专利名称：一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物化学医药领域，涉及一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法，具体的说，本发明涉及一种从蒙药苦马豆(Sphaerophysa salsula(Pall.)DC.)中提取的具有明显预防和治疗肿瘤作用的新型三萜类化合物及其制备方法。
背景技术：
目前，全世界每年有600多万人死于癌症，新发病例800万，这数字还在逐年增加。我国13亿人口中每年有百万新发癌症病人，待治疗病人约200万，死亡约130万。估计到2006年，我国将有170万人死于癌症，癌症已成为人类的一大杀手！然而，以手术、放疗、化疗为主的传统治疗模式虽然有一定疗效，却存在许多不足，未能取得整体满意效果。因此，人们把目光转向中药，试图从天然成分中寻找毒副作用小，作用独特的抗肿瘤药物。苦马豆(Sphaerophysasalsula(Pall.)DC.)为豆科苦马豆属植物，主要分布于我国西北，其性微苦、平，有补肾、利尿、消肿固精之功效。现代药理学研究表明，苦马豆全草水提物具有降血压、中枢神经系统抑制作用及对动物血流动力学和耐缺氧的影响。迄今为止，国内外对其化学成份知之甚少，更没有其关于抗肿瘤活性的报道。为了探索这一药用植物是否具有抗肿瘤有效成分，我们首次对苦马豆果实的提取物的化学成分进行了研究，发现了一种高效的具有抗肿瘤作用的化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的化合物。
本发明的另一个目的是提供上述化合物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述化合物的应用。
本发明的提供了一种具有抗肿瘤活性的化合物，该化合物的结构式为
其中，基团R1是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3z或者葡萄糖基中的一种；R2是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一种；R3是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一种。为了叙述方便可简称Sphaerophysone B或苦马豆酮B。
本发明的一个实施例中，该化合物的结构式为
该化合物被命名为7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。表1为苦马豆酮B核磁共振的数据结果。
表1苦马豆酮B的NMR数据(in CD3OD，1H NMR 500MHz，13C NMR 125MHz)
本发明的苦马豆酮B单体，是一种新发现的新型三萜类化合物；迄今为止，国内外没有其抗肿瘤活性的报道。而苦马豆素(Swainsonine)为一生物碱类化合物，最早从澳大利亚的植物Swainsona canescens中分离得到，其广泛存在于黄芪属和棘豆属植物，在我国也存在于“疯草”中，因而，它们之间有本质的不同。
本发明的苦马豆酮B可采用各种常规的方法制备，例如化学合成或者从适当的原料中提取。例如，本发明的7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可以采用如下方法制备的(1)将苦马豆粉碎；(2)以浓度(体积比浓度)为30-100％的饱和脂肪醇回流或浸泡提取2-5次，每次1-24小时，然后回收醇，得到醇提取物；(3)将醇提取物溶于1-100倍的水，以等体积的有机溶剂萃取2-5次，得到有机溶剂提取物；用于萃取的有机溶剂可以为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或者正丁醇；(4)将上述有机溶剂提取物过色谱柱，洗脱后即得。
本发明中，作为原料的苦马豆取适量即可，对于不同数量的苦马豆原料，提取和制备的试剂量相应改变，反应温度也为常规温度，例如室温，20-30℃。
本发明中，所用饱和脂肪醇浓度较好为60-100％。
本发明中，饱和脂肪醇较好为甲醇或乙醇。
本发明中，饱和脂肪醇用于将原料中的化合物充分溶解，以达到粗提目标化合物的目的。(2)中回流提取次数可以为2-3次，提取时间为1-2小时/次。例如，用于回流或浸泡的饱和脂肪醇可以是苦马豆体积的0.5-100倍，较好的，饱和脂肪醇与苦马豆的体积比为0.5∶1-10∶1。
本发明中，(2)中浸泡提取次数可以为2-3次，提取时间为8-16小时/次。
本发明中，醇提取物可以溶于1-10倍于醇提取物体积的水。
本发明中，用于萃取的有机溶剂为氯仿和/或二氯甲烷，或者两者的混合物。
本发明中，柱色谱填料可以为硅胶或氧化铝。
本发明中，样品量与填料的体积比范围为1∶1-1∶7。
本发明中，(4)中的洗脱剂为石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中任意两种混合或任意三种混合；两两混合的混合体积比例为100∶1-1∶1，三相溶剂的混合体积比例为100∶1∶1-4∶2∶1。
本发明中，(4)中的洗脱剂为氯仿-甲醇或者二氯甲烷-甲醇。
本发明所使用的试剂的设备都是市售或者常用的，实验条件可以根据实验室的条件进行常规替换和优化。
另一方面，本发明提供了苦马豆酮B的应用，即将该化合物用于制备抗肿瘤药物。
