负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物及其制法的制作方法

专利名称：负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及喜树碱类药物，更具体而言，是涉及负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物及其制备方法。
背景技术：
喜树碱(CPT)是一种从中国喜树中提取出来的一种具有细胞毒性的生物碱，它的作用对象为细胞的拓扑异构酶I(Top I)，通过阻止切开的DNA链的再结合，喜树碱可以有效的杀灭肿瘤细胞。尽管喜树碱和其很多衍生物在体外肿瘤模型实验中展现出明显的抗肿瘤效果，然而这类药物在水或者各种生物相容的有机溶剂中溶解度都极低，因此不尽人意的溶解性大大制约了它们的实际应用。为解决喜树碱类药物的溶解性问题，人们不得不使用药效低、毒副作用大的羟基喜树碱(HCPT)或CPT羧酸盐水溶液，或者通过化学改性得到溶解性改善的喜树碱类前药(prodrug)，如已经上市的伊立替康(Irinotecan，CPT-11，1994美国上市，用于治疗结直肠癌)和拓扑替康(Topotecan，1996美国上市，用于卵巢癌的治疗)等。但是前药能否在体内完全分解为有效成分在很大程度上影响了该药的效果，而且病人在药物代谢方面的个体差异也导致这些前药在用于各类病人时药效差别极大。在现有的一些解决非水溶性药物输送问题的技术中，使用高分子纳米药物载体在载药量，制剂的稳定性，生物相容性以及“被动靶向”效果等方面均体现出明显的优势(参见I.Brigger，C.Dubernet，P.Couvreur，Adv.Drug Del.Rev.，54，2002，631-651)。因此，开发一个负载喜树碱类药物的高性能纳米药物载体对于进一步充分发挥喜树碱类抗肿瘤药物药效具有重大意义。
过去的几年中，人们一直在努力寻找用于输送喜树碱药物的高性能药物载体。Ertl B和Shenderova A分别报道了通过传统的乳化挥发法制备以聚乙交丙交酯(PLGA)微球为载体的CPT和HCPT的药物输送体系(参见Ertl B，Platzer P，Wirth M，and et al.，J.Controlled Release 61，1999，305-317；A.Shenderova，T.Burke，S.Schwendeman，Pharm.Res.14，1997，1406-1414.)，由于CPT和HCPT在PLGA中的溶解度过低，因此在他们得到的微球载药量并不高，且负载的药物大部分以微晶的形式存在。这种载药体系主要目的是用于喜树碱或羟基喜树碱的缓释，同时利用高分子水解产生的微酸环境来稳定CPT的内酯环。由于微球的尺寸过大，这类体系无法做为静注剂型，因此其实际应用受到了限制。之后，Yang等人采用固体脂质体纳米粒子(Solid Lipid Nanoparticles，SLN，参见S.Yang，J.Zhu，Y.L，and et al.，Pharm.Res.16，1999，751-757；Yang S.，Lu L，Cai Y，and et al.，J.Controlled Release 59，1999，299-307)负载了CPT，并且分别考察了经静注和口服后，CPT在小鼠体内的分布情况。结果表明，CPT经过SLN负载后，血液中的半衰期得到了明显延长，组织中的药物浓度也有所提高，而且相比于原药，CPT-SLN对脑部有显著的靶向性。不过由于喜树碱类物质与脂质的亲和性较差，该体系的载药量也不高(＜5％)，此外制备过程中还需要加入表面活性剂poloxamer 188，为其生物安全性带来了隐患。为了提高喜树碱类药物的负载效率，Zhang等利用了7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)在碱性水溶液中溶解度大幅增加，而酸化后打开的内酯环又能够可逆地重新闭合这一特性，制备了高载药效率的SN-38脂质体制剂，并且取得了良好的体外和体内抗肿瘤效果(参见J.Zhang，T.Xuan，M.Parmar，and et al.，Intl.J.Pharm.270，2004，93-107)。但是，脂质体成本高，自身性质不够稳定，在体内容易降解和崩解，大量脂质物质在体内可能产生毒副作用，这些都成为制约喜树碱脂质体实际应用的因素。2004年，Okano等人以部分水解的聚天冬氨酸(PAsp)与聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物为材料，用高温乳化分散法制备了负载CPT的高分子胶束(参见P.Opanasopit，M.Yokoyama，M.Watanabe，and et al.，Pharm.Res.21，2004，2001-2008)。他们的结果显示，部分水解后的PAsp与CPT间相互作用得到了加强，能够获得令人满意的负载效果，载药量达到20％，载药效率最高可达70％。但是他们的研究中载体材料制备过程复杂，成本较高，负载过程在80℃高温的水中超声进行，有可能对药物和载体材料带来不利的影响。此外，聚氨基酸在体内应用时的抗原性也是值得重视的问题。
