一种杀灭癌细胞、抑制恶性肿瘤转移的药物的制作方法

专利名称：一种杀灭癌细胞、抑制恶性肿瘤转移的药物的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗恶性肿瘤的药物。
背景技术：
作为肿瘤这种疾病、目前已构成主要危害人类死亡的疾病之一。病因不明确。主要治疗手段仍是沿用多年的手术切除，放射疗法及化学疗法。传统的治疗方法根治率很低，只能短时间延续患者生命和缓解病痛。绝大多数病人因复发、转移而死亡。以往的中、西治疗恶性肿瘤的药物，目前还没有哪一种被公认是治疗恶性肿瘤的救命药物，而且药的价格非常昂贵。尤其是某些中药，较多采用了名贵、和一些毒性很大的中药药材，坚持服用这些药物的病人，为较短的生命延续时间，付出了巨大的经济代价，多数病人得到的是人财两空的结果。

发明内容
本发明的目的是提供一种能杀灭癌细胞，抑制恶性肿瘤转移的药物，提高恶性肿瘤药物治疗的治疗效果，使恶性肿瘤的药物治疗在现有技术的水平上取得较大的进步。
本发明的药物由以下重量份数比的原料组成磺酸化羧甲基甲壳质(SCM-ChitinIII)250-350、抗坏血酸盐(维生素C)150-250、硝酸铈30-50、硒酸钠5-15。
本发明的药物原料最佳重量份数比为磺酸化羧甲基甲壳质(SCM-ChitinIII)、300、抗坏血酸盐(维生素C)200、硝酸铈40、硒酸钠10。
本发明的药物以磺化羧甲基甲壳质(SCM-ChitinIII)为主要活性成分。是基于1.6-0-磺酸化甲壳质(S-Chitin)， 和6-0-磺酸化及羧甲基甲壳质(SCM-Chitin)，CH2OCH2COOH.SO3H CH2OCH2COOH.SO3H
具有明显地抑制瘤细胞的渗透，并且其渗透通过基质的能力与其磺酸化率有关系。(磺酸化率增高使瘤细胞渗透被抑制的能力增加)2.SCM-ChitinIII为高磺酸化率的羧甲基SCM-Chitin。
3.SCM-ChitinIII其抗凝活性很低使细胞迁移率低。(抗凝活性高可使细胞迁移率高。)4.SCM-ChitinIII能阻断瘤细胞向昆布宁包被的底物的攻击与移行。即意味着阻断浸润。
5.SCM-ChitinIII阻断瘤细胞的浸润与转移机理被认为是它与昆布宁分子特异结合的结果。
6.一定剂量的SCM-ChitinIII，能抑制肝素酶，即抑制了磺酸类肝素的降解。
7.SCM-ChitinIII能够抑制瘤细胞的IV型胶原的水解活性。
8.SCM-ChitinIII的作用1)无毒。2)抵抗凝性。3)抑制肝素酶。4)抑制瘤细胞对IV型胶原的水解作用。5)它与昆布宁结合而使瘤细胞浸润与转移作用减弱。
本发明以微量元素硒为辅助成份是基于微量元素硒是抗氧化剂，又是谷胱甘肽过氧化物酶的重要成分，可抑制过氧化反应，分解过氧化物，清除自由基及修复生物膜，保护易被氧化的物质。含硒化合物可降低化学致癌物质与DNA共价结合，硒能参与并促进体内多种抗氧化硒的合成，低水平硒会使酶的活性下降而导致癌的发生与发展，缓解氧化压力。硒化合物可调整和激活身体免疫功能，能从多方面预防癌症发生及间接抑制癌肿瘤的生长。
本发明以稀土元素铈为辅助成份，是基于在用稀土元素进行抵抗肿瘤细胞生长的免疫实验中，证明稀土元素(铈、镧等)有较强的络合作用，可对细胞DNA进行剪切，并对细胞内多种酶活性有提高或抑制作用。对恶性肿瘤细胞有很强的杀灭能力，能主动向癌细胞进攻，将癌细胞消灭在萌芽状态。小鼠口服铈后，自然杀伤细胞攻击癌细胞的能力提高了38％。机体一体免疫功能也大有改善。铈在调节癌基因和抑癌基因方面也证实有十分有益的作用。它能清除体内有害的自由基外，还可使癌细胞内的钙调素水平降低，抑癌基因水平上升。表明铈的抑癌作用可能是通过使癌细胞恶性程度下降来实现的，说明铈对肿瘤的防治有确切的作用。
