专利名称：抗生素107891、其因子a1和a2、可药用盐和组合物及其用途的制作方法
本申请是国际申请，其基于提交于2005年1月12日的美国申请[代理人案号892,280-195]，该美国申请是提交于2005年1月11日的美国申请[代理人案号892,280-499]的部分继续(continuation-in-part)申请，美国申请[代理人案号No.892,280-499]是提交于2004年7月12日的PCT/EP2004/007658的§371国家申请，PCT/EP2004/007658要求了提交于2003年7月18日的EP申请03016306.7的优先权，所有这些申请文件都通过引用整体并入本文。
本发明涉及来自微生物来源的抗生素物质，尤其是被任意地命名的抗生素107891，其是包含因子A1和因子A2的复合体，本发明还涉及其可药用盐、其可药用组合物，以及它们作为抗细菌剂的用途。
本发明的另一目的是提供用于制备抗生素107891的方法，所述方法包括培养Microbispora sp.107891(下文中称为Microbispora sp.ATCC PTA-5024)或保持有生产所述抗生素的能力的其变体或突变体，从菌丝体和/或从发酵培养液回收本发明的抗生素，通过色谱手段分离出纯的物质，以及将因子A1和A2分开。
抗生素107891是新颖的抗微生物剂，其具有肽结构，所述结构含有羊毛硫氨酸(lanthionine)和甲基羊毛硫氨酸作为组成部分。这是羊毛硫抗生素(lantibiotics)的典型特征，特别是主要对细胞壁生物合成发挥作用的亚组的典型特征。
羊毛硫抗生素是肽，其含有硫醚氨基酸——羊毛硫氨酸以及若干其它经修饰的氨基酸(H.G.Sahl and G.Bierbaum，(1998)“Lantibioticsbiosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria”，Ann.Rev.Microbiol.5241-79)。已知羊毛硫抗生素的大部分具有抗细菌活性，虽然一些已被报道为对于不同的药理学目标具有活性。基于其结构，抗细菌的羊毛硫抗生素被粗略分为两组A型羊毛硫抗生素，典型地是伸长的两性肽；而B型羊毛硫抗生素是紧凑的、球形的(O.McAuliffe，R.P.Ross and C.Hill，(2001)“Lantibioticsstructure，biosynthesis and mode of action”，.FEMS Microb.Rev.25285-308)。尼生素(nisin)是A型羊毛硫抗生素的典型代表，而actagardine(花园霉素(gardimycin))和mersacidin属于B型羊毛硫抗生素亚类。尼生素型和mersacidin型的羊毛硫抗生素都与被膜结合的肽聚糖前体脂II相互作用，但是这两类在细菌增殖过程中产生的影响并不相同。尼生素型的羊毛硫抗生素主要通过透过胞质膜来杀细菌(H.Brotz，M.Josten，I.Wiedemann，U.Schneider，F.Gotz，G.Bierbaum and H.G.Sahl，(1998)″Role of lipid-boundpeptidoglycan precursors in the formation of pores by nisin，epidermin and otherlantibiotics″，Mol.Microbiol.30317-27)，而mersacidin型的羊毛硫抗生素主要通过抑制细胞壁生物合成来杀细菌细胞(H.Brotz，G.Bierbaum，K.Leopold，P.E.Reynolds and H.G.Sahl，(1998)″The lantibiotic mersacidininhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II″，Antimicrob AgentsChemother.42154-60)。
US6,551,591B1中描述了Microbispora corallina菌株NRRLL 30420产生的两种抗生素，其分别被称为MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1。上述专利中报道的物理化学数据(例如，质谱数据、分子量、氨基酸含量)以及对LC-MS实验分析中驻留时间的比较清楚表明，抗生素107891复合体及其组分因子A1和因子A2是与抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1有所区别的化学物质。
EP0592835A2描述了抗肿瘤抗生素BU-4803TA1、A2、B、C1、C2和D。抗生素BU-4803TA1、A2和B是从Microbispora ATCC 55327(AA9966)的发酵培养液回收的，而抗生素BU4803TC1、C2和D是对抗生素BU4803TA1、A2和B分别进行转化(transformation)的产物，转化在这些抗生素贮存于二甲基亚砜中时进行。EP0592 835A中报道的关于上述抗生素的物理化学数据(例如，外观、紫外吸收、分子量、抗肿瘤活性)清楚表明，它们是与抗生素107891复合体及其因子A1和A2不同的化学物质。
菌株和发酵
在环境中分离出了Microbispora sp.107891，并根据《布达佩斯条约》的规定，于2003年2月27日将其保藏于American Type Culture Collection(ATCC)，10801 University Blvd，Manassas VA，20110-2209 U.S.A.。菌株编号为PTA-5024。
对抗生素107891的生产通过下述方法达成培养能生产其的Microbispora sp.菌株，即Microbispora sp.ATCC PTA-5024或保持有生产所述抗生素的能力的其变体或突变体；从整个培养液和/或从分离的菌丝体和/或从经过滤的发酵培养液分离出所得到的抗生素；以及通过色谱手段纯化经分离的抗生素。在任何情况下都优选在有氧条件下，在含有易于吸收的碳源、氮源和无机盐源的水性营养培养基中生产抗生素107891。通常用于发酵领域的营养培养基中的很多都可使用，但是某些培养基是优选的。
优选碳源是蔗糖、果糖、葡萄糖、木糖等。优选氮源是大豆粗粉(soybean meal)、蛋白胨、肉类提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、氨基酸、经水解酪蛋白等。可被包括进培养基的无机盐有能产生钠、钾、铁、锌、钴、镁、钙、铵、氯、碳酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根等离子的惯用可溶盐。
优选地，在发酵管或摇瓶中对生产抗生素107891的菌株进行预培养，然后用该培养物接种用于生产大量物质的发酵罐。用于预培养的培养基可以与用于更大规模发酵的培养基相同，但也可使用其它培养基。可在17℃至37℃之间培养生产抗生素107891的菌株，最优温度为28-30℃。
在发酵期间，可通过在易感(susceptible)微生物上进行生物试验和/或通过HPLC分析来监测抗生素107891的生产。抗生素107891的最大生产通常发生在发酵大约90小时之后，并且在200小时之前。
通过培养Microbispora sp.ATCC PTA-5024或能生产抗生素107891的其变体或突变体，来生产抗生素107891，并且在培养液和/或在菌丝体中找到所述抗生素。
在本说明书和权利要求书中，除非另有指明，术语“抗生素107891”指包含因子A1和A2的抗生素107891复合体。
Microbispora sp.ATCC PTA-5024的形态特征
Microbispora sp.ATCC PTA-5024在多种标准固体培养基上生长良好。使用在加入了1ml/l维生素溶液(硫胺氢氯酸25mg/l、泛酸钙250mg/l、烟酸250mg/l、生物素0.5mg/l、核黄素1.25g/l、维生素B12 6.25mg/l、对氨基苯甲酸25mg/l、叶酸500mg/l、盐酸吡哆醛500mg/l)的腐殖酸-痕量盐琼脂(Humic acid-Trace Salts Agar，以g/l表示的组成腐殖酸0.5、FeSO4·7H2O 0.001、MnCl2·H2O 0.001、ZnSO4·7H2O 0.001、NiSO4·6H2O 0.001，MOPS 2、琼脂20)上培养的培养物来测量显微尺寸。
在液体培养基(V6培养基，以g/l表示的组成右旋糖22、肉类提取物5、酵母提取物3、酪蛋白3、NaCl 1.5)中，在28℃培养6小时后没有观察到菌丝体的断裂。在腐殖酸-痕量盐琼脂(28℃培养21天后)上的显微检查揭示了有分支的、未断裂的基部(substrate)菌丝体和单轴分支的气生(aerial)菌丝体；还可看到许多长直并且少分支的气生菌丝。孢子的特征性纵向对(longitudinal pair)处于从分支侧面产生或直接从主气生菌丝产生的短孢子梗上。孢子是球形的并且不能运动。没有观察到孢子囊样体或其它特殊结构。
Microbispora sp.ATCCPTA-5024的培养特征
在28℃和200rpm下，AF/MS液体培养基(见实施例1)中对Microbispora sp.ATCC PTA-5024进行6天的培养，然后将其转移(5％接种体)至新的AF/MS液体培养基，再培养6天，最后接种(7％接种体)进100ml V6液体培养基(见实施例1)。在28℃和200rpm培养6天后，通过离心收获菌丝体，用灭菌盐水洗三次，然后稀释以提供合适的接种体。以交叉划线的方式将悬浮液的小份划线到Shirling和Gottlieb(E.B.Shirling and D.Gottlieb，(1966)″Method for Characterization of Streptomycesspecies″，Int.J.Syst.Bacteriol.16313-340)推荐的多种培养基以及S.A.Waksman(1961)″The Actinomycetes″，The Williams and Wilkins Co.，Baltimore.Vol.2328-334推荐的培养基上。
使用无淀粉的培养基ISP4(加入有1ml/l的上述维生素溶液)作为基础培养基来测定使用多种碳水化合物作为碳和能量来源的能力；每种碳源以1％(w/v)的终浓度加入。
在ISP2培养基上测定NaCl耐受性、生长的pH范围以及在不同温度下生长的能力。所有培养基都在28℃温育三周，除非特别指明，这表示21天。在自然日光下评定颜色，这使用Maerz和Paul(A.Maerz and M.R.Paul，1950-A Dictionary of Colour，2nd edition.McGraw-Hill Book Co.Inc.，New York)的色图(Colour Atlas)来进行。按照Williams et al.(S.T.Williams，M.Goodfellow，G.Alderson，E.M.H.Wellington，P.H.A.Sneath&M.J.Sackin，1983-Numerical classification of Streptomyces and relatedgenera-J.Gen.Microbiol.129，1743-1813)所述，在sloppy硝酸盐培养基中评估将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力。
在表I中记录菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的生长、菌落外观、基部和气生菌丝体颜色以及色素产生。在所用的培养基的大部分上存在营养生长，而与之不同地，它们中仅有一部分存在气生菌丝体。在所用的任何培养基上都没有显示出明显的色素化。菌株的生理特征呈现于表II中。生长和气生菌丝体的产生在17℃存在而在43℃不存在。ISP2上气生菌丝体的产生在高于6的pH下出现，但是在存在1％NaCl时不存在。
使用多种碳水化合物用以生长的能力显示于表III中。
表IMicrobispora sp.ATCC PTA-5024的生长特征
(ISP4和葡萄糖-天冬酰胺琼脂加有1ml/L的维生素溶液)
表IIMicrobispora sp.ATCC PTA-5024的生理特征。
表IIIMicrobispora sp.ATCC PTA-5024对碳源的利用