综上所述，尽管在非水溶性喜树碱药物负载与输送体系的研究中已经取得了一些振奋人心的成果，但由于喜树碱药物独特的溶解性，和各种载体材料的亲和性过低以及强烈的自聚集倾向，至今仍然无法采用常规的载体材料和工艺制备在载体尺寸，载药量，制备成本，稳定性及生物相容性等方面均令人非常满意的喜树碱载药体系。

发明内容
本发明的目的是针对喜树碱类药物的特点，提供可以用于注射，静脉滴注或者口服的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明充分利用了喜树碱类药物在碱性条件下开环形成水溶性很好的开环形式而在酸性条件下又能够可逆闭环这一殊性，以可生物降解高分子为主要载体材料，通过本发明公布的方法，制备具有较高载药量和高载药效率的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物。
本发明的技术方案如下一种负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，它是以可生物降解的高分子纳米微球为药物载体，负载至少一种喜树碱类的药物，所述的可生物降解的高分子可以是聚酯或聚酯与聚乙二醇形成的两亲嵌段共聚物。
上述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，所述的喜树碱类药物包括喜树碱、10-羟基喜树碱(HCPT)、9-氨基喜树碱(9-AC)、9-硝基喜树碱(9-NC)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)等。
上述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，所述的可生物降解的高分子，选自下列聚合物中的一种或多种混和聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乙交一丙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)或聚(丙交酯一己内酯)，或者上述可生物降解聚酯与聚乙二醇(PEG)形成的两亲嵌段共聚物。优选的可生物降解的高分子是上述可生物降解的聚酯与聚乙二醇(PEG)形成的两亲嵌段共聚物。
上述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，药物载体为颗粒状，其直径为60nm-800nm，负载于其中的喜树碱类药物的量占负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物总质量的1％-30％。
一种制备上述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，它基本上由下列步骤组成步骤1.将喜树碱类药物溶解于适量碱性水溶液中，得到水溶液W1，步骤2.将步骤1得到的W1分散于溶有适量稳定剂的有机溶液O1中，通过搅拌、超声或乳匀等手段得到乳液E1，所述的有机溶液O1可以是乙酸乙酯溶液或二氯甲烷溶液，所述的稳定剂为生物相容的两亲物质或可生物降解的两亲高分子。
步骤3.将步骤2得到的E1分散于含有盐酸或醋酸和适量上述的可生物降解高分子的有机溶液O2中，得到分散液E2，所述的有机溶液O2可以是丙酮或二氯甲烷溶液，步骤4.将步骤3得到的分散液E2与水或含有适量稳定剂的水溶液W2混和，通过搅拌、超声或乳匀等手段分散均匀，所述的水溶液W2中的稳定剂可以是Poloxamer 188或聚乙烯醇(PVA)，步骤5.将步骤4得到的分散液加热减压，除去有机溶剂，过滤、透析或离心除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物后，得到本发明的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的水分散液。
上述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，其中所述的溶有喜树碱类药物碱性水溶液W1中喜树碱类药物的浓度范围为5mg/mL-200mg/mL。
上述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，所述的有机溶液O1与溶有喜树碱类药物碱性水溶液W1的体积比为2∶1-10∶1。
上述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，所述的有机溶液O1中含有浓度为10mg/mL-200mg/mL的稳定剂，所述稳定剂为生物相容的两亲物质或可生物降解的两亲高分子，包括但不局限于含有羧基的聚己内酯(如DTPA-PCL-DTPA和Citric-PCL)，聚己内酯(PCL)或聚(丙交酯-己内酯)等聚酯与聚乙二醇(PEG)形成的两亲嵌段共聚物(如PCL-PEG-PCL，PCLLA-PEG-PCLLA等)。