研究表明，本发明的苦马豆酮B对肿瘤细胞的抑制随着化合物浓度的增加而增加，其机理是将细胞阻滞在G2/M期，对小鼠的抑瘤实验表明，苦马豆酮B可抑制瘤体生长。
本发明的一个实施例中，以MTT法进行抗肿瘤作用的筛选。对7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对肿瘤细胞系(HepG2)、脑胶质瘤细胞(U87)、脑胶质瘤细胞(SF188)、乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(H460)及正常肝细胞系L02的作用进行了研究。结果显示随着用药浓度增高，与相应不加药对照组相比，细胞增殖活性分别下降了，说明化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞增殖。而正常肝细胞系L02的细胞增殖活性未有变化，显示出该化合物对正常细胞很少有毒性。
显微镜观察7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷处理肿瘤细胞系HepG2后细胞形态变化。未有上述化合物处理的细胞形态正常；7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷处理后的许多细胞，形态在光镜下变圆，经Hoechst 33528染色后，荧光镜下胞核固缩，核碎裂。
用流式细胞仪检测7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对肿瘤细胞系HepG2的细胞周期影响。结果显示化合物能使细胞阻滞于G2/M期。进一步研究表明，7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷抗肿瘤细胞能上调p53蛋白的表达。
建立肝移植瘤小鼠模型，通过消化道或腹腔注射等给药途径进行体内抑瘤实验。在治疗12天后，7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷治疗组瘤体重量显著低于生理盐水组。
本发明的苦马豆酮B可与市售或者常用的载体结合，用于预防或者治疗肿瘤和癌症。所述的药物可以为片剂或者针剂。
利用本发明苦马豆酮B，通过各种常规筛选方法，可筛选出与苦马豆酮B发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明的苦马豆酮B及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的苦马豆酮B为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人苦马豆酮B可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的苦马豆酮B还可与其他治疗剂一起使用。
本发明的苦马豆酮B在制备抗艾滋病药物中的应用中，可以是针剂或者片剂。
当本发明的苦马豆酮B多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，所述的肿瘤或者癌症可以是肝癌、脑瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌或者血癌等等。
本发明的苦马豆酮B为有效的抗肿瘤药剂，在该植物中含量高，生产成本较低。本发明从苦马豆酮B单体。该方法简单可靠，成本低，所提取的化合物的纯度都在99％以上，提取的效果好、成本低，实现了高效、经济的目的。可进行工业化大生产，利于推广应用。并且能充分利用我国西北丰富的苦马豆资源，可以推动西部大开发。
图1为7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对HepG2和L02细胞增殖影响图。同时设相应的不加药组；在处理24小时后用MTT法测定细胞增殖活性。用不同浓度的化合物处理肝肿瘤细胞系HepG2和正常肝细胞系L02。结果显示，随着用药浓度增高，与相应不加药对照组相比，细胞增殖活性分别下降了，说明化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞增殖。而正常肝细胞系L02的细胞增殖活性未有变化，显示出该化合物对正常细胞很少有毒性。其中，按下式计算苦马豆酮B对癌细胞的生长抑制率，抑制率＝(1-给药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
图2为7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷体外抗肿瘤的结果图。所用肿瘤细胞系有U87、H460、SF188和MCF-7。同时设相应的不加药组；在处理24小时后用MTT法测定细胞增殖活性。结果显示随着用药浓度增高与相应不加药对照组相比细胞增殖活性分别下降了，说明化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞增殖。
图3为用Western Blotting方法分析7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷处理肿瘤细胞系HepG2后p53蛋白表达变化。结果显示化合物能上调p53蛋白的表达。
