专利名称：变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及到一种变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法。
背景技术：
龋病(Caries)是危害人类健康的主要口腔疾病，被WHO列为三大严重危害人类健康的疾病之一。目前在我国龋病发生率有上升的趋势，儿童和老年人发病率甚至高达80％以上，因此找出控制龋病的有效措施是当前的紧迫任务。
由于龋病是一种细菌性疾病，变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是龋病的主要致龋菌，它在牙面的粘附和集聚是龋病发生的先决条件。葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTFs)是变链菌的主要粘附毒力因子之一，介导变形链球菌细胞对牙面的蔗糖依赖性黏附，在龋病的发生发展中起着关键作用(ChiaJS，Lin RH，Chen JY et al.Inhibition of glucosyltransferase activities of Streptococcus mutans by amonoclonal antibody to a subsequence peptide.Infect Immun，1993；61(11)4689-95)。变链菌的GTFs有三种形式，即GtfB、GtfC和GtfD，其中以合成水不溶性葡聚糖的GtfB在变链菌的蔗糖依赖性粘附中尤为重要。GtfB分子量为165.8KDa，其基因全长为4428bp，编码合成约1400个氨基酸残基的蛋白质，蛋白分子中有特定的功能区定位和抗原表位的分布(Eto A，Saido TC，Fukushima K et al.Inhibitory effect of aself-derived peptide on glucosyltransferase of Streptococcus mutans.Possible novel anticariesmeasures.J biol chem，1999；274(22)15797-802)。
免疫防治是控制龋病的有效手段之一。国外在20世纪70年代就尝试用主要致龋菌变链菌的减毒全菌疫苗进行免疫，结果发现变形链球菌全菌多价疫苗可降低龋病发生率，但变形链球菌某些抗原成分可诱发抗体与人类心脏组织发生交叉反应。近年来，先后采用了亚单位疫苗、多肽疫苗等手段进行免疫防龋，但仍存在疫苗制备困难、成本高、免疫原性弱、免疫效力短等缺点。
目前，急需开发出能克服现有疫苗缺点的新型变形链球菌疫苗。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种治疗和预防变形链球菌相关疾病的疫苗。该疫苗含有序列SEQ ID No.3所示的的变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因。
进一步的，上述变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因片段装载于表达载体上。
优选的，所述的表达载体是真核表达载体。
进一步优选的，所述的真核表达载体是质粒。
其中，上述的变形链球菌相关疾病为龋病。
本发明的第二个目的在于提供一种制备上述疫苗的方法。该方法包括以下步骤a、合成序列SEQ ID No.1所示的特异性上游引物5’-ATA TGG TAC CATGAC CGA AGC GAC ATC TAA GCA AGA-3’和序列SEQ ID No.2所示的特异性下游引物下游引物5’-ACT ACT CGA GTT AGA ACC ATT GAC CCT GAG CATTGC-3’，用这对引物从变链菌基因组DNA中扩增制备序列SEQ ID No.3所示的变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因；b、将所得变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因装载在表达载体上。
本发明的第三个目的在于提供一种药物组合物。该药物组合物含有上述的疫苗以及药学上可以接受的载体和赋形剂。
进一步的，上述药物组合物还含有免疫佐剂。
优选的，上述的免疫佐剂是氢氧化铝、脂质体或霍乱毒素B亚单位。
其中，上述药物组合物的剂型是口服制剂、口含制剂或注射剂。
用于制备本发明基因疫苗的载体是本领域已知的，如重组噬菌体、质粒、腺病毒载体和其他的经加工后可以装载变形链球菌表面蛋白编码基因的表达载体，尤其是真核表达载体。同时，需要说明的是以上生产和操作本发明公开的重组载体和药物组合物的具体技术方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的技术完成。
本发明的有益效果在于本发明基因疫苗具有制备方法简便、成本低廉、抗原在细胞内的表达与病原体自然感染过程相似、能够持续诱导有效的体液和细胞免疫应答、安全性高等优点，可以弥补现有药物昂贵、体内稳定性差等缺陷，能增大给药时间的间隔、大大减少给药量、减轻使用者经济负担并提高患者的生活质量。功效实验也证明了本发明基因疫苗对龋病等变形链球菌相关疾病具有明显的疗效，并且经检测不会整合进宿主细胞的基因组，也不会对受试者造成体重降低等其他不良影响，具有很好的安全性，符合用药要求，具有很好的市场前景。
图1为PCR扩增出的gtfB基因片段的1％琼脂糖电泳图，其中M为DNA分子量Markerλ-EcoT14I，1和2都为扩增所得的gtfB基因(4.7Kb)。
图2为重组质粒pcDNA3-gtfB的构建流程图。
图3为重组质粒pcDNA3-gtfB酶切鉴定的1％琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA分子量Markerλ-EcoT14I，1和2为KpnI酶切，3和4为XhoI酶切，5、6和7为KpnI+XhoI双酶切。
以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
具体实施例方式实施例一 变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因gtfB的获取合成扩增变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因gtfB所用的特异性PCR引物上游引物(SEQ ID No.1)5’-ATA TGG TAC CAT GAC CGA AGC GAC ATCTAA GCAA GA-3’；下游引物(SEQ ID No.2)5’-ACT ACT CGA GTT AGA ACC ATT GAC CCTGAG CAT TGC-3’。