维生素C是公认的抗氧化剂，能保护磺化羧甲基甲壳质(SCM-ChitinIII)不被氧化。并且与亚硒酸纳协同对肝癌细胞有逆转作用。
本发明的积极效果在于利用对恶性肿瘤转移有明显抑制作用SCM-ChitinIII和对恶性肿瘤细胞有很强的杀灭能力稀土元素铈及抗氧化剂硒和维生素C组成防治恶性肿瘤的药物，其中的各原料成分相互协同，在抑制恶性肿瘤细胞转移和杀灭肿瘤细胞具有突出的效果，有望使恶性肿瘤得到治愈，或大大地减少肿瘤病人的死亡。甚到可避免手术，放射与化疗来实现治愈肿瘤。
本发明的药物为口服药，首选剂型为胶囊，装入胶囊的磺酸化羧甲基甲壳质、抗坏血酸盐、硝酸铈、硒酸钠均为粒度60目的药粉。
本发明的药物服用量为日服2次，每次用量按纯药计550mg，即磺酸化羧甲基甲壳质300mg、抗坏血酸盐200mg、硝酸铈40mg、硒酸钠10mg。
本发明的药物也可以和现有的各种药用载体和/或赋形剂混合，制成其他口服剂型。
药效实验本实验采用体外、针对体内方法，研究已纯化并修饰的羧甲基甲壳质(SCM-Chitin)恶性肿瘤细胞株体外粘附性、浸润性、迁移性及肿瘤细胞外基质酶的降解等影响，同时制备体内动物模型，通过光镜观察和比较SCM-Chitin对肿瘤细胞形态、组织结构及转移等影响。
一、SCM-ChitinIII抑癌转移作用的体外研究(一)CM-Chitin对恶性肿瘤细胞株体外粘附性的检测用RPMI-1640(含15％小牛血清和双抗)将细胞制成密度为2×106/ml细胞悬液，加入12孔板，每孔加入1×106/0.2ml，同时加入不同浓度的SCM-Chitin(200ug/ml，300ug/ml，400ug/ml，500ug/ml)。
对照组不加SCM-Chitin。置CO2细胞培养箱常规培养30分、60分、90分、120分钟。取出后弃去未粘附细胞，胰酶消化，收集粘附细胞并计数，计算、比较两组粘附率。
(一)SCM-ChitinIII对ACC-M细胞浸润抑制检测1、滤膜准备选用孔径为80μm滤膜(Polyvinylpyrrolidone-freepolycarbonate)，其表面铺有Matrigel(100μg/ml)，下面铺有Fibronectin(100μg/ml)或鼠尾胶原。
2、Transwell小室，在下室加培养液，上室加密度为2×106/ml肿瘤细胞悬液和不同浓度的SCM-Chitin，对照不加SCM-Chitin。置于CO2细胞培养箱常规培养8h、10h、12h后，取出滤膜，甲醇固定，HE染色，除去滤膜上表面的细胞，在放大400倍的光镜下，计算、比较两组通过滤膜进入下表面的细胞数。
(二)SCM-ChitinIII对肿瘤细胞迁移性的影响将密度为2×106/ml肿瘤细胞悬液接种至预先在滤膜下表面铺有Fibronectin或鼠尾胶原的上室中。不同浓度的SCM-Chitin加入下室，对照不加SCM-Chitin。置于CO2细胞培养箱常规培养6h、8h、10h、12h后，固定，染色，计算、比较两组通过滤膜进入下表面的细胞数。
(三)SCM-ChitinIII对肿瘤细胞下基质酶的降解作用1、H标记从EHS肿瘤中提取并纯化的IV型胶原。
2、将标记的IV型胶原铺于24孔细胞培养板中。
3、加入不同浓度的SCM-Chitin，孵育3h，加入肿瘤细胞悬液，孵育24h、48h、72h后，提取上清夜，检测IV型胶原水解度。
二SCM-ChitinIII抑制ACC-M转移的体内研究将实验分为三组1、将ACC-M经裸小鼠尾静脉注射，造成肺转移灶。
2、在注射ACC-M之前，服用不同浓度SCM-ChitinIII 6、8、10周。
3、在肺转移灶形成后，服用不同浓度SCM-ChitinIII 6、8、10周通过光镜观察和比较不同浓度的SCM-ChitinIII对肿瘤细胞形态、组织结构及转移等影响。