上述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，所述的有机溶液O2与有机溶液O1的体积比为1∶1-100∶1，优选的是2∶1-10∶1。
上述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，有机溶液O2中，可生物降解高分子的浓度为0.1mg/mL-500mg/mL，优选的是2mg/mL-200mg/mL，有机溶液O2中含有酸的浓度为0.0001mol/L-0.1mol/L，所说的酸包括盐酸、醋酸等。
上述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，水溶液W2与有机溶液O2的体积比为1∶1-100∶1，优选2∶1-20∶1，水溶液W2为pH＜8、含有0-50％生物相容或可生物降解稳定剂的水溶液，所述稳定剂包括poloxamer系列乳化剂或PVA。
上述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，制得的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物以水分散液的方式储藏或使用，或者进一步经过冷冻干燥成为能够再次分散的冻干粉储藏或使用。
本发明的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物载药量可以达到30％以上，负载效率高于85％，稳定性好。在合适的制备条件下，得到的载药纳米微球尺寸小于300nm，且无须添加其它稳定剂，适合于静脉注射。通过本发明公布的方法制备的负载喜树碱类药物的高分子纳米微球具有明显的缓释特点(参见图3)，制备的负载于高分子纳米微球的羟基喜树碱类药物具有比羟基喜树碱自由药更强的体外抗肿瘤活性(参见表1)，而且体内抗肿瘤效果也得到了增强(参见表2)。
本发明的制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法简单易行，制备成本较低，通过改变制备中所用的高分子材料及其浓度、溶剂及用量、药物浓度等参数，可以实现对负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物载药纳米微球的载药量、尺寸等性质的调节，具有良好的可控性。


图1为羟基喜树碱载药纳米微球在水分散液中粒径随储存时间变化图。
图2为SN-38，空白微球和SN-38载药微球的红外图谱。
图3为羟基喜树碱载药纳米微球的体外释放曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但是这些实施例并不限制本发明的保护范围。
制备例1聚(丙交酯-己内酯)-聚乙二醇-聚(丙交酯-己内酯)两亲嵌段共聚物(PCLLA-PEG-PCLLA)的制备在装有适量聚乙二醇(PEG)的聚合管中加入计算量的己内酯(CL，美国Aldrich公司)和丙交酯(LA，美国Aldrich公司)以及0.1％(w/w)的辛酸亚锡，其中PEG的数均分子量根据对产物的要求不同，分别为6000或10000不等，但是并不仅限于以上几种分子量。在真空下封管并将其放入130℃反应48小时。反应得到的粗产物用氯仿溶解后沉淀于大量冷甲醇中以除去未反应的单体和其他低分子量的物质，然后将沉淀物收集用水洗涤数次后减压干燥，得到PCLLA-PEG-PCLLA三嵌段聚合物。对应PEG分子量为6000和10000，得到的聚合物分别命名为PCLLA-PEG6K-PCLLA和PCLLA-PEG10K-PCLLA。以上得到的共聚物数均分子量均为50000(通过核磁共振图谱计算)。
制备例2聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯两亲嵌段共聚物(PCL-PEG-PCL)的制备在装有适量聚乙二醇(PEG)的聚合管中加入计算量的己内酯(CL，美国Aldrich公司)以及0.1％(w/w)的辛酸亚锡，其中PEG的数均分子量根据对产物的要求不同，分别为2000，6000，10000不等，但是并不仅限于以上几种分子量。在真空下封管并将其放入130℃反应48小时。反应得到的粗产物用氯仿溶解后沉淀于大量冷甲醇中以除去未反应的单体和其他低分子量的物质，然后将沉淀物收集用水洗涤数次后减压干燥，得到PCL-PEG-PCL三嵌段聚合物。对应PEG分子量为2000，6000和10000，得到的聚合物分别命名为PCL-PEG2K-PCL，PCL-PEG6K-PCL和PCL-PEG10K-PCL。以上得到的共聚物数均分子量均为50000(通过核磁共振图谱计算)。