+++大量；++良好生长；+适当生长；+/-生长有所不足；-没有生长；气生菌丝体一直不存在。
Microbispora sp.ATCC PTA-5024的化学分类学特征
在28℃在旋转摇床上，于GYM培养基(葡萄糖4g/l；酵母提取物4g/l；麦芽提取物10g/l)中培养Microbispora sp.ATCC PTA-5024，收获菌丝体，用灭菌蒸馏水洗两次，随后冷冻干燥。按照Staneck and Roberts，(J.L.Staneck and G.D.Roberts，(1974)″Simplified approach to identification ofaerobic actinomycetes by thin-layer chromatography″，Appl.Microbiol.28226-231)的方法，进行对氨基酸的分析。按照Minnikin et al.(D.E.Minnikin，A.G.O′Donnell，M.Goodfellow.，G.Alderson，M.Athalye，A.Schaal and J.H.Parlett，(1984)″An integrated procedure of isoprenoid quinones and polarlipids″，J.Microbiol.Meth.2233-241)的程序提取甲基萘醌类(menaquinones)和极性脂类。通过薄层色谱来分析极性脂类(D.E.Minnikin，V.Patel，L.Alshamaony，and M.Goodfellow，(1977)″Polar lipidcomposition in the classification of Nocardia and related bacteria″，Int.J.Syst.Bacteriol.27104-117)，通过HPLC来分析甲基萘醌类(R.M.Kroppenstedt，(1982)″Separation of bacterial menaquinones by HPLC usingreverse phase RP18 and a silver loaded ion exchanger as stationary phase″，J.Liquid.Chromat.52359-2367；R.M.Kroppenstedt，(1985)″Fatty acid andmenaquinone analysis of actinomycetes and related organisms″，inChemicalMethods in Bacterial Systematics.No20 SAB Technical Series pp.173-199，M.Goodfellow and D.E.Minnikin eds，Academic Press，London)，通过气-液色谱来分析脂肪酸甲酯(l.T.Miller，(1982)″A single derivatization methodfor bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids″，J.Clin.Microbiol.16584-586；M.Sasser，(1990)″Identification of bacteria by gaschromatography of cellular fatty acids″，USFCC News Letters 201-6)。通过Minnikin et al.(D.E.Minnikin，L.Alshamaony，and M.Goodfellow，(1975)″Differentiation of Mycobacterium，Nocardia and related taxa by thin layerchromatographic analysis of whole organism methanolyzates″，.J.Gen.Microbiol.88200-204)的方法来检查分枝菌酸(mycolic acid)存在与否。
菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的全细胞水解产物含有内消旋-二氨基庚二酸作为肽聚糖的二氨基酸。占据主要地位的甲基萘醌类是MK-9(III、VIII-H4)、MK-9(H2)和MK-9(H0)。极性脂类的情况由下述物质的存在表征磷脂酰乙醇胺、甲基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-甘油、二磷脂酰-甘油、磷脂酰-肌醇、磷脂酰-肌醇甘露糖苷和含N-乙酰葡糖胺的磷脂，即，根据Lechevalier et al.(H.A.Lechevalier，C.De Brieve and M.P.Lechevalier，(1977)“Chemotaxonomy of aerobic actinomycetesphospholipidcomposition”，Biochem.Syst.Ecol.5246-260)的IV型磷脂。脂肪酸的主要组分为反异(anteiso)15:0、异16:0、n-16:0、反异17:0和10-甲基-十七烷(10-Me-17:0)，即，3c sensu Kroppenstedt(R.M.Kroppenstedt，(1985)″Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms″.inChemical Methods in Bacterial Systematics.No20 SAB Technical Series pp.173-199.M.Goodfellow and D.E.Minnikin eds，Academic Press，London)。
没有探测到分枝菌酸。
Microbispora sp.ATCC PTA-5024 16S rDNA测序
按照公开的程序(P.Mazza，P.Monciardini，L.Cavaletti，M.Sosio and S.Donadio，(2003)″Diversity of Actinoplanes and related genera isolated from anItalian soil″，Microbial Ecol.5362-372)，获得菌株Microbispora sp.ATCCPTA-5024的16rRNA基因(16s rDNA)的部分序列，即对应于全部rRNA的95％的1443个核苷酸。这示于SEQ ID NO1中。
将该序列与US6,551,591B1中报道的菌株Microbispora corallinaNRRL 30420(MF-BA-1768)的序列相比较。比对两条序列，发现1456个比对的位置中31个有所不同，它们产生了2.13％的总序列分歧。通常，共享少于97.5％的序列同一性的任何两条链属于不同物种(Stackebrandt，E.and Embley，M.T.(2000)″Diversity of Uncultered Microorganisms in theEnvironment″.InNonculturable Microorganisms in the Environment，R.R.Colwell and D.J.Grimes(eds).ASM，Press，Washington DC，pp.57-75)。因此，2％的水平的序列分歧是相当高的(Rosselló-Mora，R.，and Amann，R.(2001).″The Species Concept for Prokaryotes″.FEMS Microbiol.Rev.2539-67)，这表明Microbispora sp.ATCC PTA-5024和Microbispora corallinaNRRL 30420(MF-BA-1768)是不同菌株。
对菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的鉴定
-生产抗生素107891的菌株被归于Microbispora属、Streptosporangiaceae科，因为其具有下述化学分类学和形态学特征
-细胞壁中存在内消旋二氨基庚二酸；
-大量的MK-9(III、VIII-H4)和根据Lechevalier et al.(H.A.Lechevalier，C.De Brieve and M.P.Lechevalier，(1977)″Chemotaxonomy ofaerobic actinomycetesphospholipid composition″，Bio.chem.Syst.Ecol.5246-260)的IV型磷脂；
-3c sensu Kroppenstedt(R.M.Kroppenstedt，(1992)″The genusNocardiopsis″，inThe Prokariotes，VoI II，，pp.1139-1156，A.Balows，H.Truper，M.Dworkin，W.Harder and K.H.Schleifer eds；New York，Springer-Verlag)的脂肪酸情况；
-不存在分枝菌酸；
-在气生菌丝侧向分支的短孢子梗尖端上孢子特征性纵向对的形成。不能运动的孢子。
-16rRNA基因(16S rDNA)的部分序列，即，对应于全部rRNA的95％的1443个核苷酸(示于SEQ ID NO1中)显示出与已被描述过的Microbispora物种的16S rDNA序列的＞97％的同一性。
与其它微生物一样，生产抗生素107891的菌株的特征会改变。例如，可通过用多种已知诱变剂(例如，紫外线和化学物质，例如亚硝酸、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等)处理来获得菌株的人工变体和突变体。就本发明的目的而言，菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的所有能生产抗生素107891的天然和人工变体和突变体都视为与该菌株等同，并且因此在本发明的范围内。
抗生素107891的提取和纯化
如上文所述，抗生素107891在菌丝体和发酵培养液的经过滤级分中几乎相等地分布。
可对收获的培养液进行加工，以使菌丝体和发酵培养液上清液分开，可用水可混溶溶剂对菌丝体加以提取，以在除去没用的菌丝体后，获得含有抗生素107891的溶液。然后该菌丝体提取物可被单独加工，或与上清液合并之后一起被加工，这按照下文所述用于上清液级分的程序来进行。当水可混溶溶剂可导致对从菌丝体提取物回收抗生素的操作的干扰时，可通过蒸馏回收水可混溶溶剂，或可用水将其稀释至非干扰浓度。
术语“水可混溶溶剂”在本申请中使用时具有该术语的领域中目前给出的含义，其指在使用条件下，其可以以合理宽的浓度范围与水混溶。可用于提取本发明的化合物的水可混溶有机溶剂的例子是低级烷醇，例如(C1-C3)烷醇，例如甲醇、乙醇和丙醇；苯基(C1-C3)烷醇，例如苯甲醇；低级酮，例如(C3-C4)酮，例如丙酮和甲乙酮(ethyl methylketone)；环状醚，例如二氧杂环己烷和四氢呋喃；二醇及其部分酯化的产物，例如乙二醇、丙二醇和乙二醇单甲醚，低级酰胺，例如二甲基甲酰胺和二乙基甲酰胺；乙酸二甲亚砜和乙腈。
从生产微生物的发酵培养液的上清液回收化合物按照本身已知的技术来进行，其包括用溶剂提取、通过加入非溶剂或通过改变溶液的pH来进行沉淀、通过分配(partition)色谱、反相分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱等或两种或多种所述技术的组合来进行。用于从经过滤的发酵培养液回收本发明化合物的程序包括用水不可混溶有机溶剂提取抗生素107891，接着沉淀经浓缩的提取物，这可能通过加入沉淀剂来进行。
在这种情况下，本申请中使用的术语“水不可混溶溶剂”也具有本领域目前给所述术语的含义，其指下述溶剂，在使用的条件下，所述溶剂在合理宽的浓度范围内，与水略有混溶或者实际上不可混溶，其适用于想要的目的。
可用于从发酵培养液提取本发明化合物的水不可混溶有机溶剂的例子是