三、磺酸化甲壳质衍生物抑制黑色素瘤的转移是通过细胞外基质和酶的降解的研究材料和方法B16-BL6黑色素瘤是一种高转移瘤株，获得它是通过肿瘤浸润期分离筛选而成，由Dr.J.J.Fidler肿瘤中心，TX提供。黑色素瘤细胞在MEM中单层培养保持存在，内含7.5％FBS中有维生素溶液，丙酮酸钠，非必须氨基酸和L-谷氨酸。
甲壳质来自于螃蟹壳，用常规方法在使用前将其碎至45～60目。CM-甲壳质的制备，羧甲基度在0.40，0.56，和0.80，在使用之前甲壳质衍生物用PBS溶解。
肝素钠盐(Lot TLP 3856；活性197.1units/mg)从Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd，Osaka，日本购之。
纯化的鼠的纤维连结蛋白从Seikagaku Kogyo Co，Ltd，东京日本购买。
纯化的鼠的昆布宁和基底膜胶质(含昆布宁、IV型胶原、磺酸化肝素蛋白糖和entactin)从Collaborative Reseerch，Inc获得。
Bedford，MA，所有的试剂和介质均有很低的内毒素(＜1.0mg/ml)，是由比色法来测试的。(Pyrodck；Seikagaku Kogyo Co.Ltd.东京日本)细胞黏附微量试验。通过资料所述的方法作出细胞浸润模型，B16-BL6黑色素细胞在MEM培养基中[内含5％FBS，加入0.3×μci/ml的[125I]碘脱氧尿嘧啶核苷(特异活性，200mci/mmol；新英格兰原子能，Boswn，MA)]培养24小时，以对数生长相的方式进行。然后，细胞用2倍体积的温的PBS洗，以除去未结合上的放射性校记物，再通过加入0.02％EDTA，温度37℃，1分钟后收集，在冷的没有血清存在下的MEM下再被悬浮，以形成细胞单个悬浮。在125I-碘脱氧尿嘧啶核苷-瘤细胞，(2×104)以0.05～1/洞加入，微量培养洞预先用昆布宁包被处理。培养在37℃，30分钟，然后用其4倍体积的PBS洗，除去未浸润的细胞。与基质结合上的瘤细胞用0.1N NaOH.0.1ml溶解之溶解物用棉花签吸之，再用r-计数器测之放射性，结合率(细胞结合数量/底物)用下列公式表示之 结合迁移实验。瘤细胞在细胞移动培养室内沿着与纤维连结蛋白或昆布宁结合的基质的梯度移动(Transwell Cell Culture Chembers即No.3422；Costar，Carmbrige，MA)参照或按McCarthy等人报导的方法，以及按改良的方法进行。不含有碳酸盐的吡咯吲嗓聚维尼龙滤器，其孔径是8.0μm的微孔(Nucltopore，Pleasanton，CA)。在培养滤器(膜)的下部预先用5μg的纤维连结蛋白或昆布宁，其体积是50μl来包被，然后室温下过夜干燥。包被上的滤器膜用PBS充分地洗涤，然后迅速干燥之。肿瘤细胞的对数方式培养后用含1mM的EDTA的PBS(洗涤)收集。再用3倍的不含MEM的血清洗涤，再用含0.1％的BSA的MEM悬浮至浓度为2×106/ml。将悬浮的细胞(100μl)分别加入(实验组)及不加入(对照组)实验用药到膜上室内，然后在5％CO2气供给下进行数小时孵育。然后滤膜用甲烷固定，用苏木精及伊红染色。在滤膜上池的细胞用棉签檫的方式移出。从膜上移至膜下(通过滤膜)进入下室各处的细胞在400倍显微镜下计数，试验的每一样品均为一式三份进行。
侵润试验。肿瘤侵润活性是由Albini等人报导的方法来进行的。也有些改良方法简言之，用纤维连结蛋白或昆布宁来包被滤膜下表面(下池)，方法同前述。用冷的PBS来稀释基质胶达100μg/ml，使滤膜(器)的上层表面含5μg/filter使其在室温下遮盖干燥。然后该滤膜分别地用基质胶/昆布宁或基质胶/纤维连结蛋白包上被膜，以后的程序与肝素转移的方法相同。浸润的细胞通过基质胶与滤膜到滤膜器的下层表面，然后被计数。