制备例3二乙撑三胺五乙酸-聚己内酯-二乙撑三胺五乙酸(DTPA-PCL-DTPA)的制备按照文献(CH Paik et al.，Journal of Nuclear Medicine，Vol 24，Issue 12 1158-1163)制备二乙撑三胺五乙酸(DTPA)双酸酐。制得的DTPA双酸酐经纯化干燥后置于干燥器中保存。在玻璃封管中加入计算量的乙二醇(美国Aldrich公司)，在辛酸亚锡催化下，通过开环聚合制备分子量为2000的α，ω-双羟基聚己内酯。在装在100mL三颈瓶上的滴液漏斗中加入一定量α，ω-双羟基聚己内酯的无水DMF溶液(30％)，向三颈瓶内加入过量的DTPA双酸酐和催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，用适量无水二甲基甲酰胺(DMF)在70℃下搅拌溶解，通氮气30min以除去体系中的氧气。待溶解完全后，将温度升至90℃，缓慢滴加α，ω-双羟基聚己内酯的DMF溶液，反应48h，得到的产物先沉淀于乙醚中，干燥后用乙酸乙酯溶解，过滤除去未反应的酸酐后，滤液沉淀于大量冷乙醚中，然后将沉淀物收集用热水洗涤数次后减压干燥，得到DTPA-PCL-DTPA(平均分子量为2800)。
制备例4端基为柠檬酸的聚己内酯(Citric-PCL)的制备将适量研磨并干燥过的苹果酸(美国Aldrich公司)，加入三颈瓶中，加入少量DMF搅拌溶解，再加入少量三乙胺助溶和催化剂二月桂酸二丁基锡。将计算量的己内酯加入滴液漏斗中。体系通氮气除氧，油浴加热至80℃后，以每秒一滴的速度加入己内酯，加完后反应6-8小时。反应后将生成物沉淀到水中(水中加入适量HCl)，反复2-3次，得到白色粉末，真空干燥48h，得到Citric-PCL聚合物，产物的数均分子量为1500。
实施例1负载于高分子纳米微球的喜树碱药物的制备先将30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到PCLLA-PEG10K-PCLLA的丙酮溶液O2。另将7mg HCPT溶解于100μLNaOH水溶液中(NaOH浓度为0.3mol/L)，得到亮黄色水溶液W1。与溶有20mgDTPA-PCL-DTPA的500μL乙酸乙酯溶液O1混合，用探头式超声仪(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1。将E1在搅拌下加入O2，体系逐渐成为散射淡蓝色光的分散液E2。将E2与20mL水W2(用HCl调至pH＝5)混和，得到散射淡蓝色光的载药纳米粒子分散液，减压除去有机溶剂，用600nm滤膜过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物后，得到载药纳米粒子的水分散液。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为256nm。通过紫外分光光度计测得该药物载体的载药量为10.4％，载药效率高于85％。以下实施例中如无特别说明，则对载药微球的基本性质表征与此实施例中相同。稳定性实验结果表明微球在水分散液中非常稳定，参见图1。
实施例2负载于高分子纳米微球的喜树碱药物的制备将30mg PCL-PEG10K-PCL溶解于10mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到O2。其余过程同实施例1。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为162nm。该药物载体的载药量为9.8％，载药效率高于85％。
实施例3负载于高分子纳米微球的HCPT药物的制备先将30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于2mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到O2。其余过程同实施例1。用滤纸过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物后，得到载药纳米粒子的水分散液。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为495nm。通过紫外分光光度计测得该药物载体的载药量为11.6％。
实施例4负载于高分子纳米微球的HCPT药物的制备先将30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到O2。另将10mg HCPT溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到W1，其余过程同实施例1。得到的载药纳米微球载药量为15.0％，负载效率为90％，平均粒径为261nm。