至少四个碳原子的烷醇，其可以是直的、带支链的或环状的，例如正丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、3，3-二甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2，2-二甲基-3-戊醇、2，4-二甲基-3-戊醇、4，4-二甲基-2-戊醇、5-甲基-2-己醇、1-庚醇、2-庚醇、5-甲基-1-己醇、2-乙基-1-己醇、2-甲基-3-己醇、1-辛醇、2-辛醇、环戊醇、2-环戊基乙醇、3-环戊基-1-丙醇、环己醇、环庚醇、环辛醇、2，3-二甲基-环己醇、4-乙基环己醇、环辛基甲醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、1-壬醇、2-壬醇、1-癸醇、2-癸醇和3-癸醇；至少五个碳原子的酮，例如甲基异丙基酮、甲基异丁基酮、甲基正戊基酮、甲基异戊基酮及其混合物。
如本领域已知的，从经过滤的发酵培养液提取产物可通过下述方法来改善调节pH为合适的值，和/或加入适当的有机盐，与抗生素形成在提取溶剂中可溶的离子对。
如本领域已知的，相分离可通过向水相加盐来改善。
当提取之后回收含有大量水的有机相时，进行水的共沸蒸馏可能是方便的。通常，这需要加入能与水形成最小共沸混合物的溶剂，如果必要的话，接着加入沉淀剂，以沉淀想要的产物。能与水形成最小共沸混合物的有机溶剂的例子是正丁醇、苯、甲苯、丁醚、四氯化碳、氯仿、环己烷、2，5-二甲基呋喃、己烷和间二甲苯；优选溶剂是正丁醇。
沉淀剂的例子是石油醚、低级烷基醚(例如乙醚、丙醚和丁醚)和低级烷基酮(例如丙酮)。
根据用于回收抗生素107891的一种优选程序，可将经过滤的发酵培养液与吸附基质接触，接着用极性、水可混溶溶剂或其混合物进行洗脱，在减压下浓缩至油状残余物，用上文提到的类型的沉淀剂进行沉淀。
可方便地用于回收本发明的化合物的吸附基质的例子是聚苯乙烯或混合的聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂(例如，M112或S112，Dow ChemicalCo.、AmberliteXAD2或XAD4，Rohm&Haas、Diaion HP 20，Mitsubishi)、丙烯酸树脂(例如，XAD7或XAD8，Rohm&Haas)、聚酰胺，例如聚己内酰胺、尼龙和交联的聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚酰胺-CC6、聚酰胺-SC 6、聚酰胺-CC 6.6、聚酰胺-CC 6AC和聚酰胺-SC 6AC、Macherey-Nagel&Co.，Germany；PA 400，M.Woelm AG，Germany)；以及聚乙烯吡咯烷酮树脂PVP-CL(Aldrich Chemie GmbH&Co.，KG，Germany)和受控制的孔交联葡聚糖(例如，SephadexLH-20，PharmaciaFine Chemicals，AB)。优选地，使用聚苯乙烯树脂，特别优选的是DiaionHP 20树脂。
在聚苯乙烯树脂、聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂、聚酰胺树脂和丙烯酸树脂的情况下，优选的洗脱剂是水可混溶溶剂或其水性混合物。水性混合物可含有适当pH值的缓冲液。
在这种情况下，用于本说明书和权利要求书的术语“水可混溶溶剂”也具有上文所述本领域目前给予所述术语的含义。
用于分离和纯化抗生素的后续程序可在来自培养液上清液和来自菌丝体的合并的提取物上进行。例如，当通过在吸收树脂上吸收来回收经过滤的发酵培养液中或上清液中含有的抗生素产品的部分、且用水可混溶溶剂从菌丝体中提取其中含有的抗生素产品的部分、接着吸附到吸收树脂上时，可以合并来自两组吸收树脂中每种的洗脱级分，可选地，这在浓缩之后进行，然后将其作为整体批次进行进一步加工。或者，当用于不同提取阶段的两组吸收树脂是同一类型并且具有相同功能特征时，它们可被合并到一起，可对混合物进行整体洗脱步骤，例如，用水可混溶溶剂或其与水的混合物来进行。
在任何情况下，无论是否是可用于回收粗制抗生素107891的程序，通常在从不同提取阶段产生的产品组合得到的粗制材料的混合物上进行后续纯化步骤。
对粗制抗生素107891的纯化可通过本身已知的任何技术来完成，但其优选通过色谱程序来进行。这些色谱程序的例子是报道的与回收步骤相关的那些，其还包括固定相(例如硅胶、氧化铝、活化硅酸镁等)上进行的色谱或者硅烷化硅胶上进行的反相色谱(其具有多种衍生官能团，用水可混溶溶剂或上文所述的类型的水可混溶溶剂的水性混合物来进行洗脱)。
例如，可使用制备性HPLC色谱，其中RP-8或RP-18作为固定相，用HCOONH4缓冲液CH3CN的混合物作为洗脱体系。
从纯化步骤回收的活性级分被合并到一起，在真空下浓缩，通过加入上文所述的类型的沉淀剂来沉淀，以单轮或多轮进行干燥或冻干。在产品含有残余量的甲酸铵或其它缓冲盐的情况下，它们可通过下述方法被除去将抗生素107891吸收到固相萃取柱(例如，SPE Superclean LCP18Supelco(Bellefonte PA，USA))上，接着用蒸馏水洗，用合适的水性溶剂混合物(例如，乙醇∶水)进行洗脱。然后通过除去洗脱溶剂来回收抗生素。
从而，获得经纯化的抗生素107891复合体干燥制剂，其为白色粉末。
如本领域中通常的那样，可通过大量分析程序来监测生产以及回收和纯化步骤，所述程序包括针对易感微生物的抑制试验，以及使用HPLC或与质谱偶联的HPLC的分析控制。
一种优选的分析性HPLC技术在装备有柱Waters Simmetry-shield RP8，5μ(250×4.6mm)的Waters设备(Waters Chromathography，Milford，MA)上进行，以1ml/min流速在50℃的温度洗脱。
洗脱用多步程序来进行时间＝0(30％相B)；时间＝8分钟(30％相B)；时间＝28分钟(40％相B)；相A是乙腈∶100mM甲酸铵缓冲液(pH5.0)5∶95(v/v)，相B是乙腈。UV检测仪处于282nm。
将来自柱的洗脱液将按照5∶95的比例分开，将其中的大部分(大约950μl/分钟)转移分流至光电二极管阵列检测仪。剩下的50μl/分钟转移分流至Finnigan LCQ离子肼质谱仪(Thermoquest，Finnigan MAT，San JosèCA)的ESI接口。
在下述条件下进行质谱分析
样品进口条件
Sheat气(N2)60psi；
Aux气(N2)5psi；
毛细加热器250℃；
样品进口电压设置
极性正负均有；
离子喷雾电压+/-5kV；
毛细电压+/-19kV；
扫描条件最大离子时间200ms；
离子时间5ms；
完整微扫描3；
片断持续30分钟，扫描事件正(150-2000m/z)和负(150-2000m/z)。
在这些分析性HPLC条件按下，抗生素107891因子A1和A2分别展示出13.2分钟和13.9分钟的驻留时间。在同样的HPLC系统中，Ramoplanin A2因子(L.Gastaldo，R.Ciabatti，F.Assi，E.Restelli，J.K.Kettenring，L.F.Zerilli，G.Romano，M.Denaro and B.Cavalleri，(1992)″Isolation，structure determination and biological activity of A-1 6686 Factors A′1，A′2 and A′3 glycolipodepsipeptide antibiotics″，J.Ind.Microbiol.1113-8)以7.5分钟的驻留时间被洗脱。
可通过制备性HPLC，从抗生素107891复合体的经纯化样品分离出抗生素107891因子A1和A2。
使用25分钟线性梯度洗脱(从30％至45％的相B)，以3.5ml流速，在Symmetry Prep.C18柱上，从经纯化的抗生素107891复合体(溶解于DMSO∶甲酸95∶5(v/v)中)分离和纯化因子A1。
相B是乙腈。相A是25mM甲酸铵缓冲液(pH4.5)∶乙腈95∶5(v/v)。合并含有纯的抗生素107891因子A1的洗脱级分，在真空下浓缩。冻干得到的溶液，产生作为白色粉末的纯的因子A1。
在Symmetry Prep.C18柱上，通过等度洗脱，从经纯化的抗生素107891复合体样品(溶解于乙酸∶乙腈∶100mM甲酸铵缓冲液(pH4)50∶120∶80(v/v)混合物中)分离和纯化因子A2。在7ml流速下，用100mM甲酸铵缓冲液(pH4)∶乙腈(比例为82.5∶17.5(v/v))的混合物来进行等度洗脱。合并含有纯的抗生素107891因子A2的洗脱级分，在真空下浓缩。冻干得到的溶液，产生作为白色粉末的纯的因子A2。
因为(如在2-甲氧乙醇(MCS)∶H2O 12∶3(v/v)中进行的酸/碱滴定所示)抗生素107891及其因子A1和A2含有碱性官能团，按照传统程序，它们能与合适的酸形成盐，并且它们还可以以游离碱的形式存在。
可用酸将以游离碱的形式获得的抗生素107891及其因子A1和A2转化为相应的盐，这包括无毒的可药用盐。合适的盐包括通过与有机酸和无机酸(例如，氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、马来酸、富马酸、棕榈酸、胆酸、帕莫酸(pamoic)、粘液酸、谷氨酸、樟脑酸、戊二酸、羟基乙酸、酞酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯甲磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等酸)的标准反应形成的那些盐。游离碱形式的抗生素107891及其因子A1和A2的加成盐溶于合适的溶剂(典型地，低级烷醇或低级烷醇/水混合物)，向获得的溶液中逐渐加入化学计量量的合适的选用的酸，通过加入非溶剂来沉淀出所获得的盐。然后再通过过滤或蒸发溶剂回收形成的加成盐。
或者，可以通过冻干制备实质上无水的形式的这些盐；在这种情况下，用合适的量的不可挥发酸来溶解抗生素107891或其因子A1或其因子A2与可挥发酸的盐。然后过滤溶液分离任何不可溶解的物质，以单次或多次方式冻干。
当加入合适的阴离子时想要的盐会沉淀的情况下，还可从抗生素107891或其因子A1或其因子A2的另一种盐形式的溶液获得加成盐。
本发明的非盐化合物向相应的加成盐的转化以及反过来的过程，即，本发明的化合物的加成盐向非盐形式的转化是普通技术人员知识范围内的，并被本发明所包括。
抗生素107891及其因子A1和A2的盐的形成可作用于很多目的，包括对所述抗生素107891及其因子A1和A2进行分离、纯化，以及它们作为治疗剂或者动物生长促进剂的用途。就治疗用途而言，通常使用可药用盐。
术语“可药用盐”指可用于对温血动物的治疗中的那些无毒盐。
抗生素107891复合体、其因子A1和A2以及所述因子的任何比例的混合物可原样施予，或者作为与可药用载体的混合物施予，还可联合其它抗微生物剂(例如，青霉素、头孢菌素、氨基糖苷以及糖肽)施予。
联合疗法因此包括顺序、同时以及分别施予活性化合物，施予以下述方式进行，所述方式使得被施予的第一种物质的治疗效果在施予后续物质时不会完全消失。
本发明的化合物或其可药用加成盐可被配制为适合非肠道、口服和局部施予的形式。就在涉及对抗生素易感的微生物的任何感染的治疗中进行的i.v.施予而言，非肠道制剂例如处于含有合适的增溶剂(例如，聚丙二醇或二甲基乙酰胺)和表面活性剂(例如，聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯或聚乙氧化蓖麻油)的水中，或是灭菌水中的基于环糊精或磷脂的制剂，用于注射。可注射制剂还可用合适的环糊精获得。
抗生素107891复合体、其因子A1和A2以及所述因子的任何比例的混合物还可以以合适的药用形式使用，例如胶囊、片剂或水悬浮液，用于口服施予，或者与合适的膏剂或胶冻用于局部应用。除了它们在人类和兽医用疗法中作为药剂的用途之外，本发明的化合物还可作为动物生长促进剂来使用。就此目的而言，本发明的化合物在合适的饲料中口服施予。使用的精确浓度是当消耗正常量的饲料时，提供有效于促进生长的量的活性试剂所需的。
将本发明的活性化合物加入到动物饲料中优选通过下述方法来完成制备合适的饲料预混合物，其中含有有效量的活性化合物，以及将所述预混合物并入完全的配给物中。或者，可将含有活性成分的中间浓缩物或饲料补充剂掺进饲料。此类饲料与混合物以及完全配给物被制备以及施予的方式被描述于参考书(例如″Applied Animal Nutrition″，W.H.Freedman andCO.，S.Francisco，U.S.A.，1969或″Livestock Feeds and Feeding″0 and Bbooks，Corvallis，Ore.，U.S.A.，1977)中。
