专利名称：青藤碱在治疗视网膜神经变性类疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的新用途，具体的说是青藤碱在治疗视网膜神经变性类疾病中的应用。
背景技术：
青藤碱(sinomenine，SIN)是从防己科植物青风藤sinomenium scutum Rehd.et Wils.根茎部提取得到的生物碱单体，是一种已知的药用物质，其化学名为7，8-didehydro-4-hydroxy-3，7-dimethoxy-17-methyl，(9α，13α，14α)-morphinan-6-one其分子式为C19H23N04，分子量为329.38。化学结构式如下所示。
从化学结构上看，SIN由氢菲核和乙胺桥构成，结构与吗啡类似。本品为长丝状晶体，熔点161℃，易溶于氯仿，丙酮，乙醚，微溶于水。其盐酸盐为长丝状晶体，熔点233℃。
目前研究证实SIN具有多方面的药理作用，青藤碱作为一种治疗药物，已经有产品出售，例如，湖南黔阳地区制药厂生产的青藤碱，武汉市中联制药厂生产的盐酸青藤碱粉剂等。
概括起来讲，目前已经知道的青藤碱的主要药理作用如下镇痛、抗炎、降压、抑制中枢、抗心律失常等作用[张士善，等，药学学报1960，8177；凌秀珍，等，药学学报1962，9393；赵德化，等，药学学报，1985，20865；张明发，陕西新医药，1981，1057]；对机体非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有抑制作用，尤其对T淋巴细胞的功能有较强的抑制作用[彭慧敏，等，青藤碱的免疫抑制作用，中国药理学报1988，9377]；青藤碱又是一种组织胺释放剂[冯经义，等，药学学报，196512492]；临床上治疗类风湿关节炎疗效显著[张欣，等，陕西中药，1980，513]；有人还对青藤碱治疗类风湿关节炎的作用机理进行了研究[王勇，等，中华风湿病学杂志，2003，7415；方勇飞，等，医药导报，2003，22，519]。已授权专利CN1199623A也公开了青藤碱在治疗眼科免疫性疾病方面的应用，但到目前为止，还没有有关青藤碱治疗视网膜神经变性疾病的报道。
视网膜神经变性疾病是一组原因不明的中枢神经系统疾病，几种主要的变性疾病包括增龄性黄斑变性、视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变等。本组疾病的共同病理特点为受累部位神经元的萎缩、死亡和星形胶质细胞增生。
如增龄性黄斑变性一般病因不明，至今除一些支持疗法外，尚无特效治疗，也提不出根本性的预防措施。渗出型增龄性黄斑变性早期视网膜下新生血管位于黄斑中央凹200μm以外者，可用激光光凝，封闭新生血管膜，以免病变不断发展。激光光凝仅是为了封闭已经存在的新生血管，并不能阻止新的新生血管形成，是治标而不治本。同时激光稍一过量，本身又可以使脉络膜形成新生血管。
虽然增龄性黄斑变性的发病原因目前尚不清楚，但据大量流行病学调查资料、多年来的临床病历分析，以及各种动物实验的研究表明，可能引起增龄性黄斑变性的因素有遗传因素、环境影响、先天性缺陷、后极部视网膜慢性光损伤、营养失调、免疫或自身免疫性疾病、炎症、代谢障碍、巩膜硬度的改变、中毒、心血管系统疾病等多种因素；其中黄斑区视网膜长期慢性的光损伤，可能是引起黄斑区的视网膜色素上皮及光感受器发生变性的重要基础。
视网膜色素变性是一种进行性损害视细胞的遗传性眼病，杆体逐渐被破坏。临床特点为夜盲、视野缩小、在视网膜上出现骨细胞样色素沉着。目前尚无特效疗法。一般应用血管扩张药、维生素B1，B12等，效果均不明显。同样强光刺激对本病不利，患者经常戴用遮光眼镜，以尽量避免强光刺激。
