专利名称：低聚糖在制备超急性排斥反应药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属糖化合物，涉及低聚糖的用途，主要涉及水苏糖和毛蕊糖在医药领域的应用。
背景技术：
器官移植术后的排斥反应分为超急性、急性和慢性三类。超急性排斥反应从免疫学上来说是由于移植器官细胞膜上的抗原和受者的循环抗体之间发生识别和结合所致。因为这些抗体都是预先存在于受体内，所以，超急性排斥反应在移植术后便迅速发生，一般在术后几分钟或几小时内即出现。由于人体器官的短缺，利用猪的器官代替人体器官是目前研究的热点。但由于猪的细胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal(半乳糖-α-1，3-半乳糖)结构能与人体内预存的天然抗体结合产生超急性排斥反应而无法应用到临床。针对此问题，目前，国内外主要有以下几种方法第一种方法是转基因猪，主要是通过把猪身上表达此抗原的基因除去，从而使生产出来的猪不带有此抗原(例如日本已克隆出8只次类小猪)，一旦得到了转基因猪，通过常规的繁殖传代就可以得到大量的转基因猪，理论上应该说这是一种非常理想的解决途径，但是目前还因为一些问题而无法应用到临床。总的来说克隆和转基因还不是一种完全成熟的技术，许多通过此途径生产出的动物都存在着或多或少的生理上的不正常，容易夭折。其次，还要考虑由于转基因动物的某些未知的基因变异而对受移植者带来损害的可能性。第二种方法是通过对免疫抑制剂的开发和改良来解决问题，这是一种常规的思路。目前的免疫抑制剂有环孢素A、糖皮质激素、硫唑嘌呤、抗淋巴细胞球蛋白、环磷酰胺等，但遗憾的是不能解决超急性排斥反应问题，并且有各种各样的副作用，比如常见的就有骨髓抑制、肝肾毒性、上消化道出血、脱发等等。虽然有报道某些研发机构在进行新的免疫抑制剂的开发，但前景不明。
水苏糖是天然存在的一种四糖，分子式为C24H42O21，相对分子质量为666.59，简单的结构表示式为果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖。同样，毛蕊糖也是天然存在的五糖，分子式为C30H52O26，相对分子质量为828.7，简单的结构表示式为果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖，两者均属于低聚半乳糖，无毒，可直接食用，属易溶类物质。目前国内制备工艺成熟，商业上主要作为促进肠道双歧杆菌增殖的功能性低聚糖。
发明内容
本发明的目的是提供低聚糖在制备抗猪→人异种器官移植引起的超急性排斥反应药物中的应用，所说的低聚糖主要选用水苏糖或毛蕊糖，所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体，所说的水苏糖具有以下分子结构图 所说的毛蕊糖具有以下分子结构图 所制备的药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、片剂或胶丸。所制备药物的给药方式包括口服给药或注射给药。
由于人体内预存的天然抗体与猪细胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal的结合是产生超急性排斥反应的主要原因(David L，Kooyman，Steven B，et al.Identificationand characterization of a galactosyl peptide mimetic[J].Transplantation，1996，61(6)851-855)，为了解决这一难题，我们希望能开发出一种可以模拟Gal-α-1，3-Gal结构的小分子化合物。目前已知蜜二糖由于有α-Gal的空间结构，从而具有与人体内预存的天然抗体结合的能力，但它对人的肝肾有毒性，限制了它在这一方面的进一步开发和利用。本发明研究发现水苏糖和毛蕊糖也具有α-Gal的空间结构，通过抑制GS-I-B4(西非单叶豆凝集素，它能与Gal-α-1，3-Gal特异性结合)与猪红细胞凝集试验(实施例图1)和抑制人血清与猪红细胞凝集试验(实施例图2)，说明这两种糖也能预先与人血清中预存的抗Gal-α-1，3-Gal抗体或GS-I-B4特异性结合并使其失活，从而可以抑制超急性排异反应的发生，同时，这两种糖无毒，可直接食用，属易溶类物质，有望开发成抗猪器官异种移植超急性排斥反应的新药。
本发明的优点是(1)两个低聚糖的序列结构清楚，并且生产技术完全成熟(已经商品化)，此糖化合物能在工业上大量合成或自然界提取，从制备的成本上远远低于转基因方法，故可以大量合成满足市场需求。(2)两个低聚糖与人体内预存的天然抗体的结合位点是特异性的，正好是我们要求它结合上去起到封闭人类天然抗体作用的位点。从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。(3)这两种低聚糖无毒，可直接食用，属易溶类物质。(4)由于均为低聚糖，分子量较小，开发成药物后容易被机体利用而起效。
本发明选用小分子化合物低聚糖，使它能预先与人体内预存的抗体结合，从而使抗体不能与猪细胞表面的抗原结合而引起超急性排斥反应；在控制超急性排斥反应的基础上，采用相应的对策，诱导免疫耐受，使得动物组织在人体中存活。与第一种转基因方法相比，本发明选用的此糖化合物能在工业上大量合成或自然界提取，从制备的成本上远远低于转基因方法；并且糖化合物本身就是作用于抗体，针对性强。同时没有由于基因变异而对受移植者带来损害的顾虑。与第二种方法相比，在理论上本发明不仅能抑制超急性排斥反应的发生，也不会存在上述的骨髓抑制、肝肾毒性、上消化道出血等等严重副作用；同时，也不会降低人体整体的免疫功能。
图1为蜜二糖，水苏糖和毛蕊糖抑制GS-I-B4凝集猪红细胞的反应结果图。