肝素结合实验。〔3H〕肝素(放射活性0.49mci/mg；Du pont-New England，核研究产物Boston.MA)与昆布宁和BSA结合的定量试验是通固相放免法，是在96孔组织培养板来完成的。昆布宁(3μg/60μl.每3L，)被加入，宝温干燥过夜。含有缓冲液的BSA(2mg/ml在6mM的磷酸，0.1MNaCl，68μM CaCl，pH6.8的溶液中。)加到再孔之中，然后37℃孵育2小时。除去缓冲液，将〔3H〕-肝素标记物(肝素标记物的放射活性为5×104dpm/0.05μ℃g)在50μl的体积，37℃孵育2h，其中有未标记的肝素与甲壳质衍生物存在与不存在两个组。用含有0.1％3-〔(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio〕-1-Propanesulfonate的缓冲液洗3次，以除去未标记上的肝素标记物。被标记上的标记物通过用200μl的0.5N NaOH〔内含硫酸十二酯)37℃孵育30′，然后液烁记数统计。
肝素酶的制备。肝素酶是从B16-BL6细胞中抽提出来的，使用肝素-琼脂糖(偶联体)和伴刀豆球蛋白A-琼脂糖(偶联体)层析来完成。首先，用B16-BL6黑色素细胞(2×108)，它来自于部分融合培养在DME∶F12为1∶1的混合基质，内含5％的胎牛血清。提取是在0.5％Triton X-100，内含1mM的苯甲磺酰氟，5mM N-ethylmaleimide，50mM Tris-HCl，pH7.5(缓冲液1)在4℃，30分钟条件下进行。提取物被离心，30000×g，30分钟。上清大约含有100mg的蛋白质作为层析样品。肝素-琼脂糖柱用缓冲液1来平衡，流速为30ml/h。平衡后再用200ml的缓冲液1,200ml的0.2％Triton×-100∶20mM醋酸钠pH6.0(即缓冲液2)，以及用300ml的0.5M的氯化钠20mM醋酸钠，pH6.0(即缓冲液3)，约用10小时洗之。结合上的肝素-蛋白质，用氯化钠及醋酸钠(20mM)pH6.0的梯度洗脱(0.15-1.2mol)，有活性的肝素酶被收集，然后对缓冲液3进行透析，然后再离心1s30000×g，30分钟。其上清夜上伴刀豆蛋白A-琼脂糖柱(柱床体积为50ml)，用缓冲液3来平衡。在用200ml缓冲液3洗柱4小时后，与半刀豆球蛋白结合的蛋白质用200ml，内含1.0Mα-methyl-D-mannopyranoside的缓冲液3来洗脱。洗脱物被收集后再被浓缩，用Amicon浓缩器，YM-10型号的膜来浓缩。部分纯化的肝素酶的特异活性是通过对3H-标记的HS降解产物的分析来测定的这可在肝素酶抑制试验中来讨论。在研究中，使用肝素酶中含有0.89mg/ml的蛋白质和降解60μg的HS(底物)/ml的蛋白质/h.在37℃。
肝素酶抑制试验。肝素酶抑制试验的理论根据文献提及的方法HS(M34000)是从小牛肺被纯化而来，其部分被N-脱磺酸基然后用〔3H〕-乙醋酐进行乙酰化。用3H-标记的HS(5μg)来孵育，条件37℃.3h.加26.7μg的部分纯化的肝素酶於50μl的0.2M醋酸钠的缓冲液之中，pH5.6。其中加入各不同浓度的修饰后的甲壳质，以及空白等各管。孵育终结后加热100℃.5′，煮沸后冷却之，再离心18000g.5′。〔3H〕HS的降解产物，取25μl的悬浮液用排组色谱层析进行分析，使用Waters600E高效液相系统(Waters Milford，MA)用一个生物胶TSK-30-XL柱(300×7.5mm；Bio-Rad，Richmond，CA)。洗柱用12.5mMTris-HCI0.15M NaCI，pH7.5，流率0.5ml/分钟，在23℃下进行。样品洗脱，塑管/30秒，7ml/塑管，每管加3ml的闪烁液(NaTionalDiagnostics，Manville，Nj)，每部分(管)放射活性使用LS2800液烁计数仪来测定(Beckman Irvine，CA)，(A).肝素酶的活性通过色谱〔3H〕HS℃峰整个半面积的减少来确定。