在上、下游引物的5’端分别加入KpnI和XhoI限制性内切酶酶切位点。在酶切位点的5’端各加4个保护性碱基。上游引物在编码基因的上游加入启始密码子ATG，下游引物在编码基因的下游加入终止密码子TTA。
以变形链球菌GS-5全基因组DNA为模板，采用高信度的Pyrobest DNA合成酶(TakaRa，大连)，用以上设计的引物，用Gene Amp PCR System 9600型PCR仪(Perking Elmer，美国)进行扩增，获得gtfB基因片段(904-4578bp)。扩增条件采用二步法PCR，94℃变性30Sec，68℃退火和延伸8min，30次循环，4℃贮存PCR产物。采用小量胶回收试剂盒(Watson，上海)回收并纯化gtfB目的基因。
将扩增得到的目的基因gtfB用1％琼脂糖电泳检测，检测结果为单一条带，扩增特异性高，分子量为与4.7Kb(见图1)，序列与预计相同序列与预计相同(变形链球菌表面蛋白基因的核苷酸序列见SEQ ID No.3，其编码的氨基酸序列见SEQ ID No.4)。
实施例二 重组质粒pcDNA3-gtfB的构建1、重组质粒pcDNA3-gtfB的构建(构建流程见图2)真核表达载体pcDNA3和目的基因gtfB分别在KpnI和XhoI酶的通用缓冲液中，37℃双酶切2hr，双酶切产物经1％低熔点琼脂糖凝胶(TakaRa，大连)电泳后，用小量胶回收试剂盒纯化双酶切产物。用DNA连接试剂盒(TakaRa，大连)，将目的基因gtfB与真核表达载体pcDNA3在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接3hr。连接产物立即转化感受态细胞大肠肝菌JM109，用氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆株，得到转化子。
2、重组质粒的酶切鉴定和测序对所得重组质粒进行酶切经KpnI、XhonI单酶切为9.0kb的单一片段，经KpnI、XhonI双酶切为3.6kb的gtfB目的基因片段和5.4kb的pcDNA3空载质粒片段。结果表明，重组质粒pcDNA3-gtfB构建成功(见图3)。
经DNA测序结果显示重组质粒pcDNA3-gtfB中插入基因长36756p，与Shiroza等1986年用双脱氧链终止法测定的变形链球菌GS-5的gtfB基因序列完全相同，且插入的方向正确，也没有改变gtfB基因的阅读框架，保证了编码氨基酸序列的正确性。
实施例三 本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗的制备1、将实施例二所得的转化子接种于LB液体培养基中，置空气摇床箱内，37℃振摇培养(250rpm)过夜，用质粒抽取试剂盒提取重组质粒。
2、用常规方法提纯重组质粒pcDNA3-gtfB，并将其制备为基因疫苗。
实施例四 本发明基因疫苗注射剂的制备该注射剂可以通过以下方法制备得到无菌条件下取注射用水，再加入原料重组质粒pcDNA3-gtfB，在无菌条件下混合均匀，稀释到0.1mg/ml，并在无菌条件下混合均匀，加缓冲液调节pH值至7.0后无菌过滤分装成注射剂，低温保存，即得。
试验例一 本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗在真核细胞中的表达用脂质体介导本发明基因疫苗转染COS-7细胞，培养一段时间后进行各项检测，以确定本发明基因疫苗转染真核细胞后具有转录和翻译活性。
检测项目及结果1、用RT-PCR法检测插入基因gtfB的转录产物在本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞中提取总RNA，经RT-PCR扩增后进行电泳检测，在凝胶上可见分子量与gtfB一致的条带，表明有插入基因的转录产物。
2、用免疫组化LSAB法检测外源基因gtfB在细胞内的表达产物实验结果显示，本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞的胞浆呈棕色，pcDNA3空载体稳定转染的COS-7细胞的胞浆内未见明显棕色着色，表明本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞的胞内有变形链球菌葡糖基转移酶B的表达。
3、用流式细胞仪检测外源基因在细胞膜上的表达产物，结果本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞的细胞膜上有变形链球菌葡糖基转移酶B存在。
4、用Western免疫印迹法检测外源基因在细胞外上清中的表达产物，结果表明本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞的细胞外上清中有变形链球菌葡糖基转移酶B表达。
本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗转染真核细胞后具有转录和翻译活性，表达的蛋白质在胞内、胞膜上及胞外具有分布，分子量与预计相同，并可与相应的抗体特异结合。
试验例二 本发明基因疫苗注射剂免疫效果的动物实验实验分组及免疫将体重合适的适龄健康大鼠24只随机均分为pcDNA3-gtfB注射剂组、变形链球菌JBP灭活全菌组、pcDNA3空载体组、PBS组，每组大鼠分别行双侧颌下腺周注射，每只每次100ul(1ug/ul)，共免疫3次。
随后，给各组分别接种变形链球菌，用致龋食物诱龋至实验结束(共90天)。
防龋作用检测指标血清IgG和唾液S-IgA；唾液变形链球菌计数；牙面菌斑指数；龋齿计分根据Keyes评分标准计分。
实验结果上述功效实验的实验结果表明，本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗经颌下腺腺周注射免疫大鼠均产生了显著的的防龋效果，并且应用效果与现有的灭菌全菌疫苗基本相当。
试验例三 本发明基因疫苗注射剂的安全性实验1、本发明基因疫苗注射剂对受试大鼠的体重的影响试验例二的受试结束后，测量各组大鼠的体重。
灭活全菌组大鼠的体重明显较其他组轻(P＜0.01)，而本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗组与pcDNA3空载体组和PBS组相比无明显差异，表明本发明基因疫苗基本无毒性，安全性明显优于现有的灭菌全菌疫苗。