糖尿病视网膜病变是主要的致盲眼病之一。最新研究显示，糖尿病视网膜病变除了微血管病理改变外，还是一种神经组织的慢性退行性变。除了全身降低血糖以外，目前尚无有效的药物治疗办法。
鉴于这种情况，本发明人经过大量的实验研究，发现青藤碱对光损伤诱导的视网膜变性具有保护作用，从而得知其在治疗视网膜神经变性疾病中具有很好的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供青藤碱的一种新用途，具体是在治疗视网膜神经变性疾病中的应用。
经过我们的实验研究证明，青藤碱，具有对光损伤诱导的视网膜神经变性类疾病具有良好的保护作用，进一步的研究得知其在与光损伤密切相关的视网膜神经变性疾病中具有很好的疗效。
青藤碱作为视网膜神经变性类疾病的治疗药物，按照常规制剂方法都可制备，因此可以是临床上使用的任何药物剂型。
除了本发明所说的青藤碱之外，青藤碱的药物学上可接受的盐，例如盐酸青藤碱，同样具有治疗增龄性黄斑变性和视网膜色素变性的作用，因此青藤碱及其药物学上可以接受的盐在治疗视网膜神经变性疾病中的应用均属于本发明的保护范围。
青藤碱及其药物学上可接受的盐在用于制备视网膜神经变性类疾病的药物时，可以添加药物学上常用的赋性剂，如淀粉、蔗糖、乳糖、淀粉糊、糖浆、硬脂酸镁、滑石粉、氯化钠、葡萄糖、凡士林等。
青藤碱及其药物学上可接受的盐可以与其他想容的药物一起制备成治疗视网膜神经变性类疾病的药物。
具体实施例实施例1盐酸青藤碱粉剂25000mg，购自武汉市中联制药厂，药用淀粉250g，酒精适量造粒，干燥。进压片机压片，制成1000片。每片片重为275mg，含盐酸青藤碱25mg。
实施例2青藤碱20000mg，淀粉180g，二者充分混合，装胶囊，制成2000粒胶囊，每粒0.1g重，含盐酸青藤碱10mg。
试验例1盐酸青藤碱粉剂治疗光损伤诱导的视网膜神经变性类疾病中的作用为了了解盐酸青藤碱对视网膜神经变性疾病的作用，我们采用视网膜光损伤动物模型，对盐酸青藤碱的治疗作用进行了研究，现将实验结果报告如下一、材料盐酸青藤碱粉剂由陕西天城药业有限公司提供，批号为SH040628，实验时用PBS配制成200毫克/毫升，100毫克/毫升，50毫克/毫升作高、中、低剂量。每日按1毫升/公斤体重给药。
实验动物北京大学实验动物中心提供的雄性SD大鼠(重190～210克)，筛选处28只大鼠(筛选标准头部视动跟踪反应阳性)进入实验。上述动物均饲养于二级条件(12小时光照，12小时黑暗)。
光损伤仪北医仪器厂。工作参数绿光，波长580nm，箱内照度950±50lux，箱内温度23～26度。
二、方法1、实验分组与给药1)正常对照组
2)模型对照组光照射24小时3)治疗1组高剂量SIN(200mg/kg)+光照射24小时组4)治疗2组中剂量SIN(200mg/kg)+光照射24小时组5)治疗3组低剂量SIN(200mg/kg)+光照射24小时组正常对照组和模型对照组给予PBS，体积均为5毫升/公斤体重，给药途径为腹腔注射，整个疗程为5天。
2、冰冻切片各组动物均于光损伤结束48小时后过量麻醉下取动物眼球，取颞上方视网膜，立即冰冻，置于-20□，1天后切片，切片厚度为10微米。
3、主要观察项目1)光损伤SD大鼠感光细胞层组织结构变化(电镜和光镜)2)TUNEL3)CD11b三、结果1、光损伤SD大鼠感光细胞层组织结构变化1)、光镜观察正常对照组视网膜结构完整，形态规则，各层间分界清晰，内外核层较厚，细胞核密集；模型对照组光照24小时光感受器细胞损伤更明显，外节分解，显著变薄，几近消失，残留外节也已失去正常排列结构，视细胞内节不能于外节区分；外核层细胞核数目明显减少，染色加深、固缩，散乱排列，大部分碎解、消失，仅残留3～5层细胞，与内核层分界不清，厚度明显小于内核层。