抗生素107891的物理化学特征
A)质谱
在MS实验中，在配有电喷雾源的Thermofinnigan LCQ deca设备上，使用Thermofinnigan校正混合物，抗生素107891在分别对应于复合体因子A1和A2的最低同位素组成的m/z＝1124和m/z 1116处显示出了两个双质子化离子。电喷雾条件是喷雾电压4.7kV；毛细温度220℃；毛细电压3V；灌注模式10μl/分钟。从具有0.1％三氟乙酸的甲醇水80/20(v/v)中的0.2mg/ml溶液来记录谱，其被示于图1A(完全扫描低分辨率谱)和图1B(放大扫描高分辨率谱)中。
B)用Bruker FT-IR光谱仪(型号IFS48)在KBr中记录的抗生素107891的红外谱展示出在3263、2929、1661、1533、1402、1114、1026(cm-1)的吸收最大值。红外谱示于图2中。1631、1596和1346处的吸收条带归结于甲酸铵的残余量。
C)在甲醇∶H2O(80∶20的比例)中，使用Perkin-Elmer光谱仪Lambda 16获得的抗生素107891的UV谱展示出在226和267nm处的两处肩峰(shoulder)。UV谱示于图3中。
D)40℃时，在Bruker AMX 600核磁谱仪上，在甲醇-d4∶H2O(pH4.3HCl)40∶10(v/v)混合物中，记录1H-NMR谱，其中应用水抑制序列。使用3.31ppm的甲醇-d4残余信号作为内标。
抗生素107891的1H-NMR谱示于图4中。溶解于甲醇-d4∶H2O(0.01N HCl)40∶10(v/v)中的抗生素107891的1H-NMR谱在600MHz展示出下述信号组(ppm表示)，这是用MeOH-d4作为内标(3.31ppm)，[δ＝ppm，多重性(归结于)]0.93d(CH3)，0.98d(CH3)，1.07t(重叠的CH3)，1.18t(重叠的CH3)，1.26s(CH3)，1.30t(重叠的CH3)，1.62-1.74m(CH2)，1.78d(CH3)，1.80d(CH3)，2.03m(CH2)，2.24m(CH)，2.36m(CH2)，2.72-3.8m(肽性αCH)，3.8-5.2m(肽性αCH)，5.53-6.08s(CH2)，5.62d(CH双键)，6.42m(CH)，6.92d(CH双键)，7.0-7.55m(芳香族的CH)，7.62-10.4d和m(芳香族的、肽性的NH)。
E)40℃时，在Bruker AMX 600核磁谱仪上，在甲醇-d4∶H2O(pH4.3HCl)40∶10(v/v)混合物中，记录13C-NMR谱，其中使用49.15ppm的甲醇-d4残余信号作为内标。抗生素107891的去偶合13C-NMR谱bb示于图5中。
溶解于甲醇-d4∶H2O(0.01N HCl)40∶10(v/v)中的抗生素107891的13C-NMR谱在600MHz展示出下述信号组(ppm表示)，这是用MeOH-d4作为内标(49.15ppm)，[δ＝ppm，(归结于)]13.6-23.2(脂肪族CH3)，26.16-73(脂肪族的CH2以及肽性αCH)，105-136(芳香族的以及双键CH和季碳)，164.3-176.3(肽性羰基)。
F)抗生素107891复合体溶解于2-甲氧乙醇(MCS)∶H2O 12∶3(v/v)中，其中含有0.01M氢氯酸的摩尔过量。然后用0.01N氢氧化钾溶液对溶液进行反滴定。得到的滴定曲线显示出一个碱性可离子化官能团。
抗生素107891及其因子A1和A2的氨基酸组成
A)测定抗生素107891复合体中的“抗酸”氨基酸
对抗生素107891进行完全酸水解(HCl 6N，105℃，24h)，鉴定出抗酸处理的抗生素的氨基酸部分。用这种方法，酸不稳定氨基酸不能被探测到。合适的衍生化之后，通过HPLC-MS和GC-MS分析来研究水解产物，将其与经过类似衍生化的标准氨基酸的混合物相比较。对于HPLC分析而言，用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AccQ-TagTMFluor试剂盒)处理经水解的样品；对于GC分析而言，用无水甲醇中的3N HCl和三氟乙酸酐的混合物来处理样品。
在同时具有DAD和MS探测的液相色谱系统上进行定量HPLC分析。HPLC方法具有下述条件
柱AccQ-TagTM(Waters C18 NovoPak 4μm 3.9×150mm)
柱温37℃
流1mL/分钟
相A乙酸铵140mM pH5(乙酸)
相B水∶乙腈60∶40(v/v)
洗脱程序
UV探测254nm
MS条件是下述这些
质谱仪装备有标准电喷雾源的Finnigan LCQ Deca
毛细温度250℃
源电压4.70kV
源电流80μA
毛细电压-15V
在配有MS-EI探测的气相色谱上进行定量GC分析。
GC方法使用如下条件
柱J&W Scientific DB-5，30m×0.254mm ID×0.25μm FT
载气氦
注射模式无分流
注射器温度200℃
转移导管温度300℃
温度程序从50℃至100℃，以2.5℃/分钟进行(10分钟)，从100℃至250℃，以10℃/分钟进行(15分钟)，250℃进行15分钟
注射体积1μl
MS条件是下述这些
质谱仪Finigan TSQ700
离子化模式电子冲击
电压设置
灯丝电流400mA
电子倍增器1400V
电子能量70eV
正离子模式
扫描条件
扫描范围40-650amu
扫描时间1秒
在抗生素107891的水解产物上获得的LC/MS和GC/MS谱图中，鉴定出了下述氨基酸(还有其它未鉴定的峰)羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸(NMR研究表明，这是天冬酰胺的转化产物，天冬酰胺通过水解产生天冬氨酸)、苯丙氨酸和亮氨酸。
在与关于复合体报道的条件同样的条件(衍生化和HPLC-MS)下，对抗生素107891的因子A1和A2进行完全酸水解。在装备有PTV注射器的Thermo Finnigan Trace GC-MS设备上进行GC-MS分析。
GC方法具有下述条件
柱Restek RTX-5MS，15m×0.25mm ID×0.25μm FT
载气氦
界面温度250℃
温度程序50℃，1.5分钟，从50℃至100℃，以20℃/分钟进行(10分钟)，100℃，1分钟，从100℃至135℃，以20℃/分钟进行，135℃，1分钟，从135℃至250℃以20℃/分钟进行，在250℃进行1分钟
注射体积1μl
注射器无分流模式，基础温度50℃，转移温度280℃，转移速率14.5℃/分钟
MS条件是下述这些
离子化模式电子冲击
电压设置
灯丝电流149μA
电子倍增器200V
电子能量70eV
正离子模式
扫描条件
扫描范围33-500amu
扫描时间0.6秒
在抗生素107891的因子A1的水解产物中，HPLC/MS和GC/MS色谱展示了下述氨基酸与其它未鉴定的峰的共同存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸(NMR研究表明，这是天冬酰胺的转化产物，天冬酰胺通过水解产生天冬氨酸)、苯丙氨酸和亮氨酸。
在因子A2上进行的上述程序揭示了下述氨基酸与其它未鉴定的峰的共同存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸(NMR研究表明，这是天冬酰胺的转化产物，天冬酰胺通过水解产生天冬氨酸)、苯丙氨酸和亮氨酸。
B)对抗生素107891复合体中以及其因子A1和因子A2中的5-氯色氨酸加以测定
按照Simpson RJ，Neuberger MR，Liu TY，″Complete Aminoacid Analysisof Proteins from a Single Hydrolysate″.Journal Biol.Chem(United States)，April 10，1976，251(7)，1936-40所述的方法，对经纯化的107891复合体及其单因子A1和A2进行完全水解。
该水解程序预防了在矿物质酸消化期间通常不稳定的氨基酸的降解，因此允许对来自肽的水解产物的这些氨基酸(包括色氨酸)加以测定。5-氯-DL-色氨酸的标准样品购自Biosynt AG，Staad，Switzerland，通过NMR分析验证其结构；DL-色氨酸购自Merck KGaA，Darmstadt，Germany。
将因子A1(1.5 mg)悬浮于0.6ml 4N甲磺酸(含有0.2％(w/v)3-(2-氨基乙基)吲哚作为用于水解的催化剂)中。水解在115℃进行16小时。然后用5N NaOH中和水解产物，用等量蒸馏水稀释。通过LC-MS对100μl该溶液进行分析。分离在装备有Symmetry C18(5μm)3.9×20mm前柱(precolumn)的Symmetry C18(5μm)4.6×250mm柱(Waters Co.Milford MA，USA)上进行。洗脱以1ml/分钟流速进行25分钟，其中使用0％至50％相B的线性梯度。相A是25mM HCOONH4缓冲液(pH4.5)∶CH3CN 95∶5(v/v)，相B是CH3CN。UV探测在280nm进行。HPLC设备偶联有Finnigan LCQ离子肼质谱仪(Thermoquest，FinniganMAT，San Jose，CA，USA)。将来自柱的洗脱液以50μl/分钟转入LCQ质谱仪的电喷雾离子化(ESI)界面。MS分析在下述条件下进行样品进口剪切气(N2)，60psi；毛细加热器，210℃；样品进口电压极性正负均有；离子喷雾电压，+/-4.5KV；毛细电压，+/-21V；扫描条件最大离子时间50ms；完全微扫描3。
色氨酸和5-氯色氨酸的标准物在8.1分钟和11.5分钟的驻留时间被洗脱下来，这分别对应于m/z 205和239处的M+H+。在抗生素107891因子A1的水解产物中，11.5分钟(238.97处的m/z)的峰表明了5-氯色氨酸的存在。
具有0.3μg/ml探测极限的色谱系统可用来探测标准色氨酸。该值低于能指示出测试抗生素样品中所述氨基酸存在的值。在上述极限内，在抗生素107891因子A1的水解产物色谱图中没有探测到色氨酸。从对因子A2的水解产物和对抗生素107891复合体的经纯化样品的水解产物进行的LC-MS分析获得了相同的结果。
对抗生素107891因子A1和因子A2的质谱
抗生素107891因子A1在m/z＝1124时显示出了双重质子化离子，因子A2在m/z 1116处显示出，这对应于使用Theremofinigan校正混合物，在配有电喷雾源的Thermofinnigan LCQ deca设备上进行的MS实验中的最低同位素组成。电喷雾条件是喷雾电压4.7kV；毛细温度250℃；毛细电压8V；灌注模式，10μl/分钟。从乙腈∶水50∶50(v/v)的0.1mg/ml溶液(具有0.5％乙酸)记录谱，其被示于图6A(完全扫描低分辨率谱)和图6B(放大扫描高分辨率谱)以及图7A(完全扫描低分辨率谱)和图7B(放大扫描高分辨率谱)中。
通过使用配有电喷雾源的Bruker Daltonics APEX II，4.7 Tesla质谱仪，已测定了抗生素因子A1和因子A2的精确质量。基于这些数据，因子A1被赋予了2246.71±0.06的分子量，这是从m/z 1124.36124(精确度30ppm)的[M+2H]2+计算得到的单同位素质量，这通过高分辨率ESI-FTMS来测定。因子A1被赋予了2230.71±0.06的分子量，这是从m/z1116.36260(精确度30ppm)的[M+2H]2+计算得到的单同位素质量，这通过高分辨率ESI-FTMS来测定。
对抗生素107891因子A1及A2与抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1的比较
A)从NNRL collection获得US6,551,591B1描述的Microbisporacoralline NNRL 30420(MF-BA-1768)。在该探索实验中，在US6,551,591B1描述的条件下，在Erlenmeyer瓶中，发酵M coralline NNRL30420(MF-BA-1768)菌株。通过用甲醇稀释来对收获的培养液加以提取。离心菌丝体之后，将上清液上样至HP20聚苯乙烯吸收树脂，用甲醇∶水70∶30混合物加以洗脱，其被减少为小体积，然后冻干。