图2为蜜二糖和水苏糖抑制人血清凝集猪红细胞结果图。
具体实施例方式
本发明结合以下实施例及附图作进一步说明。
实施例1蜜二糖，水苏糖，毛蕊糖能抑制GS-I-B4引起的猪红细胞凝集反应试验方法先把制备好的新鲜2％猪红细胞悬浮在PH＝7.4的磷酸缓冲液中备用。在V型血凝板的孔里，先加入40μl用磷酸缓冲液依次逐孔倍比稀释后的糖溶液，然后依次每孔分别加入40μl的GS-I-B4(0.042mM)和40μl 2％的猪红细胞。然后把此120μl混合液在室温下先用震荡器震荡1分钟，再静置1小时后观察凝集结果。如果红细胞沉淀到孔的底部，呈一边缘光滑的圆点，则此为没有凝集。如果红细胞形成一网络，并不下沉到孔底呈一边缘光滑的圆点，此为出现凝集。试验必须设空白、阳性对照。
试验结果参见图1，其中A1-A3孔是猪红细胞用PBS稀释的结果，为空白对照可以看出，没有出现凝集；A4-A9孔是GS-I-B4和猪红细胞混合后的结果，为阳性对照，出现凝集；B1-B9、C1-C9孔为蜜二糖抑制GS-I-B4引起的猪红细胞凝集(两条为重复实验，蜜二糖浓度从12mM开始，1-9孔倍比稀释)；D1-D9、E1-E9孔为水苏糖抑制GS-I-B4引起的猪红细胞凝集(两条为重复实验，水苏糖浓度从12mM开始，1-9孔倍比稀释)；F1-F9、G1-G9孔为毛蕊糖抑制GS-I-B4引起的猪红细胞凝集(两条为重复实验，毛蕊糖浓度从12mM开始，1-9孔倍比稀释)。
参见图1三个糖均在低至12/26mM浓度(倍比稀释第7孔)的时候就能抑制GS-I-B4引起的猪红细胞凝集。说明它们预先均能与GS-I-B4结合，使它失活。这样GS-I-B4就不能再与猪红细胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原结合，从而使猪红细胞凝集起来。
本实验用形象而直接的方式说明了低聚糖与GS-I-B4的结合位点是特异性的，正好是我们要求它结合上去起到封闭GS-I-B4作用的位点(即是α-Gal结构位点)，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
实施例2蜜二糖和水苏糖能抑制人血清凝集猪红细胞的反应试验方法先把制备好的新鲜2％猪红细胞悬浮在PH＝7.4的磷酸缓冲液中备用。在V型血凝板的孔里，先加入40μl用磷酸缓冲液依次逐孔倍比稀释后的糖溶液，然后每孔分别加入40μl适当稀释的A型血人血清和40μl 2％的猪红细胞。然后把此120μl混合液在室温下先用震荡器震荡1分钟，再静置1小时后观察凝集结果。同实施例1，如果红细胞沉淀到孔的底部，呈一边缘光滑的圆点，则此为没有凝集。如果红细胞形成一网络，并不下沉到孔底呈一边缘光滑的圆点，此为出现凝集。试验必须设空白、阳性对照。
试验结果在图2中，A1-A3孔是猪红细胞用PBS稀释的结果，为空白对照，可以看出，没有出现凝集；A4-A9孔是GS-I-B4和猪红细胞混合后的结果，为阳性对照，出现凝集；B1-B12、C1-C12孔为蜜二糖抑制人血清引起的猪红细胞凝集(两条为重复实验，蜜二糖浓度从1mg/ml开始，1-9孔倍比稀释)；D1-D12、E1-E12孔为水苏糖抑制人血清引起的猪红细胞凝集(两条为重复实验，水苏糖浓度从1mg/ml开始，1-9孔倍比稀释)。
从图2中可以看出，蜜二糖，水苏糖分别在低至0.125mg/ml和0.5mg/ml浓度的时候就能抑制A型血人血清引起的猪红细胞凝集。说明它们预先均能与A型血人血清特异性结合，使它失活。这样A型血人血清就不能再与猪红细胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原结合，从而使猪红细胞凝集起来。
本实验用形象而直接的方式说明了低聚糖与人体内预存抗体的结合位点是特异性的，正好是我们要求它结合上去起到封闭抗体作用的位点(即是α-Gal结构位点)。从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
权利要求
1.一种低聚糖在制备超急性排斥反应药物中的应用，其特征是在制备抗猪→人异种器官移植引起的超急性排斥反应药物中的应用，所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体，所述低聚糖选用水苏糖或毛蕊糖，水苏糖具有以下分子结构 毛蕊糖具有以下分子结构
2.根据权利要求1所述的低聚糖在制备超急性排斥反应药物中的应用，其特征是所述药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、片剂或胶丸。
3.根据权利要求2所述的低聚糖在制备超急性排斥反应药物中的应用，其特征是所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。
全文摘要
本发明提供一种低聚糖在制备抗猪→人异种器官移植引起的超急性排斥反应药物中的应用，所述低聚糖选用水苏糖或毛蕊糖，所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。本发明选用小分子化合物低聚糖，使它能预先与人体内预存的天然抗体结合，从而使天然抗体不能与猪细胞表面的抗原结合而引起超急性排斥反应。本发明选用的低聚糖能在工业上大量合成或自然界提取，制备成本低；并且该低聚糖本身就是作用于抗体，针对性强；同时克服由于基因变异而对受移植者带来损害的顾虑，不仅能抑制超急性排斥反应的发生，也不会存在骨髓抑制、肝肾毒性、上消化道出血等严重副作用，也不会降低人体整体的免疫功能，开发成药物后容易被机体利用而起效。
文档编号A61K9/16GK1879636SQ20061005068
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者詹金彪, 张晖, 许林海, 严志焜 申请人:浙江大学