治疗1组视网膜结构完整，形态规则，各层间分界清晰，内外核层较厚，细胞核密集。
治疗2组光感受器损伤明显减轻，结构较完整，外核层比内核层厚。
治疗3组光感受器细胞外节分解，变薄；视细胞内节不完整，不易与外节区分，外核层细胞数目明显减少，染色加深、固缩及一些不规则细胞核，散乱排列，部分碎解、消失，外核层与内核层相近，稍厚于内核层。
形态计量学如表1所示。经统计学分析，不同组别大鼠后极部视网膜外核层厚度呈现显著变化。
表一 各组大鼠颞侧视网膜外核层厚度比较组别 视网膜外核层厚度(um)正常对照组 15.23+2.12模型对照组 5.19+3.11*治疗1组12.56+3.94**治疗2组9.39+2.67**治疗3组6.18+2.052)、电镜观察正常对照组大鼠视网膜视杆或视锥由完整的外节、连接部及内节组成。视杆外节由平行的膜盘构成，外节膜盘被视网膜色素上皮细胞的微绒毛包饶。内节包括视肌样质及椭圆体。外核层细胞核中等密度，占细胞体的大部分；细胞核的大小及形态均匀一致，排列规则。
模型对照组光照射24小时后，大鼠视网膜外核层细胞数量明显减少，核呈浓缩状，形态不规则，大小不一致，排列紊乱。部分视细胞体皱缩、破碎，细胞残块被细胞膜包裹，即凋亡小体。偶见巨噬细胞，核较大，并可观察到正在吞噬凋亡的视细胞。视杆外节排列紊乱，结构模糊，甚至成破碎状。内节椭圆体内线粒体呈空泡状，视肌样质区变窄，部分呈现空泡。
治疗1组大鼠视网膜视杆或视锥由较完整的外节、连接部及内节组成。多数视杆外节由平行的膜盘构成。内节包括视肌样质及椭圆体。细胞核的大小及形态较均匀，排列较规则。
2、视细胞的凋亡1)、TUNEL检测正常对照组大鼠视网膜外核层未见TUNEL阳性细胞。
模型对照组TUNEL阳性细胞明显增多，整个外核层均匀布满TUNEL阳性染色的颗粒，染色呈环状或均匀一致状。
治疗1组大鼠视网膜外核层可见TUNEL阳性细胞。少量，可数。
治疗2组大鼠视网膜外核层可见TUNEL阳性细胞。较1组增多，可数。
治疗3组大鼠视网膜外核层可见少量TUNEL阳性细胞。较2组明显增多分布在整个外核层。
2)、形态计量学检测如表2所示。经统计学分析，TUNEL阳性细胞数在SIN治疗后明显减少。
表二 各组大鼠颞侧视网膜外核层TUNEL染色阳性细胞数变化组别 外核层TUNEL染色阳性细胞数(40倍物镜)正常对照组 2+1.45模型对照组 58.15+14.19*治疗1组12.40+3.24**治疗2组19.59+8.89**治疗3组36.18+10.26**3、CD11b对小胶质细胞的免疫标记1)、视网膜冰冻切片CD11b免疫组织化学染色正常对照组正常对照大鼠视网膜，视网膜节细胞层(GCL)、神经纤维层(NFL)及外丛状层(OPL)出现数量较少、染色较浅的阳性染色细胞，外核层未见阳性细胞。
模型对照组内层和中层视网膜CD11b阳性细胞明显增多，表现为细胞体肥大、突起呈颗粒结节状增生，提示较强的增生和分泌能力；外层视网膜CD11b阳性细胞明显增多，提示它们具有外迁的能力，胞体变圆，突起回缩，呈巨噬细胞形态。
治疗1组外层CD11b染色阳性的小胶质细胞较模型对照组明显减少。
治疗2组外层CD11b染色阳性的小胶质细胞较模型对照组明显减少，较治疗1组增多。
治疗3组外层CD11b染色阳性的小胶质细胞较模型对照组明显减少，较治疗2组增多。