实施例5负载于高分子纳米微球的HCPT药物的制备先将30mg聚己内酯(PCL，平均分子量50000，Sigma公司)溶解于15mL含有10μL 0.15mol/L HCL的丙酮中得到O2。另将0.5mg HCPT溶解于100μL 0.03mol/L的NaOH水溶液中，得到的亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg Citric-PCL的1mL二氯甲烷溶液O1混合，用探头式超声仪(microsonix XL-200)将上述混合液分散至均相后得到E1，在搅拌下将E1加入O2，体系逐渐成为散射淡蓝色光的分散液即E2。将E2与60mL 5％Poloxamer 188水溶液W2(用HCl调至pH＝5)混和，得到散射淡蓝色光的载药纳米粒子分散液，减压除去有机溶剂，用600nm滤膜过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物后，得到载药纳米粒子的水分散液。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为63nm。通过紫外分光光度计测得该药物载体的载药量为1％，载药效率高于85％。
实施例6负载于高分子纳米微球的SN-38药物的制备先将30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到O2。另将7mg SN-38溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到的亮黄色水溶液W1。将10mg DTPA-PCL-DTPA溶解于1mL乙酸乙酯溶液混合得到O1，将W1和O1混合并用探头式超声仪(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1，在搅拌下将E1加入O2，体系逐渐成为散射淡蓝色光的分散液E2。将E2与60mL水W2(用HCl调至pH＝5)混和，得到散射淡蓝色光的载药纳米粒子分散液，减压除去有机溶剂，用600nm滤膜过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物后，得到载药纳米粒子的水分散液。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为215nm。通过紫外分光光度计测得该药物载体的载药量为14.6％，载药效率92％。从图2显示的红外图谱可以看出，负载后没有新的吸收峰出现。
实施例7负载于高分子纳米微球的喜树碱药物的制备先将30mg PCLLA-PEG6K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到O2。另将5mg CPT溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中得到W1，其余操作同实施例1。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为228nm。通过紫外分光光度计测得该药物载体的载药量为8.1％，载药效率89％。
实施例8负载于高分子纳米微球的喜树碱药物的制备先将30mg PCL(分子量50000，Sigma公司)溶解于1mL含有10μL 1.0mol/L HCl的乙酸乙酯中得到O2。另将5mg喜树碱溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到的黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg PCL-PEG6K-PCL的500μL二氯甲烷溶液O1混合，用探头式超声仪(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1，在搅拌下将E1加入O2，体系逐渐成为散射淡蓝色光的分散液E2。将E2与20mL 5％PVA水溶液W2(用HCl调至pH＝5)混和，并且通过乳匀分散均匀，减压除去有机溶剂，用600nm滤膜过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物后，得到载药纳米粒子的水分散液。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为515nm。通过紫外分光光度计测得该药物载体的载药量为8.0％，载药效率88.7％。
实施例9负载于高分子纳米微球的羟基喜树碱药物的制备先将30mg PCLLA-PEG10K-PCLLA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCL的丙酮中得到PCLLA-PEG10K-PCLLA的丙酮溶液O2。另将7mg HCPT溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg DTPA-PCL-DTPA的200μL三氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。其余操作同实施例1。该药物载体的载药量为11.6％，载药效率高于90％。平均粒径为266nm。