在色谱图中，两个峰显示出了1091和1108[M+2H]2+信号，这对应于6,551,591B1中针对MF-BA-1768β1和MF-BA-1768α1分别报道的[M+2H]2+。
然后向上述提取物加入抗生素107891因子A1和A2，通过LC-MS分析该混合物。我们发现抗生素MF-BA-1768β1和MF-BA-1768α1的峰以及抗生素107891因子A1和A2的峰具有不同的驻留时间以及不同的[M+2H]2+MS片段。
B)在进一步的实验中，进行对Microbispora sp.菌株NRRL 20420(MF-BA-1768)的30l罐式发酵，按照US6,551,591B1的描述来对收获的培养液进行加工。在HP20聚苯乙烯树脂和聚酰胺CC60.1-0.3mm(Macherey-Nagel)树脂上顺序进行纯化步骤之后，通过制备性HPLC获得以纯的形式存在的两种单独的物质，所述HPLC在μ10颗粒尺寸C18Phenomenex(Torrance CA，USA)Luna(250×12.2mm)柱上进行，以流速27ml/分钟洗脱，使用下述多步骤程序时间＝0(32％的相B)；时间＝8分钟(32％的相B)；时间＝20分钟(36％的相B)；时间＝32分钟(90％的相B)。相A是水中的0.05％甲酸(v/v)，相B是CH3CN。
这些物质展示出针对葡萄球菌和肠球菌的抗细菌活性，如表IV所示。在LC-MS实验中，两种物质展示出[M+2H]2+双重质子化离子信号，所述信号对应于US专利6,551,591所述的抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1。
表IV
抗微生物试验的实验条件与用于下表VI中报道的试验的条件相同。
对经分离的抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1的LC-MS分析在装备有Symmetry C18(5m)3.9×20mm前柱的Symmetry C18(5m)4.6×250mm柱(Waters；Milford MA，USA)上进行(都保持在温度为50℃的烘箱中)。洗脱以1ml/分钟的流速进行，其采用下述多步骤洗脱程序时间＝0(30％的相B)；时间＝8分钟(30％的相B)；时间＝20分钟(45％的相B)；时间＝24分钟(90％相B)；以及时间＝28分钟(90％相B)。相A是25mM HCOONH4缓冲液(pH4.5)∶CH3CN 95∶5(v/v)，相B是CH3CN。HPLC设备偶联有Finnigan LCQ离子肼质谱仪(Thermoquest，Finnigan MAT，San Jose，CA，USA)。将来自柱的洗脱液以100μl/分钟转入LCQ质谱仪的ESI接口。MS分析在下述条件下进行样品进口sheat气流(N2)，25psi；aux气流，5psi；毛细加热器，210℃；样品进口电压极性正负均有；离子喷雾电压，+/-4.75KV；毛细电压，+/-12V；扫描条件最大离子时间50ms；完全微扫描3。
各抗生素因子MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1以及抗生素107891因子A1和A2单独以及在混合物中被分析。结果概括于下表V中。
表V
在同样的色谱系统中，雷莫拉宁(ramoplanin)因子A2(L.Gastaldo，R.Ciabatti，F.Assi，E.Restelli，J.K.Kettenring，L.F.Zerilli，G.Romano，M.Denaro and B.Cavalleri，(1992)″Isolation，structure determination andbiological activity of A-16686 Factors A′1，A′2 and A′3 glycolipodepsipeptideantibiotics″，J.Ind.Microbiol.1113-18)以11.00分钟的驻留时间被洗脱。
抗生素107891因子A1和A2的NMR谱
在Bruker AMX 600核磁谱仪上，应用水抑制序列(water suppressionsequence)，于298K，在CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中记录抗生素107891因子A1和因子A2的1H-NMR谱。乙腈-d3在1.94ppm的残余信号作为内标考虑。
A)抗生素107891因子A1的1H-NMR谱示于图8中。
溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A1的1H-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(归结于)]0.84d(CH3)，0.89d(CH3)，0.94t(重叠的CH3)，1.1d(CH3)，1.13d(CH3)，1.15t(重叠的CH3)，149m(CH2)，1.69d(CH3)，1.75m(CH2)，2.11m(CH)，2.26m(CH)，2.5m(CH2)，2.68-3.8m(肽性CHβ)，3.8-5.0m(肽性CHα)，5.45-6.17s(CH2)，5.58d(CH双键)，6.36m(CH)，6.86d(CH双键)，7.0-7.45m(芳香族CH)。二甲基亚砜信号以2.58ppm存在，甲酸酯信号还以8.33ppm存在，作为杂质。
B)抗生素107891因子A2的去偶合1H-NMR谱bb示于图9中。
溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A2的1H-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(归结于)]0.84d(CH3)，0.88d(CH3)，0.94d(CH3)，1.06d(CH3)，1.14d(CH3)，148m(CH2)，1.65-1.75m(CH2)，1.67d(CH3)，2.15m(CH)，2.25m(CH)，2.5m(CH2)，2.77-3.8m(肽性CHβ)，3.8-4.9m(肽性CHα)，5.45-6.14s(CH2)，5.59d(CH双键)，6.34m(CH)，6.84d(CH双键)，7.0-7.42m(芳香族CH)。二甲基亚砜信号以2.58ppm存在，甲酸酯信号还以8.32ppm存在，作为杂质。
在Bruker AMX 600核磁谱仪上，于298K，在CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中记录抗生素107891因子A1和因子A2的13C-NMR谱，乙腈-d3在1.39ppm的残余信号用作为内标。
C)抗生素107891因子A1的13C-NMR谱示于图10中。溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A1的13C-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.39ppm)，[δ＝ppm，(归结于)]13.6-23.03(脂肪族CH3)，25.69-77.9(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和双键CH和季碳)，165.6-176.6(肽性羰基)。
D)抗生素107891因子A2的13C-NMR谱示于图11中。溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A1的13C-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.39ppm)，[δ＝ppm，(归结于)]13.6-22.9(脂肪族CH3)，25.65-73(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和双键CH和季碳)，165.7-176.1(肽性羰基)。
抗生素107891因子A1和A2的UV和I.R谱
A)用Bruker FT-IR光谱仪(型号IFS 48)在KBr中记录的抗生素107891因子A1的红外谱展示出在3294、3059、2926、1661、1529、1433、1407、1287、1114、1021处(cm-1)的吸收最大值。红外谱示于图12中。
B)在甲醇∶H2O 80∶20(v/v)中，使用Perkin-Elmer光谱仪Lambda16获得的抗生素107891因子A1的UV谱展示出在226和267nm处的两处肩峰。UV谱示于图13中。
C)用Bruker FT-IR光谱仪(型号IFS 48)在KBr中记录的抗生素107891因子A2的红外谱展示出在3296、3060、2928、1661、1529、1433、1407、1288、1116处(cm-1)的吸收最大值。红外谱示于图14中。
D)在甲醇∶H2O 80∶20(v/v)中，使用Perkin-Elmer光谱仪Lambda16获得的抗生素107891因子A2的UV谱展示出在226和267nm处的两处肩峰。UV谱示于图15中。
基于上述物理化学数据，认为抗生素107891具有下述结构式
其中，X是卤素(F、Cl、Br、I)，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8可以独立地是H、OH、烷基(带支链的或不带支链的、被取代的或未被取代的)或芳基(被取代的或未被取代的)。
在一种替代性实施方式中，R1、R2、R3和R4可以是H或OH。因此，R1、R2、R3和R4的可能组合包括下述这些
类似地，R5、R6、R7和R8可以是H或OH。因此，R5、R6、R7和R8的可能组合包括下述这些
此外，基于上述物理化学数据，可将下述结构式指派给抗生素107891的因子A1，其中，X是Cl，R1是H，R2是OH，R3是H，R4、R5、R6、R7和R8是H，这和其可药用盐一起都是本发明的优选实施方式
此外，基于上述物理化学数据，可将下述结构式指派给抗生素107891的因子A2，其中，X是Cl，R1是OH，R2是OH，R3是H，R4、R5、R6、R7和R8是H，这和其可药用盐一起都是本发明的优选实施方式
抗生素107891的体外生物活件
通过按照National Committee for Clinical Laboratory Standardsrecommendations(NCCLS，document M7-A5)所述的培养基微稀释(microdilution)方法，测定抗生素107891的抗微生物活性。
所用的菌株是来自American Type Culture Collection(ATCC)的菌株或临床分离株。试验结果示于表VI和表VII中。
将抗生素107891溶解于DMSO中，以获得1000μg/ml贮液，随后在水中稀释以获得工作溶液。所用的培养基是对Staphylococci、M.catarrhalis、Enterococci和L.monocytogenes而言，阳离子受调节的Mueller Hinton培养基(CAMHB)；对于Streptococci而言，Todd Hewitt培养基(THB)；对于Neisseria spp.而言，GC培养基+1％Isovitalex+1％haemine；对于H.influenzae而言，Brain Hearth Infusion+1％C补充剂；对于Lactobacilli而言，Lactobacillus培养基；对于M.smegmatis而言，富含Middlebrook OADC的Middlebrook 7H9；对于C.albicans而言RPMI 1640培养基；对于Clostridia而言，Wilkins Chalgren培养基+去氧酶(oxyrase)(1∶25v/v)；对于Propionibacteria而言，含有半胱氨酸(cisteine)(0.5g/L)的Brucella培养基。细菌接种体为105 CFU/ml。C.albicans接种体为1×104 CFU/ml。所有试验都在存在0.02％牛血清清蛋白(BSA)的情况下进行。培养物在35℃空气下温育，除了Clostridia和Propioniobacteria菌株之外，它们需要厌氧气氛。18-24小时后，进行目测读数，测定MIC。MIC被定义为没有可见生长时抗生素的较低浓度。