图4为7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷处理肿瘤细胞系(HepG2)4小时后细胞形态变化图。A为未有上述化合物处理细胞形态，光镜下细胞正常；B为化合物处理细胞后形态，光镜下许多细胞变圆。C为未有化合物处理细胞经Hoechst 33528染色后细胞核的形态，荧光镜下细胞核基本正常；D为化合物处理细胞经Hoechst 33528染色后细胞核形态，荧光镜下胞核固缩，核碎裂。
图5为用流式细胞仪检测7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对肿瘤细胞系HepG2的细胞周期影响结果图。结果显示化合物能使细胞阻滞于G2/M期。
具体实施例方式
以下通过具体的实施方式的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。但不应将实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明上述思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段作出的各种替换手段或变更，均包含在本发明之内。
实施例1 7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-比喃葡萄糖苷的提取A.将1kg药材苦马豆粉碎后，装入提取罐B.8L的95％乙醇回流提取3次，每次2小时，回收乙醇，得乙醇提取物103g。
C.将乙醇提取物溶于1L水，以等体积的氯仿萃取3次，得氯仿提取物33.7g。
D.氯仿提取物经硅胶柱色谱(湿法装柱，干法上样)，样品量与硅胶总量比为1∶5，以氯仿∶甲醇(100∶2)洗脱3个保留体积后，重结晶得7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(147mg)。
实施例2 7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的提取a将1kg药材苦马豆粉碎后，装入提取罐b 10L甲醇浸泡提取3次，每次12小时，回收甲醇，得甲醇提取物116g。
c将甲醇提取物溶于800mL水，以等体积的二氯甲烷萃取2次，得二氯甲烷提取物31.9g。
d二氯甲烷提取物经氧化铝柱色谱(湿法装柱，干法上样)，样品量与氧化铝重量比为1∶10，以二氯甲烷∶甲醇(100∶3)洗脱4个保留体积后，重结晶得7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(132mg)。
实施例3 7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的体外抗肿瘤作用取对数期的细胞每孔3×104接种于96孔板上，12h后，弃上清，按一下分组给药肿瘤细胞设不加药组和加药组(浓度0~100μM)，每组设6个复孔，培养24h，弃上清，加入带MTT(四氮唑盐，Sigma产品)的培养液50μl培养4h(0.5mg/mL)，加入100μl DMSO(二甲亚砜)，振荡1小时，于酶标仪上570nm处测OD值。正常细胞系L02做对照。重复3次。
结果显示，随着用药浓度增高，与相应不加药对照组相比，细胞增殖活性分别下降了，说明化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞增殖。而正常肝细胞系L02的细胞增殖活性未有变化，显示出该化合物对正常细胞很少有毒性。
实施例4细胞形态学观察和Hoechst 33528染色肿瘤细胞设不加药组和加药组(加化合物浓度2μM)。细胞经2μM化合物作用4小时可进行光镜观察；然后，经冷甲醇固定后PBS洗涤两次，Hoechst 33528染色20分钟，荧光镜下观察细胞核形态。
未有上述化合物处理的细胞形态正常，经Hoechst 33528染色后细胞核亦基本正常；苦马豆酮B处理后的许多细胞，形态在光镜下变圆，经Hoechst 33528染色后，荧光镜下胞核固缩，核碎裂。
实施例5流式细胞术分析细胞周期实验设正常对照组(不加化合物7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和加药组(加化合物，浓度2μM)。细胞经2μM化合物作用6小时、18小时后收集细胞，经冷PBS洗涤两次，用70％预冷乙醇固定12小时以上，经PBS洗涤后加15μl RNase A(10g/L)和400μl碘化丙锭(50mg/L)避光染色；流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan Flow Cytometer)检测，FACS数据用FLOWJO software(Tree Star，CA)软件进行数据分析。结果显示化合物能使细胞阻滞于G2/M期。
不加药组6小时(A)和18小时(B)G2/M细胞数分别为7.73±0.98％，9.65±0.14％。加药组6小时(C)和18小时(D)G2/M细胞数分别为18.1±0.87％，29.4±0.9％。结果显示化合物能使细胞阻滞于G2/M期。
表2用流式细胞仪检测药物(2μM)对肿瘤细胞系HepG2的细胞周期影响
实施例6 Western Blotting方法分析p53蛋白表达变化收集HepG2细胞加100μl去污剂裂解液煮沸5分钟，等量蛋白上样，12％SDS-丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5％脱脂奶封闭，PBS-T漂洗，加一抗(p53 1∶1000)过夜，加二抗室温反应3h，化学发光底物显色。结果显示化合物7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷能上调p53蛋白的表达。