实施例10负载于高分子纳米微球的羟基喜树碱药物的制备先将30mg PLGA(50∶50，数均分子量40000，Sigma公司，下同)溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L醋酸的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另将7mg HCPT溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mgDTPA-PCL-DTPA的500μL乙酸乙酯溶液O1混合，分散至均相后得到E1。除了W2是2％的PVA水溶液20mL外，其余制备条件同实施例1。该药物载体的载药量为9.7％，载药效率高于85％。平均粒径为324nm。
实施例11负载于高分子纳米微球的SN-38药物的制备先将30mg PLGA溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另将15mg SN-38溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg PCL-PEG10K-PCL的200μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2为1％的polaxomer 188水溶液400mL，其余操作同实施例1。该药物载体的载药量为20.6％，载药效率高于85％。平均粒径为379nm。
实施例12负载于高分子纳米微球的SN-38药物的制备先将30mg PCL(分子量50000，Sigma公司，下同)溶解于5mL含有10μL 1.0mol/LHCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另将15mg SN-38溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg PCL-PEG10K-PCL的200μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2为1％的PVA水溶液10mL，其余操作同实施例1。该药物载体的载药量为21.2％，载药效率高于87％。平均粒径为405nm。
实施例13负载于高分子纳米微球的SN-38药物的制备先将30mg PLA(分子量20000，Sigma公司)溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另将7mg SN-38溶解于100μL 0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg PCL-PEG10K-PCL的100μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2为1％的polaxomer 188水溶液500mL，其余操作同实施例1。该药物载体的载药量为11.0％，载药效率高于85％。平均粒径为395nm。
实施例14负载于高分子纳米微球的喜树碱药物的制备先将30mg PCL溶解于5mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另将15mg CPT溶解于100μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg DTPA-PCL-DTPA的200μL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2为1％的PVA水溶液400mL，其余操作同实施例1。该药物载体的载药量为21.0％，载药效率高于85％，平均粒径为377nm。
实施例15负载于高分子纳米微球的喜树碱药物的制备先将50mg PLGA溶解于1mL含有10μL 1.0mol/L HCl的丙酮中得到PLGA的丙酮溶液O2。另将30mg CPT溶解于200μL0.3mol/L的NaOH水溶液中，得到亮黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg DTPA-PCL-DTPA的2mL二氯甲烷溶液O1混合，分散至均相后得到E1。采用的W2为0.01％的PVA水溶液400mL，将E1在高速搅拌下与W2混和均匀，所用滤膜孔径为3μm，其余操作同实施例1。该药物载体的载药量为29.7％，载药效率高于85％。平均粒径为839nm。
实施例16负载于高分子纳米微球的喜树碱药物制备先将30mg PLGA溶解于1mL含有1.0×10-5mol/L醋酸的二氯甲烷中得到O2。另将20mg喜树碱溶解于100μL 0.5mol/L的NaOH水溶液中，得到的黄色水溶液W1。将W1与溶有20mg PCL-PEG2K-PCL的500μL二氯甲烷溶液O1混合，用探头式超声仪(microsonix XL-200)分散至均相后得到E1，在搅拌下将E1加入O2，体系逐渐成为散射淡蓝色光的分散液E2。将E2与20mL 5％PVA水溶液W2(用HCl调至pH＝5)混和，并且通过乳匀分散均匀，减压除去有机溶剂，用600nm滤膜过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物后，得到载药纳米粒子的水分散液。通过动态光散射技术测得微球的平均粒径为575nm。载药量为9.0％，载药效率高于90％。