表VI抗生素107891的抗微生物活性
表VII抗生素107891针对厌氧细菌的抗微生物活性
抗生素107891展示出了针对革兰氏阳性细菌的良好抗细菌活性。
针对Staphylococcus spp.(包括甲苯氧青霉素抗性(MSRA)和糖肽中间产物(GISA)抗性菌株)的MIC范围为0.13-4μg/ml，针对Enterococcus spp.(包括万古霉素抗性(VRE))的近来临床分离株的MIC范围为0.5-4μg/ml。针对Streptococcus spp.的MIC为≤0.13μg/ml。
抗生素107891对厌氧革兰氏阳性菌株也有活性。针对Clostridia的MIC为≤0.13μg/ml；针对Propionibactreia为≤0.004-4μg/ml。针对L.monocytogenes(MIC 0.125μg/ml)和Lactobacilli菌株(MIC范围≤0.13-4μg/ml)也显示了抗微生物活性。一些革兰氏阴性细菌对抗生素107891易感；MIC为对M.catharralis而言，1-0.25μg/ml，对Meisseria spp.而言，0.5-0.25μg/ml，对H.influenzae而言，32μg/ml。
抗生素107891对于测试的E.coli和C.albicans菌株没有活性。
在时间-杀死(time-kill)实验中，抗生素107891展示出针对S.aureusGISA和E.faecalis VanA菌株的杀细菌活性；在24小时，Mueller Hinton培养基中杀细菌浓度为MIC值。
S.aureus可导致对生命有威胁的感染，MRSA临床上特别重要，因为其对所有青霉素和头孢菌素以及多种其它抗生素都有抗性；此外，其容易以患者-患者形式传播，导致感染爆发，这与保健机构重点相关(W.Witte，(1999)″Antibiotic resistance in Gram-positive bacteriaepidemiologicalaspects″，Journal of Antimicrobial Chemotherapy 441-9)。The Centers forDisease Control(CDC)National Nosocomial Infection Surveillance System(NNIS)报道，美国医院中S.aureus的甲苯氧青霉素抗性从1975年的2.4％增加直1991年的29％，在加强护理单元中具有更高程度的抗性(L.Archibald，L.Philips，D.Monnet，J.E.Jr Mc Gowan，F.Tenover，R.Gaynes，(1997)″Antimicrobial resistance in isolates from inpatients and outpatients inthe United Statesincreasing importance of the intensive care unit″，Clinic Infect.Dis.24211-5)。医院葡萄球菌感染与相当大的发病率和致死率相关，这延长了住院持续期，并增加了住院成本。MSRA菌株中的大多数对于最常使用的抗微生物剂(包括目前使用的大环内酯类，氨基糖苷类以及β-内酰胺抗生素，包括最新一代的头孢菌素)中的很多都有抗性。
具有万古霉素抗性的、在医院获得的、导致感染(例如心内膜炎、脑膜炎和败血症)的病原体日益成为治疗的挑战(Y.Cetinkaya，P.FaIk and C.G.Mayhall，(2000)″Vancomycin-resistant enterococci″，Clin.Microbiol.Rev.13686-707；L.B.Rice，(2001)″Emergence of vancomycin-resistantenterococci″，.Emerg.Infec.Dis.7183-7)。
S.pneumoniae和M catarrhalis被认为是重要的人类病原体。它们是呼吸道感染(特别是儿童中耳炎和老年人的下呼吸道感染)的常见诱因。S.pneumoniae和M.catarrhalis近来已被认为是呼吸道的最常见病原体((M.C.Enright and H.McKenzy，(1997)″Moraxella(Branhamella)catarrhalis.Clinical and molecular aspect of a rediscovered pathogen″，J.Med.Microbiol.46360-71)。
Clostridia能导致多种疾病气性坏疽和相关的外伤性感染、破伤风、肉毒杆菌中毒(botulism)、抗生素相关的腹泻(CDAD)和伪膜性结肠炎(pseumembranous colitis)。这些微生物中的大多数产生外毒素，外毒素在疾病发病机理中有着重要作用。C.difficile是致病剂，其导致25％的CDAD以及几乎所有的伪膜性结肠炎。过去数年来，在具有万古霉素抗性肠球菌感染或定位(colonization)的患者中已出现了C.difficile共感染(J.G.Bartlett，(1992)″Antibiotic associated diarrhea″，Clinic.Infect.Dis.15573-581)。
抗生素107891因子A1和A2的体外生物学活性
表VIII报道了抗生素107891的各因子A1和A2的抗微生物活性。通过上文所述的微培养液稀释方法来测定MIC。
表VIII抗生素107891因子A1和A2的抗微生物活性
抗生素107891的体内生物学活性
重量为23-25g的雌性ICR小鼠(Harlan Italia SpA-S.Pietro alNatisone，Italy)被用于在有免疫活性或中性粒细胞缺乏的小鼠中进行的急性致死性感染实验。中性粒细胞缺乏是通过在小鼠感染之前四天及一天分别腹腔施予200和100mg/kg环磷酰胺来诱导的。
在有免疫活性的小鼠中，通过腹膜内接种甲氧苯青霉素抗性葡萄球菌的临床分离株(Staph.aureus SA3817)或标准甲氧苯青霉素易感菌株(Staph.aureus Smith ATCC 19636)的细菌悬浮液来诱导感染，或者在中性粒细胞缺乏的小鼠中通过接种糖肽抗性肠球菌的临床分离株(Ent.faecalis A533)来诱导感染。提供悬浮于0.5mL 5％细菌粘蛋白(Difco)中的细菌攻击(challenge)(大约106个细胞/小鼠)。未受处理的动物在感染后24-72小时内死亡。攻击之后10-15分钟内开始进行抗生素处理。抗生素107891以不同水性配方一次性静脉(iv)或皮下(sc)施予。通过Spearman-Krber方法(D.J.Finney，(1952)″The Spearman-Krber method″，inStatistical methods in biological assay，pp.524-530，Charles Griffin&Co.，Ltd.，London)，从第7天存活的动物百分比来计算50％有效剂量(ED50)和95％置信极限。结果示于下表IX中。
抗生素107891在高达200mg/kg的最大测试剂量时仍无毒性。
表IX抗生素107891在小鼠急性致死性感染中的ED50。
配方
A10％(v/v)DMSO、10％(w/v)β羟丙基环糊精(Sigma)、H2O中80％(v/v)的5％(w/v)葡萄糖
B10％(v/v)DMSO、0.1M水性CH3COOH中40％(v/v)的PEG400
CH2O中50％(v/v)的PEG 400
菌株
I.MSSAStaph.aureus Smith 819 ATCC 19636
II.MRSAStaph.aureus 3817，临床分离株
III.VanAEnt.faecalis A533，临床分离株，在中性粒细胞缺乏小鼠中
图1A(完全扫描低分辨率谱)和1B(放大扫描高分辨率谱)代表抗生素107891的质谱，其展示出m/z 1124和m/z 1116处的双重质子化离子。
图2代表分散于KBr中的抗生素107891的I.R.吸收谱。
图3代表甲醇H2O中溶解的抗生素107891的UV谱。
图4代表40℃在Bruker AMX 600核磁谱仪上(应用水抑制序列时)甲醇-d4∶H2O(pH4.3 HCl)40∶10(v/v)混合物中记录的1H-NMR谱。
图5代表40℃在Bruker AMX 600核磁谱仪上甲醇-d4∶H2O(pH4.3HCl)40∶10(v/v)混合物中记录的13C-NMR谱。
图6A(完全扫描低分辨率谱)和6B(放大扫描高分辨率谱)代表抗生素107891因子A1的质谱，其展示出m/z 1124处的双重质子化离子[M+2H]2+。
图7A(完全扫描低分辨率谱)和7B(放大扫描高分辨率谱)代表抗生素107891因子A2的质谱，其展示出m/z 1116处的双重质子化离子[M+2H]2+。
图8代表298K在Bruker AMX 600核磁谱仪上(应用水抑制序列时)CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中记录的抗生素107891因子A1的1H-NMR谱。
图9代表298K在Bruker AMX 600核磁谱仪上(应用水抑制序列时)CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中记录的抗生素107891因子A2的1H-NMR谱。
图10代表298K在Bruker AMX 600核磁谱仪上CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中记录的抗生素107891因子A1的13C-NMR谱。
图11代表298K在Bruker AMX 600核磁谱仪上CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中记录的抗生素107891因子A2的13C-NMR谱。
图12代表分散于KBr中的抗生素107891的因子A1的I.R.吸收谱。
图13代表甲醇H2O中溶解的抗生素107891的因子A1的UV谱。
图14代表分散于KBr中的抗生素107891的因子A2的I.R.吸收谱。
图15代表甲醇H2O中溶解的抗生素107891的因子A2的UV谱。
实施例
实施例1 Microbispora sp.ATCC PTA-5024的发酵方法
28℃时将Microbispora sp.ATCC PTA-5024菌株保持于燕麦琼脂斜面上，保持2-3周。用5ml灭菌水刮下一个斜面上的微生物内容，将其接种进500ml Erlenmeyer瓶，其中含有100ml种子培养基(AF/MS)，该培养基组成为(g/l)右旋糖，20；酵母提取物，2；大豆粗粉，8；NaCl，1和碳酸钙，4。在蒸馏水中制备培养基，在121℃灭菌20分钟之前将pH调节为7.3。在以200rpm运转的旋转式摇床上，于28℃培养经接种的瓶。4-6天后，取该培养物的5％，接种进含有同样的发酵培养基的第二系列的瓶。72小时温育之后将200ml转移进含有3l同样的营养培养基的4l生物反应器中。
发酵在30℃、700rpm搅拌和0.5vvm通气下进行。72小时后，将培养物(1.5l)转移进含有15l相同的营养培养基的20l生物反应器中。发酵在30℃、500rpm搅拌和0.5vvm通气下进行48小时，然后转移至生产罐。在含有200l生产培养基M8的300l发酵罐中进行对抗生素107891的生产，所述培养基M8组成为淀粉，20；葡萄糖，10；酵母提取物，2；水解的酪蛋白，4；肉类提取物，2和碳酸钙，3。在去离子水中制备培养基，在121℃灭菌25分钟之前将pH调节为7.2。冷却后，用大约14l(7％)预培养物对发酵罐接种。在29℃、180rpm搅拌和0.5vvm通气下运行发酵罐，顶部压力为0.36bar。在发酵96小时后对发酵罐进行收获。
用同样体积的甲醇提取所有培养液之后，通过前文所述的HPLC来监测抗生素107891的生产。提取在室温搅拌下进行1小时。
实施例2Microbispora sp.ATCC PTA-5024替代性发酵方法