2、本发明基因疫苗是否整合进宿主细胞基因组的验证实验通过PCR实验对本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗整合进受试大鼠的基因组的可能性进行了检测。PCR实验结果表明，在10000个组织细胞核中就能检测出一个pcDNA3-Pac拷贝的检测水平下进行多次实验，免疫各组中均没有发现本发明基因疫苗整合进宿主细胞基因组，即其整合几率低于万分之一。表明本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗具有很好的生物安全性。
由以上实例可见，本发明变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗制备简便、成本低廉、免疫效果好、使用安全，具有很好的市场前景。
以上的较优的具体实施方式
是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。
变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法.ST25SEQUENCE LISTING<110>四川大学<120>变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法<130>A060038<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>PCR引物1<400>1atatggtacc atgaccgaag cgacatctaa gcaaga 36<210>2<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>PCR引物2<400>2actactcgag ttagaaccat tgaccctgag cattgc 36<210>3<211>4428<212>DNA<213>Streptococcus mutans<400>3atggacaaga aagtgcgtta taaactgcgc aaagttaaaa aaagatgggt gacagtatct 60gttgcatctg ctgtgatgac tttaactaca ctttcgggtg gcttggttaa agcagattct120aatgaatcga aatcccaaat ttctaatgat tctaatacca gtgttgttac tgctaatgaa180gaatctaatg taataaccga agcgacatct aagcaagaag ctgctagtag tcaaactaat240catacagtaa cgacaagcag tagctctact tcggtagtta atcccaaaga ggttgtaagt300aatccttata ctgttgggga aacagcttct aatggtgaaa agcttcaaaa tcaaacaact360acagttgaca aaacttctga agctgctgct aataatatta gtaaacaaac aaccgaagct420gatacagatg ttattgatga tagcaatgca gccaatctac aaatattgga aaaacttccc480aatgtaaaag aaattgatgg taagtattat tattatgaca ataacggcaa agttcgtact540aattttacat taattgctga tggcaaaatt ttacattttg atgaaactgg cgcttatact600gatacatcaa ttgacactgt aaataaagat atcgtcacaa caagaagtaa tctatacaaa660aaatataatc aagtttatga tcgctctgca cagagctttg agcatgttga tcattatttg720acagctgaga gttggtatcg tcctaagtac atcttgaagg atggcaaaac atggacacag780tcaacagaaa aagatttccg tcccttattg atgacatggt ggcctgacca agaaacgcag840cgtcaatatg ttaactacat gaatgcacag cttggcatta acaagactta tgatgataca900agtaatcaat tgcaattaaa tattgcagct gcaactattc aagcaaaaat tgaggccaaa960attacaactt taaagaatac tgattggctg cgtcagacta tttccgcatt tgttaagaca 1020cagtcagctt ggaacagtga cagcgaaaaa ccgtttgatg atcatttaca aaatggagca 1080
变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法.ST25gtgctttacg ataatgaagg aaaattaacg ccttatgcta attccaacta ccgtatctta1140aatcgcaccc cgaccaatca aaccggaaag aaagatccaa ggtatacagc tgataacact1200atcggcggtt atgaattcct tttggccaac gatgtggata attctaatcc tgtcgtgcag1260gccgaacaat tgaactggct acattttctc atgaactttg gtaacattta tgccaatgat1320ccggatgcta actttgattc cattcgtgtt gatgcggtag ataatgtgga tgctgacttg1380ctccaaattg ctggggatta cctcaaagct gctaagggga tccataaaaa tgataaggct1440gctaatgatc atttgtctat tttagaggca tggagtgaca acgacactcc ttaccttcat1500gatgatggcg acaatatgat taatatggac aataagctgc gtttgtctct attattttca1560ttagctaaac ccttaaatca acgttcaggc atgaatcctc tgatcactaa cagtttggtg1620aatcgtactg atgataatgc tgaaactgcc gcagtccctt cttattcctt catccgtgcc1680catgacagtg aagtgcagga tttgattgct