实施例17负载于高分子纳米微球的9-氨基喜树碱药物的制备除所用药物为9-AC外，其余步骤同实施例1。得到的微球的平均粒径为275nm，载药量为8.7％，载药效率高于85％。
实施例18负载于高分子纳米微球的9-AC药物的制备除所用药物为9-AC外，其余步骤同实施例3。得到的微球的平均粒径为512nm，载药量为10.9％，载药效率高于85％。
实施例19负载于高分子纳米微球的9-硝基喜树碱(9-NC)药物的制备除所用药物为9-NC外，其余步骤同实施例1。得到的纳米粒子直径为233nm，载药量为10.2％，载药效率高于90％。
实施例20负载于高分子纳米微球的9-NC药物的制备除所用药物为9-NC外，其余步骤同实施例3。得到的微球的平均粒径为488nm，载药量为11.0％，载药效率高于90％。
实施例21负载于高分子纳米微球的羟基喜树碱药物的冻干粉剂制备按照实施例1中所述操作制备纳米微球的水分散液，在该分散液中加入200mg葡萄糖，在Freezone 6冻干机上冷冻干燥48小时，得到浅黄色的疏松冻干粉。用蒸馏水再分散后，得到的纳米微球尺寸为276nm，适合于静脉注射。
实施例22负载于高分子纳米微球的羟基喜树碱药物的体外释放将实施例1中制备的纳米微球分散液稀释至相当于HCPT浓度100μg/mL，取稀释液2mL放置于透析袋中于400mL水中透析，在预定时间取4mL释放介质，通过HPLC测定其中的羟基喜树碱浓度，得到HCPT载药纳米微球的体外释放曲线。从图3可以看到负载于其中的药物表现出持续稳定的释放特性。
实施例23负载于高分子纳米微球的羟基喜树碱药物的抗肿瘤效果测试1.细胞株为人胃癌细胞BGC-823。通过MTT法测定了实施例1中制备的纳米微球对BGC-823细胞的体外杀伤效果(如表1所示)。从表1可以看到制备的HCPT载药纳米微球对BGC-823细胞具有较强的体外杀伤力。
2.选用18-22克雌性ICR小鼠及生长良好的7-11天的Sarcoma 180瘤种，将瘤种接种于小鼠右侧腋部皮下，约4.5-5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，每组5只。分别按照2mg/kg，4mg/kg和8mg/kg的HCPT剂量给小鼠尾静脉注射负载HCPT的纳米粒子，另外药物对照组按照8mg/kg给药，空白载体对照组按照纳米粒子质量浓度80mg/kg的剂量静注，阴性对照组注射生理盐水。给药时间为接种后的第二天和第五天。第8天处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重以及肿瘤抑制率并进行T检验，结果如表2所示。
可以看出，采用本专利公布的方法，可以将溶解性很差的喜树碱类药物已其有效的闭环形式负载于生物相容的高分子纳米微球中，由此得到的药物能够利用药物载体的被动靶向特性以及缓释特性，在较低的药物用量下便可以获得比自由药物更好的抗肿瘤效果。本发明所述的负载于高分子纳米微球的其它喜树碱类药物，如SN-38或CPT等也具有类似的良好的抗肿瘤效果。
表1.HCPT载药纳米微球对人胃癌BGC-823体外细胞毒性实验结果。

a空白载体的浓度与负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物组的浓度相对应，考虑到载药量为10％，故载体组的浓度分别为10，20，40μg/mL。
具体实施例方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例1取健康活蛇(蝮蛇、乌梢蛇)，抛去内脏，用清水清洗后。剥离脂肪，在120℃的高温条件压轧蛇油，提纯净化(利用净化器，反复滤去沉淀物)在50％的蛇油中加入含有维生素A1为4.28g/100g的维生素片剂3.5％、含有维生素E为10g/100g的维生素片剂6％、含有维生素C为24g/100g的维生素2.5％营养成分，含有微量元素Na为52.6mg/100g、微量元素Zn为105.2mg/100g、微量元素Fe为24.3mg/100g的片剂38％，搅拌混匀后，生化灭菌(常规方法甲醛消毒或者核辐射)，通过生化检验(测各成份的配置数量)制成软胶囊，灌装以后，在紫外线的照射下辐射灭菌外包装打印日期、出厂。
权利要求
1.一种负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，其特征是它是以可生物降解的高分子纳米微球为药物载体，负载至少一种喜树碱类的药物，所述的可生物降解的高分子可以是聚酯或聚酯与聚乙二醇形成的两亲嵌段共聚物。
2.根据权利要求1所述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，其特征是所述的喜树碱类药物是喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、拓扑替康或伊立替康。