3H-标记的IV型胶原的制备。从EHS瘤株纯化IV型前胶原，其前胶原是在C57BL/6小鼠体内生长的(在Nakajima等人的文献中论述的)其乙酰化用〔3H〕标记的乙酰酐来酰化，然后IV型胶原溶液(3mg/ml)溶于0.2M的乙酸中，再用2M的醋酸钠调pH至8.0。再立即用1mci的〔3H〕乙酰酐(溶液50μl苯溶液)混合(100mci/mmol；ICN Radiochemicals，Lrvine CA)然后4℃孵育16h，〔3H〕标记的IV型胶原溶液在3ml 0.5M的醋酸之中再用4升的0.2M醋酸，4℃透析6h，如此反复4次，3H-标记的IV型胶原的放射活性应是2220dpm/μg。
IV型胶原水解试验。〔3H〕标记的IV型胶原(20μg/孔)被放置在48-3L组织培养板的每孔内(Costar，Cambriage MA)再吹干，过夜。将DMEF12介质(500μl)加入到干燥了的IV型胶原膜上，再于37℃孵育3h。然后，再用新鲜的DMEF12介质，内含各种硫酸化甲壳质衍生物(400μg/ml)更换之，同样37℃孵育3h。B16-BL6(5×104)细胞被悬浮在含有0.5％BSA(小牛血清)的DMEF12介质，然后在37℃下孵育，在humidifed孵育箱中(5％CO2∶95％空气)。孵育48小时后，培养的上清被吸出，再用100μl的内含50％三氯醋酸的水溶液来沉之，之后离心18000g，IV型胶原的水解活性是通过测定上清液的放射活性来计算。
统计学分析，对两组进行T检查进行统计学处理。
结果甲壳质衍生物对肿瘤细胞浸润的抑制。我们首先在体外进行了甲壳质衍生物和肝素对B16-BL6黑色素细胞生长的直接作用。瘤细胞用500μg/ml的甲壳质衍生物来孵育不能使〔3H〕胸腺嘧啶与瘤细胞掺入。重组体IFN-r(103单位)/ml在体外有明显的抑制细胞生长的作用。第二步我们进行了甲壳质衍生物和肝素对黑色素瘤细胞浸润作用的影响试验，这要使用基底膜基质再建的方式来完成。(表2)将瘤细胞加入到Transwell Cham bers的上室，在Transwell Cham bers的上室内设其甲壳质衍生物及肝素存在与空白等组。SCM-Chitin II和SCM-ChitinIII，指C6位上不同量的硫酸化和羧甲基基团的量，以及肝素均能抑制瘤细胞的浸润，是通过基底物质/纤维连结蛋白和基底物质/包被的混布宁的通透来证实的(或移动)。而CM-Chitin和N-脱乙酰甲壳质衍生物，SCM-壳聚糖就无此作用。
硫酸化甲壳质衍生物对肿瘤细胞器的影响。肿瘤细胞被粘附在细胞外基质和基底膜上，被认为是细胞浸润的早期阶段，这也是细胞转移的过程。我们第二步的试验，将证实硫酸化甲壳质衍生物对B16-BL6细胞在预先用混布宁包被的基底物质上的黏附的影响，其基底物质主要是基底膜物质125I-标记的B16-BL6细胞被加入到用昆布宁包被的Transwell，其试验设有含有硫酸化甲壳质衍生物及空白不含有的对照组。6-0-硫酸化甲壳质，以及肝素均具有明显地抑制肿瘤细胞黏附于混布宁包被的Transwell。(P＜0.01)反之，CM-甲壳质确无此作用。SCM-甲壳质确无此作用。SCM-甲壳质I、II和III均有抑制瘤细胞的粘附作用，但它是随硫酸化率的增高而作用加强。相反，SCM-壳聚糖确无此作用，即使6-0和N-端完全硫酸化也无该作用。