实验例2青藤碱抑制非酶糖基化产物(AGEs)诱导的视网膜小胶质细胞活化小胶质细胞是存在于中枢神经系统(CNS)的游走巨噬细胞中单独的一群，在结构、特性和细胞谱系等方面有其特殊性，其功能相当活跃，约占胶质细胞总数的10-20％。视网膜小胶质细胞有两种类型基质小胶质细胞和血管周围小胶质细胞。小胶质细胞一般以静止小胶质细胞和活化小胶质细胞两种不同形式存在。正常情况下，表现为静止分支状，免疫活性下调。当发生各种病理事件后被激活。活化的小胶质细胞表现为数量增加(增殖)，形态改变(阿米巴样变)，并有迁移能力，进而发展为吞噬细胞，抗原递呈功能增强；产生神经元损伤及致炎因子，如可以产生大量的超氧阴离子、一氧化氮、花生四烯酸衍生物、兴奋性氨基酸以及其它一些潜在的神经毒素，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)，以此在神经病理方面发挥积极作用。
在视网膜神经变性疾病这一类中都存在着视网膜小胶质细胞的活化，本实验从细胞水平观察青藤碱对活化的小胶质细胞的抑制作用。
一、材料1、药物盐酸青藤碱粉剂由陕西天城药业有限公司提供，批号为SH040628。
2、实验动物本实验选取出生24小时以内的健康Sprague-Dawley(SD)乳鼠100只，由北京大学医学部实验动物科学部提供。
3、试剂小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体Serotech公司免疫组化SP试剂盒ZYMED公司；DAB kitVector公司；大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒为R&D公司产品。
二、方法1、视网膜小胶质细胞的培养取出生24小时以内的SD乳鼠，无菌条件下取眼球，置于盛有预冷的D-Hank’s液体的平皿中，在组织显微镜下取视网膜，小心剥除视网膜血管，加入适量1.25g/L胰酶(Gibco)，37□孵育消化25min，加入等体积的预冷的含血清培养基终止消化。经200目细胞筛过滤除去未消化的组织块，滤液置于无菌离心管中，1000rpm/min，离心10min，弃上清，沉淀物用适量含10％胎牛血清(Hyclone)的培养基重新混悬，调整细胞密度1×106/ml，将10ml细胞悬液接种到多聚赖氨酸(12.5μg/ml)包被过的T75(Coring)的细胞培养瓶中，置37□，5％CO2孵箱中培养，每隔4天换液1次，细胞培养到14天时，将T75细胞培养瓶置于恒温摇床上，100rpm/min的速度振摇1小时，将上清液转移到50ml离心管中，1500rpm/min离心10min，沉淀用含血清培养基重新混悬，即可用于小胶质细胞的鉴定。
2.TNF alpha，IL-1 beta，IL-6检测将纯化的小胶质细胞接种于48孔板，接种密度为5×105/孔，分别加入0，0.01，0.1，1mM青藤碱孵育1hr，然后加入0，500μg/ml AGEs，作用24hr后，取培养细胞上清液，用ELISA方法测定TNF alpha，IL-1 beta，IL-6含量。
3.激光共聚焦显微镜法测定视网膜小胶质细胞NF-ΚB的活性首先将细胞接种在35mm Petri细胞培养皿底部的盖玻片上，接种密度为1×106/ml，稳定24hr，分别加入0，0.1，1mM SIN预先孵育1hr，然后加入500μg/ml AGEs，继续作用24hr后，进行NF-κBp65-FITC荧光染色。
三、结果1、培养纯化的小胶质细胞鉴定(1)免疫细胞化学染色签定用小胶质细胞表面特异性标志CD45(绿色)和CD11b(红色)单克隆抗体进行免疫荧光染色，共聚焦显微镜下观察，小胶质细胞纯化后贴壁24小时，细胞形态不规则，CD45和CD11b阳性信号均位于细胞膜表面，两者包含共定位部分(黄色)。
(2)流式细胞术结果用CD45-FITC和CD11b-PE标记细胞，用于流式细胞术鉴定细胞纯度，结果显示CD11b阳性率为96％，CD45阳性率为83％，双阳率为82％。