将Microbispora sp.ATCC PTA-5024接种进含有100ml生长培养基(G1)的500ml Erlenmeyer瓶中，该培养基组成为(g/l)葡萄糖，10；麦芽糖，10；大豆油，10；大豆粗粉，8；酵母提取物，2和碳酸钙，4。在去离子水中制备培养基，在120℃灭菌20分钟，无需pH调节。在28℃对经接种的瓶温育120-168小时，这在200rpm搅拌下进行，直到观察到良好的生长。然后用该瓶接种(3％)4l生物反应器，其中含有3l种子培养基AF/MS，该培养基组成如实施例1所述。30℃、700rpm搅拌以及0.5vvm通气下进行120小时的发酵后，取1.5l培养物转移进20l生物反应器，其中含有15l同样的营养培养基。发酵在30℃、600rpm搅拌和0.5vvm通气下进行96小时，然后转移进生产罐。
在含有200l生产培养基(V6)的300l发酵罐中获得对抗生素的生产，该培养基V6组成为(g/l)右旋糖，20；酵母提取物，5；肉类提取物，5；经水解酪蛋白，3；蛋白胨，5以及NaCl，1.5。在用NaOH调节至pH7.5的去离子水中制备培养基，在121℃灭菌20分钟。
用14l种子培养物(7％)接种发酵罐，发酵在29℃，180rpm搅拌及用每分钟100l标准空气(0.5vvm)通气下进行。通过按照前文所述的HPLC来监测抗生素107891的生产。大约160小时对发酵进行收获。
实施例3回收抗生素107891
通过正切过滤(tangential filtration)系统(0.1μm孔径的膜，KochCarbo-Cor，Koch Wilmington，USA)，对实施例1中所述的发酵培养液加以过滤，以获得170l上清液和30l经浓缩的菌丝体。在滤液(A)和菌丝体(B)中都发现了抗生素107891复合体。
(A)在室温下，存在Diaion HP-20聚苯乙烯树脂(4l)的情况下，对经过滤的培养液加以搅拌。然后回收树脂，用10l甲醇∶水4∶6(v/v)加以洗涤，分批进行洗脱，最开始用10l甲醇∶水9∶1(v/v)，然后用10l甲醇∶丁醇∶水(9∶1∶1)(v/v)来进行洗脱。在旋转式蒸发仪上将含有抗生素107891的合并洗脱级分浓缩至小体积，然后冷冻干燥，产生32g粗材料。将该粗材料溶解于正丁醇(1升)中，然后用800ml水顺序提取三次。在减压下浓缩有机相至油状残余物，其溶解于甲醇中。加入石油醚后，通过沉淀获得5g粗制抗生素制剂。
(B)加入25l甲醇后，对含有菌丝体的保留物部分进行1小时搅拌，过滤以获得45l菌丝体提取物。然后用水(20l)对该溶液加以稀释，在室温下用Diaion HP-20聚苯乙烯树脂(1l)搅拌一夜。然后回收树脂，用2l甲醇∶水40∶60(v/v)进行洗涤，用3l甲醇∶水85∶15(v/v)以及接着用2l甲醇∶水90∶10(v/v)顺序分批洗脱。通过对Staphylococcus aureus进行的琼脂分散试验，以及通过前文所述的分析用HPLC方法，针对抗生素107891对洗脱级分加以监测。
合并含有抗生素107891的洗脱级分，在减压下浓缩，冷冻干燥，产生8.1克粗制抗生素107891。
实施例4对抗生素107891的替代回收方法
将从实施例2所述的200l发酵罐中收获的培养液调节为pH6.8，通过正切过滤(0.1μ孔径的膜，Koch Carbo-Cor)对培养液加以过滤。在室温下，用2l Diaion HP20树脂(Mitsubishi Chemical)对渗透物(180l)进行过夜分批搅拌，然后收集树脂。
向含有浓缩菌丝体的正切过滤设备中的保留物部分(大约20l)加入甲醇(25l)。对该悬浮液进行1小时搅拌，然后用微过滤系统过滤至残余保留物体积为大约20l。然后加入额外的甲醇(25l)，顺序重复上述过程，总共5个循环。用160l去矿物质水稀释合并的甲醇提取物(大约125l)，在室温下用3l Diaion HP20树脂分批搅拌过夜。然后收集树脂，与按照前述过程用于提取培养液渗透物的Diaion HP20树脂合并。用20l水∶甲醇6∶4(v/v)在色谱柱中洗合并的树脂。用23l甲醇∶50mM甲酸铵缓冲液(pH3.5)∶正丁醇9∶1∶1(v/v)对抗生素107891加以洗脱。然后在真空下浓缩该洗脱液至终体积为3l。然后将经浓缩的溶液于pH4.5上样至2.5l聚酰胺CC 60.1-0.3mm(Macherey-Nagel)的柱，该柱用水∶甲醇7∶3(v/v)进行过调节。用水∶甲醇7∶3(v/v)洗该柱，然后用25mM甲酸铵缓冲液(pH3.5)∶甲醇7∶3(v/v)洗。用水∶甲醇3∶7(v/v)，然后1∶9(v/v)的混合物的对抗生素加以洗脱。用1∶9比例的25mM甲酸铵缓冲液(pH2.8)∶甲醇完成洗脱。合并含有抗生素107891的洗脱物，在真空下浓缩至终体积为1l。用7M氢氧化铵将经浓缩溶液的pH从4调节至5.7，然后离心混合物，以收集沉淀。将该固体悬浮于水中，冷冻干燥，产生6.96g抗生素107891制剂。
实施例5对抗生素107891的纯化
通过中等压力色谱，在100g反相C8(EC)40-70μm颗粒尺寸、60A孔径、IST(International Sorbent Technology，Mid-Glamorgan，UK)上，使用装备有B-687梯度形成器(gradient former)、B-684级分收集器、B-685玻璃柱70×460mm的Bùchi B-680 Medium Pressure ChromatographySystem(Bùchi laboratoriums-technik AG，Flawil Switzerland)，对按照实施例3制备的粗制抗生素107891(3.6g)加以纯化。用相A∶相B 8∶2(v/v)的混合物对树脂预先进行调节，然后以25ml/分钟，用60分钟线性梯度(60分钟内，从20％至60％的相B)对树脂进行洗脱。
相A是乙腈∶20mM甲酸铵缓冲液(pH6.6)10∶90(v/v)，相B是乙腈∶20mM甲酸铵缓冲液(pH6.6)90∶10(v/v)。
合并含有抗生素107891的级分，在真空下浓缩，冻干两次除水，产生430mg的经纯化抗生素107891。
实施例6通过制备性HPLC来纯化抗生素107891
通过在Hibar prepacked lichrosorb RP8(7m颗粒尺寸)柱RT 250-25mm，Merck上进行制备性HPLC来对抗生素107891进行进一步纯化，其中以30ml/分钟的流速，使用25分钟的线性梯度洗脱(从30％至45％的相B)。相A是25mM甲酸铵缓冲液(pH4.5)∶乙腈95∶5(v/v)，相B是乙腈。
将来自实施例5的抗生素107891样品(300mg)溶解于1.5ml 350∶1DMSO∶甲酸95∶5(v/v)中，每次色谱加工300μl。典型地，抗生素107891在15-16分钟被洗脱。5次色谱的洗脱级分(含有抗生素107891的)被收集起来，在真空下浓缩。对残余溶液顺序冻干三次除水，产生作为白色粉末的31mg抗生素107891。
实施例7对抗生素107891的各因子A1和A2进行分离和纯化
通过制备性HPLC，使用两种不同的洗脱程序，在Symmetry Prep C18(7μm颗粒尺寸)柱7.8×300mm Waters(Mildfold USA)上，从实施例5的抗生素107891复合体分离和纯化因子A1和A2。
A)以3.5ml流速，通过25分钟线性梯度洗脱(从30％至45％的相B)来纯化因子Al。相A是25mM甲酸铵缓冲液(pH4.5)∶乙腈95∶5(v/v)，相B是乙腈。将经纯化的抗生素107891复合体(15mg)溶解于350μl DMSO∶甲酸95∶5(v/v)中，每次色谱加工这么多的复合体。典型地，A1和A2因子在11-13分钟的时间段被洗脱出来。然后通过HPLC，在上文所述的分析条件下对洗脱级分加以分析。合并含有纯的抗生素107891因子A1的14次色谱的级分，在真空下浓缩。对得到的溶液顺序进行三次冻干除水，产生了15mg作为白色粉末的纯因子A1。
B)通过用100mM甲酸铵缓冲液(pH4)∶乙腈82.5∶17.5(v/v)以7ml流速进行等度洗脱来纯化因子A2。将经纯化的抗生素107891复合体(5mg)溶解于250μl乙酸∶乙腈∶100mM甲酸铵缓冲液(pH4)50∶120∶80(v/v)混合物中，每次色谱加工这么多复合体。典型地，A1和A2因子在9-10分钟的时间段被洗脱出来。通过HPLC，在上文所述的分析条件下对洗脱级分加以分析。合并含有纯的抗生素107891因子A2的20次色谱的级分，在真空下浓缩。对得到的溶液顺序进行两次冻干除水，产生了8mg作为白色粉末的纯因子A2。
权利要求
1.下式化合物
其中，X选自F、Cl、Br和I构成的组；以及
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地选自H、OH、烷基和芳基构成的组。
2.如权利要求1的化合物，其中，X是Cl，R2是OH，R1、R3、R4、R5、R6、R7和R8是H。
3.如权利要求1的化合物，其中，X是Cl，R1是OH，R2是OH，R3、R4、R5、R6、R7和R8是H。
4.如权利要求1的化合物，其中，R4、R5、R6、R7和R8是H。
5.如权利要求4的化合物，其中，R1是H，R2是H，R3是H。
6.如权利要求4的化合物，其中，R1是H，R2是H，R3是OH。
7.如权利要求4的化合物，其中，R1是H，R2是OH，R3是OH。
8.如权利要求4的化合物，其中，R1是OH，R2是OH，R3是OH。
9.如权利要求4的化合物，其中，R1是OH，R2是H，R3是H。
10.如权利要求4的化合物，其中，R1是OH，R2是H，R3是OH。
11.下式化合物
。
12.下式化合物
。
13.包含因子A1和因子A2的抗生素107891复合体，其是白色粉末，并且具有下述特征
A)在配有电喷雾源的Thermofinnigan LCQ deca设备上，使用Thermofinnigan校正混合物，在下述电喷雾条件下喷雾电压4.7kV；毛细温度220℃；毛细电压3V；灌注模式10μl/分钟，从具有0.1％三氟乙酸的甲醇∶水80/20(v/v)中的0.2mg/ml溶液记录的质谱在m/z＝1124和m/z 1116处显示出了两个双质子化离子，他们分别对应于复合体因子A1和A2的最低同位素组成；
B)用IFS 48型Bruker FT-IR光谱仪在KBr中记录的红外谱展示出在3263、2929、1661、1533、1402、1114、1026(cm-1)的吸收最大值；
C)在甲醇∶H2O 80∶20(v/v)中，使用Perkin-Elmer光谱仪Lambda16进行的UV谱展示出在226nm和267nm处的两处肩峰；
D)40℃时，在Bruker AMX 600核磁谱仪上，应用水抑制序列，使用3.31ppm的甲醇-d4残余信号作为内标，甲醇-d4∶H2O(pH4.3 HCl)40∶10(v/v)混合物中600MHz下纪录的1H-NMR谱展示出下述信号组，[δ＝ppm，多重性(归结于)]0.93d(CH3)，0.98d(CH3)，1.07t(重叠的CH3)，1.18t(重叠的CH3)，1.26s(CH3)，1.30t(重叠的CH3)，1.62-1.74m(CH2)，1.78d(CH3)，1.80d(CH3)，2.03m(CH2)，2.24m(CH)，2.36m(CH2)，2.72-3.8m(肽性αCH)，3.8-5.2m(肽性αCH)，5.53-6.08s(CH2)，5.62d(CH双键)，6.42m(CH)，6.92d(CH双键)，7.0-7.55m(芳香族的CH)，7.62-10.4d和m(芳香族的、肽性的NH)；
E)40℃时，在Bruker AMX 600核磁谱仪上，使用49.15ppm的甲醇-d4残余信号作为内标，甲醇-d4∶H2O(pH4.3 HCl)40∶10(v/v)混合物中纪录的13C-NMR谱展示出下述信号组，[δ＝ppm，(归结于)]13.6-23.2(脂肪族CH3)，26.16-73(脂肪族的CH2以及肽性αCH)，105-136(芳香族的以及双键CH和季碳)，164.3-176.3(肽性羰基)；
F)在用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯衍生化之后，6N HCl(105℃，24小时)中的酸水解产物显示出了下述氨基酸以及其它未鉴定的峰的存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸(天冬酰胺的水解产物)、苯丙氨酸和亮氨酸；
G)在含有0.2％(w/v)3-(2-氨乙基)吲哚作为催化剂的4N甲磺酸中的酸水解产物(115℃，16小时)显示出5-氯色氨酸的存在；以及