用SCM-甲壳质III处理的瘤细胞或混布宁底物对瘤细胞迁移的影响。我们所做的实验是使用SCM-甲壳质III来预处理或不处理(空白)瘤细胞，以及混布宁底物，来看瘤细胞的移动率。瘤细胞移动到被固定在Transwell滤膜下面的混布宁处，被阻止是由于加入SCM-甲壳质III或肝素〔3H〕-肝素预Transwell下室的缘故。用SCM-甲壳质III或肝素预处理混布宁包被的滤膜引起肿瘤细胞移动受阻。相反瘤细胞不被预处理，则无此现象。CM-甲壳质无论用什么方式来处理也没有抑制瘤细胞的移动作用。我们观察到，孵育2小时后〔3H〕-肝素与混布宁是主要的结合形式，在这一试验中，〔3H〕-肝素加入到用混布宁包被的室孔内，其中有未标记的肝素或硫酸化甲壳质的衍生物存在及不存在(空白)等组，作为抑制剂用。Fig4表明依据其不同浓度，未标记的肝素或SCM-甲壳质III完全地抑制〔3H〕-标记肝素与混布宁的结合(即抑制了转移)。相反，SCM-甲壳质I和CM-甲壳质对肿瘤细胞的浸润、黏附和迁移没有作用。我们发现，加入SCM-甲壳质III或没标记的肝素1个小时内有70-80％混布宁-〔3H〕-肝素结合体被拆开，表明SCM-甲壳质III和肝素对混布宁的结合是可逆的。硫酸化甲壳质衍生物对瘤细胞外基质酶降解的影响。在浸润急性期，瘤细胞所产生的蛋白水解酶和糖甙降解酶是使瘤细胞转移的主要因子，其机制是破坏了由纤维连结蛋白和硫酸化氨基多糖所构成的几道结缔组织屏障所改瘤细胞的转移。值得注意的是，肝素能抑制黑色素瘤的硫酸化肝素的降解。因此，我们研究硫酸化的甲壳质衍生物是否有一个抵抗凝的性质，SCM-甲壳质III能抑制瘤细胞外基质的酶的降解，SCM-甲壳质III以及肝素通过存化的肝素酶能抑制HS的降解(硫酸化肝素)，其肝素酶来自于B16-BL6细胞，同时还要取决于其浓度与方法。CM-甲壳质不能抑制瘤细胞对再建基底膜基质的浸润以及除了1000μg/ml浓度外的一些浓度也不能抑制HS的降解。另一方面，SCM-甲壳质IIIB16-BL6细胞对IV型3H〕-标记胶原的水解作用可直接用3H-标记的IV型前胶原来进一步研究，其前胶原可从EHS瘤株存化获得。因为血清成份能影响来自于瘤细胞的IV型前胶原水解酶的活性。产生几释放(5)该实验使用小牛血清(BSA)。在放入B16-BL6细胞前，将干燥的IV型胶原与甲壳质衍生物和肝素孵育3小时，然后再加入B16-BL6细胞，用400μg/ml的SCM-甲壳质来施实，IV型胶超过75％的降解被抑制，而用肝素大约有20％的降解被抑制。CM-甲壳质在IV型胶原的水解中没有抑制作用。在加入B16-BL6细胞3个小时后，再将SCM-甲壳质III加入到IV型胶原中，其IV型胶原的水解活性没被观察到，以作为未施实对照组和比较。
四、稀土硝酸铈对喉癌细胞株Hep-2生长的抑制作用1、材料和方法1.1癌细胞株人喉癌细胞株Hep-2细胞。
1.2硝酸铈培养浓度将硝酸铈加入培养体系中，调整其终浓度为0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2mmol/L。
1.3喉癌Hep-2细胞单层培养方法取培养瓶内指数生长期的Hep-2细胞，经0.25％的胰酶消化后，用RPMI1640培养液调配成1×105/ml细胞悬液，接种于96孔板内，置于CO2培养箱内37℃、5％CO2培养。硝酸铈组(10个复孔)在培养24h后加入硝酸铈溶液并调节为相应的实验终浓度。连续培养3d，而对照组则连续培养4d。
1.4体外检测硝酸铈对Hep-2细胞生长影响的实验方法1.4.1MTT实验[2]癌细胞生长抑制率计算

1.4.2Hep-2细胞软琼脂克隆形成率测定[3]采用双层琼脂法，在每个平皿接种的细胞数为1×104个，其中琼脂培养基中含有系列浓度梯度的硝酸铈，以37℃、5％CO2在CO2培养箱内培养10d，以104个细胞中形成的细胞克隆数计算。计算公式如下

1.5统计学处理实验结果均采用x±s表示，采用t或t′检验。
2、结果2.1硝酸铈对喉癌Hep-2细胞增殖的影响硝酸铈从0.4mmol/L起，细胞其细胞培养孔的光密度便开始下降，尤其是0.8-3.2mmol/L范围中，光密度下降更为明显，见表1。
表1 硝酸铈对喉癌细胞增殖的影响(x±s)

注*与0浓度组比较，P＜0.05