gatatcatca aggcagaaat caatcctaat1740gttgtcgggt attcattcac tatggaggaa atcaagaagg ctttcgagat ttacaacaaa1800gacttattag ctacagagaa gaaatacaca cactataata cggcactttc ttatgccctg1860cttttaacca acaaatccag tgtgccgcgt gtctattatg gggatatgtt tacagatgac1920gggcaataca tggctcataa gacgatcaat tacgaagcca tcgaaaccct gcttaaagct1980cgtattaagt atgtttcagg cggtcaagcc atgcgcaatc aacaggttgg caattctgaa2040atcattacgt ctgtccgcta tggtaaaggt gctttgaaag caacggatac aggggaccgc2100accacacgga cttcaggagt ggccgtgatt gaaggcaata acccttcttt acgtttgaag2160gcttctgatc gcgtggttgt caatatggga gcagcccata agaaccaagc ttaccgacct2220ttactcttga ccacagataa cggtatcaag gcttatcatt ccgatcaaga agcggctggt2280ttggtgcgct acaccaatga cagaggggaa ttgatcttca cagcggctga tattaaaggc2340tatgccaacc ctcaagtttc tggctattta ggtgtctggg ttccagtagg cgctgcgctg2400atcaagatgt tcgcgttgcg gctagcacgg ccccatcaac agatggcaag tgtgcatcaa2460aatgcggccc ttgattcacg cgtcatgttt gaaggtttct ctaatttcca agctttcgcc2520actaaaaaag aggaatatac caatgttgtg attgctaaga atgtggataa gtttgcggaa2580tggggggtca cagactttga aatggcaccg cagtatgtgt cttcaacgga tggttctttc2640ttggattctg tgatccaaaa cggctatgct tttacggacc gttatgattt gggaatttcc2700aaacctaata aatacgggac agccgatgat ttggtgaaag ccatcaaagc gttacacagc2760aagggcatta aggtaatggc tgactgggtg cctgatcaaa tgtatgcttt ccctgaaaaa2820gaagtggtaa ctgcaacccg tgttgataag tatgggactc ctgttgcagg aagtcagatc2880aaaaacaccc tttatgtagt tgatggtaag agttctggta aagatcaaca agccaagtat2940gggggagctt tcttagagga gctgcaagcg aagtatccgg agctttttgc gagaaaacaa3000atttccacag gggttccgat ggatccttct gttaagatta agcaatggtc tgccaagtac3060tttaatggga caaatatttt agggcgcgga gcaggctatg tcttaaaaga tcaggcaact3120aatacttact ttaatatttc agateataaa gaaataaact tccttcctaa aacattgtta3180aaccaagata gtcaagttgg tttctcttat gacggtaaag gttatgttta ttattcaacg3240agtggttacc aagccaaaaa tactttcatc agcgaaggtg ataaatggta ttattttgat3300aataacggtt atatggtcac tggtgctcaa tcaattaacg gtgttaatta ttatttctta3360tcaaatggcc tacagctcag agatgctatt cttaagaatg aagatggaac ttacgcttat3420
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变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法.ST25Gly Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Lys Gly Ile His Lys Asn Asp Lys Ala465 470 475 480Ala Asn Asp His Leu Ser Ile Leu Glu Ala Trp Ser Asp Asn Asp Thr485 490 495Pro Tyr Leu His Asp Asp Gly Asp Asn Met Ile Asn Met Asp Asn Lys500 505 510Leu Arg Leu Ser Leu Leu Phe Ser Leu Ala Lys Pro Leu Asn Gln Arg515 520 525Ser Gly Met Asn Pro Leu Ile Thr Asn Ser Leu Val Asn Arg Thr Asp530 535 540Asp Asn Ala Glu Thr Ala Ala Val Pro Ser Tyr Ser Phe Ile Arg Ala545 550 555 560His Asp Ser Glu Val Gln Asp Leu Ile Ala Asp Ile Ile Lys Ala Glu565 570 575Ile Asn Pro Asn Val Val Gly Tyr Ser Phe Thr Met Glu Glu Ile Lys580 585 590Lys Ala Phe Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Ala Thr Glu Lys Lys595 600 605Tyr Thr His Tyr Asn