H)含有0.01N氢氯酸的摩尔过量的2-甲氧乙醇(MCS)∶H2O 12∶3(v/v)中，用0.01N氢氧化钾溶液进行酸/碱滴定，探测到碱性可离子化官能团。
14.抗生素107891的因子A1，其是白色粉末，并且具有下述特征
A)在配有电喷雾源的Thermofinnigan LCQ deca设备上，使用Thermofinnigan校正混合物，在下述电喷雾条件下喷雾电压4.7kV；毛细温度250℃；毛细电压8V；灌注模式10μl/分钟，从具有0.5％乙酸的乙腈∶水50∶50(v/v)的0.1mg/ml溶液记录的质谱在对应于最低同位素组成的m/z＝1124处显示出了双质子化离子；
B)使用配有电喷雾源的Bruker Daltonics APEX II，4.7 Tesla质谱仪测定的抗生素的精确质量对应于2246.71±0.06的分子量，这是从m/z1124.36124(精确度30ppm)的[M+2H]2+计算得到的单同位素质量；
C)当溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中时，1H-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(归结于)]0.84d(CH3)，0.89d(CH3)，0.94t(重叠的CH3)，1.1d(CH3)，1.13d(CH3)，1.15t(重叠的CH3)，149m(CH2)，1.69d(CH3)，1.75m(CH2)，2.11m(CH)，2.26m(CH)，2.5m(CH2)，2.68-3.8m(肽性CHβ)，3.8-5.0m(肽性CHα)，5.45-6.17s(CH2)，5.58d(CH双键)，6.36m(CH)，6.86d(CH双键)，7.0-7.45m(芳香族CH)；
D)当溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中时，13C-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.39ppm)，[δ＝ppm，(归结于)]13.6-23.03(脂肪族CH3)，25.69-77.9(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和双键CH和季碳)，165.6-176.6(肽性羰基)；
E)用IFS 48型Bruker FT-IR光谱仪在KBr中记录的红外谱展示出在3294、3059、2926、1661、1529、1433、1407、1287、1114、1021处(cm-1)的吸收最大值；
F)在甲醇∶H2O(80∶20的比例)中，使用Perkin-Elmer光谱仪Lambda 16进行的UV谱展示出在226nm和267nm处的两处肩峰；
G)在用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯衍生化之后，6N HCl(105℃，24小时)中的酸水解产物显示出了下述氨基酸以及其它未鉴定的峰的存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸(天冬酰胺的水解产物)、苯丙氨酸和亮氨酸；以及
H)在含有0.2％(w/v)3-(2-氨乙基)吲哚作为催化剂的4 N甲磺酸中的酸水解产物(115℃，16小时)显示出5-氯色氨酸的存在。
15.抗生素107891的因子A2，其是白色粉末，并且具有下述特征
A)在配有电喷雾源的Thermofinnigan LCQ deca设备上，使用Thermofinnigan校正混合物，在下述电喷雾条件下喷雾电压4.7kV；毛细温度250℃；毛细电压8V；灌注模式10μl/分钟，从具有0.5％乙酸的乙腈∶水50∶50(v/v)的0.1mg/ml溶液记录的质谱在对应于最低同位素组成的m/z＝1116处显示出了双质子化离子；
B)使用配有电喷雾源的Bruker Daltonics APEX II，4.7 Tesla质谱仪测定的抗生素的精确质量对应于2230.71±0.06的分子量，这是从m/z1116.36260(精确度30ppm)的[M+2H]2+计算得到的单同位素质量；
C)当溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中时，1H-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(归结于)]0.84d(CH3)，0.88d(CH3)，0.94d(CH3)，1.06d(CH3)，1.14d(CH3)，148m(CH2)，1.65-1.75m(CH2)，1.67d(CH3)，2.15m(CH)，2.25m(CH)，2.5m(CH2)，2.77-3.8m(肽性CHβ)，3.8-4.9m(肽性CHα)，5.45-6.14s(CH2)，5.59d(CH双键)，6.34m(CH)，6.84d(CH双键)，7.0-7.42m(芳香族CH)；
D)当溶解于CD3CN∶D2O(1∶1)中时，13C-NMR谱在600MHz展示出下述信号的组(以ppm表示)，其中用CD3CN作为内标(1.39ppm)，[δ＝ppm，(归结于)]13.6-22.9(脂肪族CH3)，25.65-73(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和双键CH和季碳)，165.7-176.1(肽性羰基)；
E)用IFS 48型Bruker FT-IR光谱仪在KBr中记录的红外谱展示出在3296、3060、2928、1661、1529、1433、1407、1288、1116处(cm-1)的吸收最大值；
F)在甲醇∶H2O(80∶20的比例)中，使用Perkin-Elmer光谱仪Lambda 16进行的UV谱展示出在226nm和267nm处的两处肩峰；
G)在用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯衍生化之后，6N HCl(105℃，24小时)中的酸水解产物显示出了下述氨基酸以及其它未鉴定的峰的存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸(天冬酰胺的水解产物)、苯丙氨酸和亮氨酸；以及
H)在含有0.2％(w/v)3-(2-氨乙基)吲哚作为催化剂的4N甲磺酸中的酸水解产物(115℃，16小时)显示出5-氯色氨酸的存在。
16.用于生产抗生素107891及其因子A1和A2及其与酸的盐的方法，所述方法包括如下步骤
在有氧条件下，在含有可吸收碳源、氮源和无机盐源的水性营养培养基中，培养Microbispora sp.ATCC PTA-5024或保留有生产所述抗生素的能力的其变体或突变体；
从菌丝体和/或经过滤的发酵培养液分离出所得到的抗生素；以及
纯化经分离的抗生素107891。
17.如权利要求16所述的方法，其中，对所述菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024或能生产所述抗生素的其变体或突变体进行预培养。
18.权利要求16所述的方法，其中，对所述抗生素107891的分离通过对所述发酵培养液进行过滤来进行，按照选自下述组的技术从经过滤的发酵培养液回收抗生素，所述组由用水不可混溶溶剂提取、通过加入非溶剂或通过改变溶液的pH进行的沉淀、吸收色谱、分配色谱、反相分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱等或两种或多种所述技术的组合构成。
19.权利要求16所述的方法，其中，对所述抗生素107891的分离通过将所述菌丝体与所述发酵培养液的上清液分离开来进行，用水可混溶溶剂对菌丝体加以提取，由此在去除没用的菌丝体之后，获得含有粗制抗生素的水可混溶溶液，可单独对其进行加工，或与经过滤的发酵培养液合并之后被加工，以便通过选自下述组的技术回收所述抗生素107891，所述组由用溶剂提取、通过加入非溶剂或通过改变溶液的pH进行的沉淀、吸收色谱、分配色谱、反相分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱等或两种或多种所述技术的组合构成。
20.权利要求19所述的方法，其中，在进行加工以便回收所述抗生素之前，降低所述菌丝体提取物中所述水可混溶溶剂的浓度。
21.权利要求18所述的方法，其中，将经过滤的发酵培养液与吸收树脂接触，用极性的、水可混溶溶剂或其与水的混合物对所述树脂加以洗脱，由此获得含有粗制抗生素107891的溶液。
22.权利要求21所述的方法，其中，所述吸收树脂选自聚苯乙烯、混合的聚苯乙烯-二乙烯基苯和聚酰胺树脂构成的组。
23.权利要求19所述的方法，其中，用C1-C3烷醇提取菌丝体，将菌丝体提取物与吸收树脂接触，用极性的、水可混溶溶剂或其与水的混合物对所述树脂加以洗脱，由此获得含有粗制抗生素107891的溶液。
24.权利要求18所述的方法，其中，含有所述粗制抗生素107891的溶液被合并，并被进一步加工，以用于对所述抗生素107891的进一步纯化。
25.权利要求21所述的方法，其中，对含有所述粗制抗生素107891的所述溶液进行浓缩，然后冷冻干燥，产生粗制抗生素107891固体产物。
26.权利要求21所述的方法，其中，含有被吸收的抗生素的所述吸收树脂被合并，用极性的、水可混溶的溶剂或其与水的混合物对合并的混合物加以洗脱。
27.权利要求16所述的方法，其中，通过色谱程序来纯化所述抗生素107891，优选地，通过制备性HPLC或中等压力色谱来进行。
28.权利要求16所述的方法，其中，通过制备性HPLC从经纯化的抗生素107891分离因子A1和因子A2。
29.包含抗生素的药物组合物，所述抗生素选自抗生素107891、抗生素107891因子A1、抗生素107891因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其与酸的可药用盐。
30.如权利要求28的药物组合物，还包含可药用载体。
31.用作为药剂的抗生素107891、其因子A1、其因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其与酸的可药用盐。
32.抗生素107891、其因子A1、其因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其与酸的可药用盐用于生产用于治疗或预防细菌感染的药剂的用途。
33.抗生素107891、其因子A1、其因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其与酸的可药用盐作为动物生长促进剂的用途。
34.菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的生物上纯的培养物，或当在存在可吸收碳源、氮源和无机盐源的深浸有氧条件下培养时保持有生产抗生素107891的能力的菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024变体或突变体的生物上纯的培养物。
全文摘要
本发明涉及微生物来源的抗生素物质，尤其是被命名的抗生素107891，其由Microbispora sp.ATCC PTA-5024发酵生产，本发明还涉及所述抗生素物质的可药用盐及其组合物，以及它们作为具有针对易感微生物的抑制活性的抗细菌剂的用途。抗生素107891是包含被命名为因子A1和A2的两个因子的复合体，其具有肽结构，所述结构含有羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸作为组成部分，这是羊毛硫抗生素组的抗生素的典型特征。抗生素107891及其因子A1和A2展示出针对革兰氏阳性细菌(包括甲氧苯青霉素抗性和万古霉素抗性菌株)的良好抗细菌活性，对一些革兰氏阴性细菌(例如M.catharralis，Neisseria的种和H.influenzae和Mycobacteria)也有活性。
文档编号A61K38/12GK101098707SQ200580046525
公开日2008年1月2日 申请日期2005年1月19日 优先权日2005年1月12日
发明者阿梅里加·拉扎里尼, 卢西亚诺·加斯塔尔多, 吉安帕罗·坎迪亚尼, 伊斯梅拉·奇奇利亚托, 达尼埃莱·洛西, 弗拉维亚·马里内利, 恩里科·塞尔瓦, 佛朗哥·帕伦蒂 申请人:维库罗恩医药品公司