2.2硝酸铈对喉癌Hep-2细胞软琼脂克隆形成率的影响在0.4mmol/L浓度以上，硝酸铈对Hep-2细胞软琼脂克隆形成率呈抑制状态，见表2。
表2硝酸铈对喉癌细胞克隆形成率的影响(x±s)

注*与0浓度组比较，P＜0.05由实验结果可见稀土元素铈对恶性喉癌细胞有明显的抑制增殖作用。亦有研究证实稀土元素对Lewis肺癌、Sigo肉瘤也有明显的抑制作用。
五、硒酸钠对人前列腺癌细胞PC-3细胞株活力和增殖的抑制1、材料和方法1.1材料、仪器 人前列腺癌细胞PC-3购自上海细胞所细胞库，硒酸钠和MTT购自Sigma公司，胰蛋白酶和RPMI-1640培养基购自GIBCO公司，优质小牛血清(中国杭州四季青生物技术公司)，3H-TdR购自中国原子能研究所。冷冻离心机(Heraeus公司，400R)，CO2培养箱(Heraeus，BB5060UV)，BHC-1300生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司)，酶标仪(Bio-Rad 550)，ZT-III型多空细胞样品收集器，Beckman LS-6500液闪计数仪。
1.2PC-3细胞的培养 将购买的细胞培养于RP-MI-1640培养基中(其中添加10％小牛血清，100u/ml青霉素100μg/ml链霉素)，细胞传代使用0.25％胰蛋白酶消化，每2天换1次培养液。当细胞培养至一定规模时，用胰酶消化获得细胞，PBS多次洗涤，调节细胞密度至105个/ml，将细胞接种到96孔板中，每孔0.1ml，细胞接种后继续培养24小时，然后用于不同的实验。
1.3MTT法检测细胞的活力 将96孔板中的细胞分为4组，分别为对照组，分别为对照组，硒酸钠抵、中、高剂量组。对照组用普通培养液继续培养，硒酸钠作用组用添加了硒酸钠的培养基培养，药物终浓度分别为5、10和15μmol/L。加药后分别继续培养24和48小时，然后每孔加MTT200μl(5mg/ml)，4小时后弃去培养基，每孔加二甲基亚砜100μl，酶标仪上测定A570nm。
1.43H-TdR掺入实验 按上述方法以不同浓度的硒酸钠处理细胞48小时后，加入3H-TdR(5×104Bq/cell)，继续培养12小时后，用胰酶消化细胞，用多空样品收集器收集细胞于999型纤维膜上，烘干加闪烁液，于Beckman LS-6500液闪计数仪上计数〔13，14〕。
1.5统计处理 实验结果用SPSS 10.0统计软件进行统计，统计方法为t检验，结果以(x±s)表示。
2.结果硒酸钠对PC-3细胞活力的抑制。由表1可见硒酸钠可抑制PC-3细胞活力。24小时作用时，硒酸钠中剂量组A值显著地低于对照组，高剂量组A值与对照组有极显著差异。48小时作用时硒酸纳低剂量组A值显著低于对照组中剂量和高剂量组A值与对照组有极显著差异。
表1 硒酸纳对PC-3细胞活力的影响

与对照组相比，*P＜0.05；#P＜0.01。
硒酸纳对PC-3细胞细胞增殖的抑制48小时的硒酸纳处理后，可抑制PC-3细胞的增殖，低剂量组(2057±217)cpm与对照组(2110±268)cpm与对照组相比差异有显著性，高剂量组(1704±165)cpm与对照组相比，差异有极显著性，并且硒酸纳对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖效应。
六、维生素C抗氧化的实验研究研究证实，维生素C有很强的抗氧化作用，它将氧化物质还原，保护了有生物活性的物质不被氧化或延长发挥其生物活性。
维生素C抗氧化实验1、原理维生素C能还原2，6二氯酚靛酚，同时本身被氧化成脱氢维生素C，既将氧化物质还原，达到抗氧化作用。
维生素C 2，6二氯酚靛酚(氧化型)