2、SIN对AGEs活化的视网膜小胶质细胞释放的TNF alpha，IL-1 beta，IL-6的影响如表1、2、3所见，0.1，1mM青藤碱可显著抑制AGEs活化的视网膜小胶质细胞释放的TNF alpha，IL-1 beta，IL-6，并呈剂量依赖性，而0.01mM青藤碱无此作用。
表1 盐酸青藤碱对AGEs活化的视网膜小胶质细胞释放的TNF alpha的影响(mean pg/ml±S.E.M)组别TNF alpha浓度正常对照组 94.648+17.936AGEs组 441.836+21.211*AGEs+SIN组1mM 93.56+11.84**AGEs+SIN组0.1mM 159.57+5.87**AGEs+SIN组0.01mM449.986+22.055表2 盐酸青藤碱对AGEs活化的视网膜小胶质细胞释放的IL-1beta的影响(mean pg/ml±S.E.M)组别IL-1beta浓度正常对照组 315.57+35.32AGEs组 724.16+25.25*AGEs+SIN组1mM 192.54+41.69**AGEs+SIN组0.1mM 387.04+38.246**AGEs+SIN组0.01mM710.76+51.43表3 盐酸青藤碱对AGEs活化的视网膜小胶质细胞释放的IL-6的影响(mean pg/ml±S.E.M)组别IL-6浓度正常对照组 133.78+33.45AGEs组 694.26+47.42*AGEs+SIN组1mM 173.30+28.90**AGEs+SIN组0.1mM 579.14+30.21**AGEs+SIN组0.01mM751.99+34.043、SIN对视网膜小胶质细胞NF-ΚB活化的影响经FITC和PI双标观察视网膜小胶质细胞的NF-ΚB核移位，激光共聚焦下可见细胞象合成。正常对照组细胞几乎无NF-ΚB p65活化；AGEs 500μg/ml组细胞NF-ΚB p65活化最多，且最高荧光强度部位在细胞核内，非常明显(红色荧光的核区中绿色荧光强度明显高于正常对照组)；而在SIN 0.1和1mM剂量组明显抑制了AGEs引起的NF-ΚB p65活化(核区中绿色荧光强度较正常对照组明显减少。SIN 0.1和1Mm剂量组核区绿色荧光与胞浆区绿色荧光比值明显小于正常对照组，差异有显著性，统计学结果见表4。
表4 SIN对视网膜小胶质细胞NF-ΚB活化的影响组别 IL-6浓度正常对照组 1.042+0.34AGEs组 2.024+0.36*AGEs+SIN组1mM0.909+0.26**AGEs+SIN组0.1mM 1.103＝0.428**
权利要求
1.青藤碱及其药物学上可接受的盐在治疗视网膜神经变性类疾病中的应用
2.如权利要求1所述的应用，其特征是所述的药物学上可接受的盐为盐酸青藤碱。
3.如权利要求1所述的应用，其特征是所述的青藤碱及其药物学上可接受的盐可以添加常用的医用赋形剂加工成临床上使用的任何剂型。
4.如权利要求1所述的应用，其特征是所述的青藤碱及其药物学上可接受的盐可以与其他想容的药物一起制备成治疗视网膜神经变性疾病的药物。
全文摘要
本发明涉及一种药物的新用途，具体地说是青藤碱在治疗视网膜神经变性疾病，有代表性的疾病像增龄性黄斑变性(Age－related macular degeneration)、视网膜色素变性(pigmentary degeneration of the retina)和糖尿病视网膜病变等疾病，本发明人研究证明青藤碱都可以发挥到很好的治疗作用。
文档编号A61K31/4748GK1686130SQ200510071030
公开日2005年10月26日 申请日期2005年5月23日 优先权日2005年5月23日
发明者王爱玲, 曹安民 申请人:王爱玲