导患者自身免疫耐受恢复，减少和减弱动脉硬化与血栓形成的发生和发展。
诱导免疫耐受抗原药物的组合与制备药物组合本发明提供了一种预防和治疗动脉粥样硬化和血栓形成的诱导口服免疫耐受的抗原药物组合物，这一组合物包括Cu2+-oxLDL活性衍生化合物7-酮胆固醇酯的一种或几种ω-COOH衍生物，β2-GPI以及它们与磷脂脂质体的结合物和混合物。
药物制备依照本发明用于口服给予的药用组合物是按照本身已经清楚的方法制备的。以及其给予也是按照已知的口服给予方法。
治疗动脉硬化和血栓形成的疾病的有效量取决于一些平常的因素，例如所述疾病的性质以及严重性和哺乳动物的体重。
对于口服给予，最好以单位剂量组合物的形式给予所述活性成分。这些组合物是通过混合制备的，并适合于以片剂、胶囊、口服液体制剂、粉剂、颗粒剂等形式口服给予。
用于口服给予的片剂和胶囊通常呈现为单位剂量，并包括常规的赋形剂，如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、添味剂和甜味剂。片剂可以按照本领域的已知方法进行包装。
可用的合适填充剂包括纤维素、甘露醇、乳糖和其他相似填充剂。合适的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉衍生物入淀粉羟基乙酸钠。合适的润滑剂包括例如硬脂酸镁。药学上可接受的合适润湿剂包括硫酸月桂酯钠。
这些固体口服组合物可以通过掺和、填充或压片的常规方法制备。重复的掺和操作可以使得活性剂均匀分散在使用了大量填充剂的那些组合物中，当然，这样的操作在本领域是常规的。
口服液体制剂可以使某些形式，例如油性悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂，或者是作为干粉，在使用前用合适的介质重建。这些液体制剂可以包括一些常规添加剂，例如悬浮剂，如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或清华食用脂；乳化剂，例如卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸脂或阿拉伯胶；非水性介质(可以包括食用油)，例如杏仁油、分级椰子油、油性脂例如甘油脂、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如羟基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯(proply)，以及如果需要，可以包括常规添味剂或着色剂。
口服形式也包括常规的缓释制剂，例如具有肠溶衣的片剂或颗粒剂。
下面对本发明的具体实施例作进一步详细说明。
本发明并非限制于说明性实施例的细节，因此，本发明实施方案和实施例是例证性的而不是限制性的，并且参考所附的权利要求书，而不是下面的描述，因此权利要求书等同物的含义和范围内的所有变化，都将包括在本发明中。
图1为oxLDL衍生物的结构模式2为实施例1口服oxLig-1对抗磷脂综合症小鼠自身抗体的作用对比直方3为实施例2口服oxLig-1和β2-GPI对抗磷脂综合症小鼠自身抗体的作用对比直方图实施方案的基础描述材料和方法动物W/B F1雄性小鼠(Kiwa Laboratory Animals Co.，Ltd)一种APS实验模型小鼠。
oxLDL衍生物oxLig-1的分离提纯采用密度梯度超速离心法(35000rpm/min，4℃，24h)分离低密度脂蛋白LDL(d＝1.019-1.063g/ml)。Cu2+氧化法进行LDL体外氧化，LDL蛋白浓度为100μg/ml，CuSO4浓度为5μM，37℃8小时孵育后EDTA 1mM中止反应。PBS透析24小时。氧化后的oxLDL采用thiobarbituric acidsubstance(TBARS)反应及琼脂糖电泳测定oxLDL的氧化程度。oxLDL来源的脂(lipid)点样于硅胶-薄层层析板(Polygram，Machery-Nagel，Duren，Germany分离配体用)和PLC硅胶-60层析板(PLC silica gel-60 Merck，Darmstadt，Germany分离脂)，层析板分别在三氯甲烷/甲醇/30％氨水/水(120/80/10/5溶液A)以及三氯甲烷/甲醇(8/1溶液B)溶媒中展开，展开后，分离脂的层析板分别进行碘和钼兰试剂染色。TLC薄层层析得到的来源于oxLDL粗制β2-GPI配体进一步通过逆相HPLC分析和精制。
β2-GPI配体粗制样品在C18柱(250×4.6mm Sephasyl peptide，Pharmacia)上经过溶媒C(氰化甲烷/异丙醇30/70，v/v)和溶媒D(0.2％醋酸水溶液)的浓度流动相{(50％溶媒C-50％溶媒D混合液(0分钟)-100％溶媒C(15-40分钟)}溶出，流速在0.5ml/min，234nm的吸光度检测测定。HPLC精制分离后的β2-GPI配体样品在LC/MS-QP8000α(Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)HPLC系统，APCI法经Shim-pack VP-ODS柱(150×4.6mm)分析。