脱氢维生素C 2，6二氯酚靛酚(还原型)2、材料与方法2.1材料2，6二氯酚靛酚(上海化学试剂公司)维生素C(既抗坏血酸)(上海医药公司)2.2方法2，6二氯酚靛酚在硷性或中性环境中呈蓝色，在酸性溶液中为浅红色，被还原后无色。用2，6二氯酚靛酚滴定维生素C，滴至全部溶液呈浅红色(约15称不退色)既达终点。此时表示溶液中的维生素C已被全部氧化。以滴定时所需要2，6二氯酚靛酚的量计算出所消耗的维生素C的量。
公式N标·V标＝N测·V测3、结果0.088mg维生素C氧化0.01N 2，6二氯酚靛酚1ml。
注由上述实验及化学反应式可见维生素C是很强的抗氧化剂。在组织与细胞内将氧化物质还原而达到保护SCM-Chitin的作用。
七、抗坏血酸和亚硒酸钠对肝癌细胞影响的研究采用细胞倍增时间、分裂指数、生化变化和软琼脂克隆形成率等指标测定分化，研究了抗坏血酸和亚硒酸纳对人肝癌细胞逆转的作用。结果表明用抗坏血酸4mmol·L-1联合亚硒酸纳2μmol·L-1处理细胞后，细胞的生长率和有丝分裂指数都显著下降。一些与细胞恶性表型有关的指标，如细胞表面电荷明显下降电泳率从1.74μm·s-1·V-1·cm-1下降到0.91μm·s-1·V-1·un-1，甲胎蛋白含量从331μg·g-1(蛋白)下降到90μg·g-1，γ-谷氨酰转肽酶活性从0.74U·g-1(蛋白)下降到0.19U·g-1。与细胞分化有关的指标，如酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)的活性从14.7μmoml·g-1(蛋白)升高至42.6μmoml·g-1，软琼脂克隆形成能力下降94.7％。由此可见，抗坏血酸和亚硒酸纳联合能诱导肝癌细胞在分化，逆转肿瘤细胞的恶性表型。
具体实施例方式
1、羧甲基甲壳质(SCM-Chitin)的制备磺酸黄甲壳质来自于螃蟹壳，用常规方法在使用前将其粉碎至45～60目。CM-甲壳质制备，羧甲基度可用0.40，0.56，和0.80的。磺酸化的甲壳质和CM-甲壳质是用Horton和Just的-般方法制备的。简言之，甲壳质和CM-甲壳质是重蒸的吡啶来除去水然后在用吡啶悬出来处理。磺酰氯酸-吡啶的混合物加入到甲壳质悬液之中，混合物在搅拌下沸腾回流90分钟。上清夜被轻轻地倾弃，将残渣悬在冰水之中，然后用2MnaOH调pH9。加以醇使沉淀形成，再在水中溶之，然后用无离子水透析，除去游离的盐，然后冻干。
取制得的磺酸化羧甲基甲壳质300重量份和购得的抗坏血酸盐200重量份，硝酸铈40重量份，硒酸钠10重量份粉碎成60目的粉末，装入现有的药用胶囊，即完成本发明的药物的制备。
权利要求
1.一种杀灭癌细胞，抑制恶性肿瘤转移的药物，其特征是由以下重量份数比的原料组成磺酸化羧甲基甲壳质250-350、抗坏血酸盐150-250、硝酸铈30-50、硒酸钠5-15。
2.根据权利要求1的一种杀灭癌细胞，抑制恶性肿瘤转移的药物，其特征是所用原料重量份数比为磺酸化羧甲基甲壳质300、抗坏血酸200、硝酸铈40、硒酸钠10。
全文摘要
一种杀灭癌细胞，抑制恶性肿瘤转移的药物，本发明的药物由以下重量份数比的原料组成磺酸化羧甲基甲壳质(SCM－ChitinIII)250－350、抗坏血酸盐(维生素C)150－250、硝酸铈30－50、硒酸钠5－15。发明的积极效果在于利用对恶性肿瘤转移有明显抑制作用SCM－ChitinIII和对恶性肿瘤细胞有很强的杀灭能力稀土元素铈及抗氧化剂硒和维生素C组成防治恶性肿瘤的药物，其中的各原料成分相互协同，在抑制恶性肿瘤细胞转移和杀灭肿瘤细胞具有突出的效果，有望使恶性肿瘤得到治愈，或大大地减少肿瘤病人的死亡。甚到可避免手术，放射与化疗来实现治愈肿瘤。
文档编号A61K33/04GK1927221SQ20061001681
公开日2007年3月14日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者冯延民 申请人:姚春阳, 冯延民