3.根据权利要求1所述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，其特征是所述的可生物降解的高分子，选自下列聚合物中的一种或多种混和聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乙交-丙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)或聚(丙交酯-己内酯)，或者上述可生物降解聚酯与聚乙二醇(PEG)形成的两亲嵌段共聚物。
4.根据权利要求1所述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，其特征是药物载体为颗粒状，其直径为60nm-800nm，负载于其中的喜树碱类药物占负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物总质量的1％-30％。
5.一种制备权利要求1所述的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，其特征是它基本上由下列步骤组成步骤1.将喜树碱类药物溶解于碱性水溶液中，得到水溶液W1，步骤2.将步骤1得到的水溶液W1分散于溶有稳定剂的有机溶液O1中，通过搅拌、超声或乳匀手段得到乳液E1，所述的有机溶液O1是乙酸乙酯溶液或二氯甲烷溶液，所述的稳定剂是生物相容的两亲物质或可生物降解的两亲高分子，步骤3.将步骤2得到的乳液E1分散于含有盐酸或醋酸和上述的可生物降解高分子的有机溶液O2中，得到分散液E2，所述的有机溶液O2是丙酮或二氯甲烷溶液，步骤4.将步骤3得到的分散液E2与水或含有稳定剂的水溶液W2混和，通过搅拌、超声或乳匀等手段分散均匀，所述的水溶液W2中的稳定剂是Poloxamer 188或聚乙烯醇，步骤5.将步骤4得到的分散液加热减压，除去有机溶剂，然后过滤、透析或离心除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物，得到负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的水分散液。
6.根据权利要求5所述的制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，其特征是步骤1所述的溶有喜树碱类药物碱性水溶液W1中喜树碱类药物的浓度范围为5mg/mL-200mg/mL。
7.根据权利要求5所述的制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，其特征是所述的有机溶液O1与溶有喜树碱类药物碱性水溶液W1的体积比为2∶1-10∶1，所述的有机溶液O1中含有浓度为10mg/mL-200mg/mL的稳定剂。
8.根据权利要求5所述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，其特征是所述的有机溶液O2与有机溶液O1的体积比为1∶1-100∶1，有机溶液O2中，可生物降解高分子的浓度为0.1mg/mL-500mg/mL，有机溶液O2中含有酸的浓度为0.0001mol/L-0.1mol/L。
9.根据权利要求5所述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，其特征是所述的水溶液W2与有机溶液O2的体积比为1∶1-100∶1，水溶液W2为pH＜8、含有0-50％生物相容或可生物降解稳定剂的水溶液，所述稳定剂包括poloxamer系列乳化剂或聚乙烯醇。
10.根据权利要求5所述制备负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物的方法，其特征是制得的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物以水分散液的方式储藏或使用，或者进一步经过冷冻干燥成为能够再次分散的冻干粉储藏或使用。
全文摘要
一种负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，它是以可生物降解的高分子纳米微球为药物载体，负载至少一种喜树碱类的药物，所述的可生物降解的高分子可以是聚酯或聚酯与聚乙二醇形成的两亲嵌段共聚物。本发明的负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物，药物载体为颗粒状，其直径为60nm－800nm，负载于其中的喜树碱类药物占负载于高分子纳米微球的喜树碱类药物总质量的质量百分比可高达30％。可用于静注。本发明公开了其制法。
文档编号A61P35/00GK1861192SQ200610038798
公开日2006年11月15日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者蒋锡群, 张乐洋, 杨昌正 申请人:南京大学