oxLDL衍生物oxLig-1的化学合成7-ketocholesterol(5-cholesten-3β-ol-7-one，50.1mg，0.13mmol)和azelaic acid(70.6mg，0.38mmol)溶于4ml丙酮中，随后加入1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(WSC；95.8mg，0.50mmol)和4-(dimethylamino)Pyridine(DMAP；30.5mg，0.25mmol)。混合物在室温下，经过两天搅拌、离心，用三氯甲烷抽提，抽提物用2M的hydrochloricacid、brine连续洗涤，anhydrous magnesiumsulfate(无水酒石酸硫酸盐)干燥。干燥成分经过silica凝胶柱层析得到合成的β2-GPI配体oxLig-1(36.0％mg，产量为50.4％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ＝5.71(s，1H，H-6)，4.78-4.69(m，1H，H-3)；13C-NMR(75.5MHz，CDCl3)δ＝202.5，179.7，173.4，164.5，127.1，72.4，55.2，50.4，50.2，45.8，43.5，39.9，38.7，36.6，36.1，29.2，28.9，28.4，25.3，25.0，24.2，23.2，23.0，19.3，17.7，12.4.；m/z(FD-MS)571[(M+H)+，C36H59O5]β2-GPI的纯化β2-糖蛋白I通过Heparin-Sepharose、DEAE-cellulose层析柱以及抗β2-糖蛋白I亲和层析柱分离纯化12)，最后用protein A-Sepharose层析柱除去IgG，并且通过n-butanol除去结合的脂质成分。
β2-GPI的重组表达β2-糖蛋白I是一个已知的糖蛋白质，它的氨基酸和核酸序列已被报告，然而生物活性β2-糖蛋白I在通常的E.coli和酵母表达体系中由于不能够形成功能二硫键，所以不能够正确表达蛋白，主要原因是天然β2-糖蛋白I分子中有多达11个半胱氨酸(S-S)键，并且还具有一个反复折叠所形成的五个结构域结构，此外，β2-糖蛋白I的编码核苷酸序列的先头蛋白有一个突变的蛋白附加物，是由19个氨基酸组成的多肽，位于在N-末端，在蛋白分泌时这个多肽应该被切割掉。1993年Igarash利用baculovirus病毒表达体系解决了这一难题，所重组的β2-糖蛋白I与抗磷脂综合症患者的抗心磷脂抗体发生了特异性免疫反应，表明利用这一方法获得的β2-糖蛋白I具有生物学活性。(Clin，Exp.Immunol；93，19，1993)β2-GPI依赖性的抗心磷脂抗体的ELISA测定心磷脂(CL)浓度为50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon1B(Dynex Technologies Inc.，Chantilly)ELISA培养板中，物理干燥吸附后，1％BSA封闭，随后依次加入β2-GPI(15μg/ml，50μl/well)和血清样品(用0.3％的PBS以1∶100稀释，50μl/well)，室温下共同孵育1小时，最后与辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG抗体孵育1小时，显色后490nm的吸光度测定。在上述各步骤之间，酶标板用0.05％Tween 20的PBS充分洗净。
抗β2-GPI-oxLig-1复合物抗体的ELISA测定化学合成的oxLDL衍生物(Syn-oxLig-1)浓度为50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon 1B(Dynex Technologies Inc.，Chantilly)ELISA培养板中，物理干燥吸附后，随后的步骤等同于“β2-GPI依赖性的抗心磷脂抗体的ELISA测定”抗β2-GPI抗体的ELISA测定β2-GPI浓度为10μg/ml，以50μl/well的量加入96孔氧化聚丙乙烯酶标板上(carboxylated，Sumilon C-type，Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)，物理干燥吸附后，1％gelatin封闭，随后依次加入抗β2-GPI单克隆抗体(100μl/well)或者血清样品(用0.3％的PBS以1∶100稀释，100μl/well)，室温下共同孵育1小时，最后与辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG、IgM或者抗鼠IgG抗体、孵育1小时，显色后490nm的吸光度测定。在上述各步骤之间，酶标板用0.05％Tween 20的PBS充分洗净。
细胞因子水平的检测小鼠处死后取出脾脏细胞和腹腔巨噬细胞，利用oxLig-1分别培养脾细胞和巨噬细胞4天，收集上清液。检测在细胞培养上清中细胞因子的分泌情况(MCP-1、TGF-β、IL-4、IL-10和IFN-γ)细胞形态学观察油红O染色，显微镜下观察，脂滴染成红色，胞核为蓝色。
具体实施例方式实施例1oxLig-1对抗磷脂综合症小鼠的诱导免疫耐受作用NEW x BXSB(WB)F1雄性小鼠，是一种系统性红斑狼疮样实验小鼠模型，具有抗磷脂综合症样症状，这一小鼠产生抗CL抗体，并且抗CL抗体随着年龄的增加抗体效价也增加。
将小鼠分为3组每组10只小鼠。
空白组12周龄F1小鼠10只，不进行任何口服物质实验；对照组每隔一天给小鼠喂食5剂吐温80∶水(1∶8)oxLig-1组每隔一天给小鼠喂食5剂溶于吐温80∶水(1∶8)的1mgoxLig-1。
上述3组于5周后眼眶取血处死，主要检测上述3种自身抗体，观察免疫耐受情况。