实施例7体内抑瘤实验建立肝移植瘤小鼠模型。昆明种小鼠(购自上海实验动物中心)雌雄兼有，体重19.2±1.8g。将肝癌实体瘤HepG2移植到小鼠，接种于小鼠腋下皮内。12天后，以无菌操作取出肝癌实体瘤匀浆器匀浆，用生理盐水1∶10稀释，然后各组小鼠腋下皮下注射瘤液0.25mL/只接种。给药(7β，24β，25-三羟基-9，19-环阿尔廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)组于接种前4天开始灌胃给药或腹腔注射等给药直到接种后11天，第12天将小鼠处死，取出瘤体，剥离后称取码瘤体净重。此实验重复3次，对3批实验结果进行统计分析。
表3体内抑瘤实验的初步结果
权利要求
1.一种分离提取的化合物，其特征在于，该化合物的结构式为 其中，基团R1是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3z或者葡萄糖基中的一种；R2是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一种；R3是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一种。
2.一种如权利要求2所述的化合物，其特征在于，其结构式为
3.一种如权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将苦马豆粉碎；(2)以浓度为30-100％的饱和脂肪醇回流或浸泡提取2-5次，每次1-24小时，然后回收醇，得到醇提取物；(3)将醇提取物溶于1-100倍的水，以等体积的有机溶剂萃取2-5次，得到有机溶剂提取物；所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或者正丁醇；(4)将上述有机溶剂提取物过色谱柱，洗脱后即得权利要求2所述化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所用饱和脂肪醇浓度为60-100％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，饱和脂肪醇为甲醇或乙醇。
6.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，(2)中回流提取次数为2-3次，提取时间为1-2小时/次。
7.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，(2)中浸泡提取次数为2-3次，提取时间为8-16小时/次。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，醇提取物溶于1-10倍量的水。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，用于萃取的有机溶剂为氯仿或者二氯甲烷。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，柱色谱填料为硅胶或氧化铝。
11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，样品量与填料的体积比范围为1∶1-1∶7。
12.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(4)中的洗脱剂为石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中任意两种混合或任意三种混合；两两混合的混合体积比例为100∶1-1∶1，三相溶剂的混合体积比例为100∶1∶1-4∶2∶1。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，(4)中的洗脱剂为氯仿-甲醇或者二氯甲烷-甲醇。
14.如权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的药物为片剂或者针剂。
16.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、脑瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌或者血癌。
全文摘要
本发明属于生物化学领域，涉及一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法。人们常常谈癌色变，这是因为癌症已日趋成为人类的第一位死因，但是到目前为止又缺乏特效药预防和治疗癌症或者肿瘤。本发明以蒙药苦马豆(Sphaerophysa salsula(Pall.)DC)为原料，经分离纯化即获得所述具有抗肿瘤活性的化合物。本发明的化合物制成抗肿瘤药剂，可以用于肝癌、脑瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌和血癌等。
文档编号A61P35/00GK1900105SQ200610029180
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者朱焕章, 马忠俊 申请人:复旦大学