Thr Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Leu Leu Thr Asn610 615 620Lys Ser Ser Val Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Met Phe Thr Asp Asp625 630 635 640Gly Gln Tyr Met Ala His Lys Thr Ile Asn Tyr Glu Ala Ile Glu Thr645 650 655Leu Leu Lys Ala Arg Ile Lys Tyr Val Ser Gly Gly Gln Ala Met Arg660 665 670Asn Gln Gln Val Gly Asn Ser Glu Ile Ile Thr Ser Val Arg Tyr Gly675 680 685Lys Gly Ala Leu Lys Ala Thr Asp Thr Gly Asp Arg Thr Thr Arg Thr690 695 700Ser Gly Val Ala Val Ile Glu Gly Asn Asn Pro Ser Leu Arg Leu Lys705 710 715 720Ala Ser Asp Arg Val Val Val Asn Met Gly Ala Ala His Lys Asn Gln725 730 735Ala Tyr Arg Pro Leu Leu Leu Thr Thr Asp Asn Gly Ile Lys Ala Tyr740 745 750His Ser Asp Gln Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Tyr Thr Asn Asp Arg755 760 765
变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法.ST25Gly Glu Leu Ile Phe Thr Ala Ala Asp Ile Lys Gly Tyr Ala Asn Pro770 775 780Gln Val Ser Gly Tyr Leu Gly Val Trp Val Pro Val Gly Ala Ala Leu785 790 795 800Ile Lys Met Phe Ala Leu Arg Leu Ala Arg Pro His Gln Gln Met Ala805 810 815Ser Val His Gln Asn Ala Ala Leu Asp Ser Arg Val Met Phe Glu Gly820 825 830Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Thr Lys Lys Glu Glu Tyr Thr Asn835 840 845Val Val Ile Ala Lys Asn Val Asp Lys Phe Ala Glu Trp Gly Val Thr850 855 860Asp Phe Glu Met Ala Pro Gln Tyr Val Ser Ser Thr Asp Gly Ser Phe865 870 875 880Leu Asp Ser Val Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp885 890 895Leu Gly Ile Ser Lys Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Val900 905 910Lys Ala Ile Lys Ala Leu His Ser Lys Gly Ile Lys Val Met Ala Asp915 920 925Trp Val Pro Asp Gln Met Tyr Ala Phe Pro Glu Lys Glu Val Val Thr930 935 940Ala Thr Arg Val Asp Lys Tyr Gly Thr Pro Val Ala Gly Ser Gln Ile945 950 955 960Lys Asn Thr Leu Tyr Val Val Asp Gly Lys Ser Ser Gly Lys Asp Gln965 970 975Gln Ala Lys Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Glu Glu Leu Gln Ala Lys Tyr980 985 990Pro Glu Leu Phe Ala Arg Lys Gln Ile Ser Thr Gly Val Pro Met Asp995 10001005Pro Ser Val Lys Ile Lys Gln Trp Ser Ala Lys Tyr Phe Asn Gly101010151020Thr Asn Ile Leu Gly Arg Gly Ala Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gln102510301035Ala Thr Asn Thr Tyr Phe Asn Ile Ser Asp Asn Lys Glu Ile Asn104010451050Phe Leu Pro Lys Thr Leu Leu Asn Gln Asp Ser Gln Val Gly Phe105510601065Ser Tyr Asp Gly Lys Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Thr Ser Gly Tyr107010751080