结果表明，oxLig-1诱导系统性红斑狼疮样实验小鼠口服免疫耐受，显著降低了上述3种自身抗体的效价，尤其是抗β2-GPI-oxLig-1复合物抗体效价的降低更为显著(图2)。
实施例2oxLig-1对抑制高脂肪食物所导致的诱导免疫耐受作用LDL-RD(LDL-受体缺陷小鼠，Jackson)，给小鼠连续喂食4周左右的含胆酸的高胆固醇食物，小鼠会患上高血脂症，并发生明显的粥样动脉硬化。将小鼠分为3组，每组10只小鼠。
空白组在开始所述饮食之前，不给小鼠喂食任何东西。
对照组每隔一天给小鼠喂食5剂吐温80∶水(1∶8)oxLig-1组每隔一天给小鼠喂食溶于吐温80∶水(1∶8)的1mg oxLig-1。
上述2组于5周后处死，主要检测血清脂质分布规律，细胞形态学观察、抗β2-GPI-oxLig-1复合物抗体的ELISA测定等。
结果表明，空白组和对照组小鼠血清VLDL和LDL胆固醇水平显著增高，HDL含量减少。oxLig-1实验组小鼠血清VLDL和LDL胆固醇水平有所下降，HDL含量有所上升，但无显著性差异。对其中血浆胆固醇水平超过1400mg/dl的小鼠主动脉瓣膜和冠状动脉的病变部位进行油红O方法染色评估脂肪纹损伤(Rubin EM et al；Nature，353265-267，1991)结果表明，喂食oxLig-1的小鼠产生的粥样动脉硬化减少25-30％。
实施例3oxLig-1和β2-GPI的混合物对抗磷脂综合症小鼠的诱导免疫耐受作用实验程序与oxLig-1对抗磷脂综合症小鼠的诱导程序和检测指标相同。
结果表明，oxLig-1和β2-GPI的混合物诱导系统性红斑狼疮样实验小鼠口服免疫耐受，同样显著降低了上述3种自身抗体的效价(图3)。
权利要求
1.一种氧化低密度脂蛋白衍生物作为治疗动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的活性物质，其特征在于氧化低密度脂蛋白衍生物是一种结构为7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物，7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物单独或与β2-GPI的组合物。
2.如权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的药物，其特征在于氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物来源于Cu2+氧化的低密度脂蛋白的脂成分。
3.如权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的药物，其特征在于氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物其主要活性成分7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物来源于oxLDL脂中胆固醇亚油酸的氧化产物。
4.根据权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的药物，其特征在于所述7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物组合物包括Cu2+-oxLDL活性衍生化合物7-酮胆固醇酯的一种或几种ω-COOH衍生物。
5.根据权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的药物，其特征在于7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物活性物质为下列中的一种或两种或三种(1)、7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate；(oxLig-1)(2)、7-ketocholesteryl-13-carboxytridecanoate；(13-COOH-7KC)(3)、7-ketocholesteryl-12-carboxy(keto)dodecanoate(oxLig-2)。
6.根据权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的活性物质，其特征在于载有7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物的脂质体。
7.根据权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的活性物质，其特征在于7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物与天然或重组β2-GPI的复合物。
8.根据权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的活性物质，其特征在于载有7-酮胆固醇酯的ω-COOH系列衍生物与β2-GPI的脂质体复合物。
全文摘要
氧化低密度脂蛋白衍生物作为动脉硬化和血栓形成诱导免疫口服耐受的药物，其特征在于其中的氧化低密度脂蛋白衍生物是一种结构为7－酮胆固醇酯的ω－COOH系列衍生物，7－酮胆固醇酯的ω－COOH系列衍生物单独或与β
文档编号A61P7/00GK1833646SQ20051004606
公开日2006年9月20日 申请日期2005年3月18日 优先权日2005年3月18日
发明者刘庆平, 刘华 申请人:大连大学