变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法.ST25Gln Ala Lys Asn Thr Phe Ile Ser Glu Gly Asp Lys Trp Tyr Tyr108510901095Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Met Val Thr Gly Ala Gln Ser Ile Asn110011051110Gly Val Asn Tyr Tyr Phe Leu Ser Asn Gly Leu Gln Leu Arg Asp111511201125Ala Ile Leu Lys Asn Glu Asp Gly Thr Tyr Ala Tyr Tyr Gly Asn113011351140Asp Gly Arg Arg Tyr Glu Asn Gly Tyr Tyr Gln Phe Met Ser Gly114511501155Val Trp Arg His Phe Asn Asn Gly Glu Met Ser Val Gly Leu Thr116011651170Val Ile Asp Gly Gln Val Gln Tyr Phe Asp Glu Met Gly Tyr Gln117511801185Ala Lys Gly Lys Phe Val Thr Thr Ala Asp Gly Lys Ile Arg Tyr119011951200Phe Asp Lys Gln Ser Gly Asn Met Tyr Arg Asn Arg Phe Ile Glu120512101215Asn Glu Glu Gly Lys Trp Leu Tyr Leu Gly Glu Asp Gly Ala Ala122012251230Val Thr Gly Ser Gln Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg123512401245Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp His His125012551260Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg126512701275Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp128012851290Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln129513001305Leu Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe131013151320Val Thr Asp Arg Tyr Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser132513301335Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln134013451350Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg135513601365
变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法.ST25Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gln137013751380Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg His Gly Arg Ile Ser Tyr138513901395Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val Arg140014051410Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala141514201425Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg143014351440Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr144514501455Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser Gly Glu Arg Val Arg146014651470Ile Asn147权利要求
1.一种治疗和预防变形链球菌相关疾病的疫苗，其特征在于含有序列SEQ IDNo.3所示的的变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的变形链球菌葡糖基转移酶B编码cDNA装载于表达载体上。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的表达载体为真核表达载体。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为质粒。
5.根据权利要求1～4所述的疫苗，其特征在于所述的变形链球菌相关疾病为龋病。
6.一种制备权利要求2所述的疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤a、设计合成序列SEQ ID No.1所示的特异性上游引物和序列SEQ ID No.2所示的特异性下游引物，用这对引物从变链菌基因组DNA中扩增制备变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因；b、将所得变形链球菌葡糖基转移酶B编码基因转载在表达载体上。
7.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1～5任一项所述的疫苗以及药学上可以接受的载体和赋形剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于还含有免疫佐剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述的免疫佐剂是氢氧化铝、脂质体或霍乱毒素B亚单位。
10.根据权利要求7～9任一项所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的剂型是口服制剂、口含制剂或注射剂。
全文摘要
本发明提供了一种变形链球菌葡糖基转移酶基因疫苗及其制备方法。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明疫苗以及药学上可以接受的载体和赋形剂。功效实验证明了本发明基因疫苗能够持续高水平的诱导针对变形链球菌表面蛋白的免疫反应，对龋病等变形链球菌相关疾病具有明显的疗效，并且经检测不会整合进宿主细胞的基因组，也不会对受试者造成体重降低等其他不良影响。具有很好的安全性，符合用药要求，市场前景很好。
文档编号A61P31/00GK101036791SQ20061002050
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月17日 优先权日2006年3月17日
发明者刘天佳, 杨锦波, 刘建国, 郭丽宏, 杨德琴, 曹福娴, 贾文祥, 李继遥, 周学东, 谭红 申请人:四川大学